CC BY
41
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ... Б7
УДК 615.837.3-7:599.323.4 ВМ. Бухман1, И.Б. Меркулова1, Н.П. Ермакова1, О.И. Коняева1, Е.Л. Членова1, НЮ. Кульбачевская1,
Т.В. Абрамова1, АА. Сергеев1, Ю.Е. Чикунова1, А.Л. Николаев2, Л.М. Михайлова\
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НА КРЫСАХ ЛОКАЛЬНОГО УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ СРЕДНЕЙ ИНТЕНСИВНОСТИ, ГЕНЕРИРУЕМОГО УСТАНОВКОЙ «УСДТ» гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Контактная информация
Бухман Владимир Михайлович, д-р мед. наук, профессор, заведующий лабораторией фармакологии и токсикологии НИИ ЭДиТО
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел.: +7(495)324-22-44; e-mail: bukhman@mail.ru
Статья поступила 28.12.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
В опытах на взрослых неинбредных крысах-самцах оценена потенциальная безопасность для пациентов и персонала ультразвукового воздействия, осуществляемого с помощью нового отечественного устройства для проведения сонодинамической терапии «УСДТ». Проводили 10-минутное озвучивание участка хвоста крыс (площадь 0,9 мм , 3-5 см от основания) с двух датчиков, генерирующих УЗ частотой 0,7 и 2,64 Мгц с интенсивностью от 3 до 6 Вт/см2. Использовали однократный сканирующий, трехкратный сканирующий и однократный направленный режим облучения в дозах от 13,5 до 81,0 КДж. Не выявлено влияния на организм животных группы «персонал». В отношении крыс группы «пациенты» не выявлено побочных эффектов при использовании терапевтического сканирующего режима с интенсивностью 3 Вт/см2. Общетоксические явления не наблюдались ни в одном режиме. При использовании интенсивности >3 Вт/см2 в сканирующем режиме и во всем интервале доз в направленном режиме развивалась локальная токсичность. Результаты проведенных опытов свидетельствуют о безопасности клинического применения устройства «УСДТ» для пациентов и персонала при использовании терапевтического сканирующего режима.
Ключевые слова: терапевтический ультразвук, аппарат для проведения сонодинамической терапии «УСДТ», доклиническая оценка безопасности, крысы.
V.M. Bukhman1 I.E. Merkulova1, N.P. Ermakova1, O.I. Konyaeva1, E.L. Chlenova1, N.Yu. Kulbahevskaya1, T.V. Abramova1, A.A. Sergeev1, Yu.E. Chikunova1, A.L. Nikolaev2, L.M. Mikhaylova]
TOXICOLOGICAL ESTIMATION ON RATS
OF LOCAL ULTRASONIC INFLUENCE OF THE AVERAGE INTENSITY GENERATED BY THE EQUIPMENT «USDT»
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2M.V. Lomonosovr Moscow State University
Abstract
Potential safety for patients and the personnel of the ultrasonic influence which is carried out by means of the new domestic device for carrying out sonodynamic therapy “USDT” is estimated in experiments on males adult outbred rats. The site of a rat’s tail (the area 0,9 мм2, 3-5 cm from the tail basis) was exposed to ultrasound generating from two transducers by frequency of 0.7 and 2.64 MHz with intensity from 3 to 6 W/cm2 for 10 minutes. The unitary scanning, triple scanning and unitary directed regimens of an irradiation in doses from 13.5 to 81.0 kJ were used. We have not observed influences on an organism of animals of group "personnel". Concerning rats of group "patients" it is not taped side effects when we used therapeutic regimen of 3 W/cm2 regimen. The all-toxic actions were not observed in used regimens. Local toxicity developed at intensity >3 W/cm2 in scanning regimen and in all interval of doses at unitary directed regimen. The data obtained indicate that the application of device “USDT” is safety for patients and the personnel when used at a therapeutic scanning regimen.
Key words: therapeutic ultrasonic, “USDT” device, preclinical study, rats.
Введение
В настоящее время интенсивно разрабатывается возможность терапевтического использования УЗ в терапии онкологических пациентов. Возможность сфокусировать ультразвуковое облучение локально в солидном опухолевом узле позволяет достичь хорошего результата у многих пациентов. Предполагается, что развитие сонодинамической терапии приведет к повышению частоты полного выздоровления онкологических пациентов в ранних стадиях развития солидных опухолей с 80 до 100 % [4].
Сонодинамическая терапия является новым бурно развивающимся неинвазивным мультимодальным методом лечения онкологических пациентов с локальными новообразованиями, расположенными на различной глубине от поверхности кожи. В основу сонодинамической терапии положено синергичное действии УЗ и соносенсибилизирующих соединений.
В связи с этим имеется необходимость, с одной стороны, в усовершенствовании терапевтических УЗ-аппаратов, с другой - в разработке новых адекватных соносенсибилизаторов.
58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ...
В этой работе мы сообщаем о результатах доклинического изучения потенциальной безопасности клинического применения нового разрешенного к производству, продаже и применению на территории РФ отечественного аппарата для соно-динамической терапии «УСДТ» [3].
Материалы и методы
Лабораторные животные
Использовали 300 здоровых половозрелых не-инбредных крыс-самцов разводки питомника РОНЦ. Содержание животных и опыты на них проводились в соответствии с международными правилами. Животных содержали в специальных клетках по 5 особей при температуре воздуха 20-23 °С и относительной влажности 65 % в условиях искусственного освещения и принудительной вентиляции на подстилке из древесных стружек, стерилизованных в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовали стандартный промышленный сертифицированный корм с установленным сроком годности. Сырую питьевую воду, помещенную в закрытые поилки, крысы получали в неограниченном количестве.
Подопытных крыс делили на 3 группы:
1) «пациенты» - облучаются локально (центральный участок хвоста) в определенном режиме;
2) «персонал» - крысы находятся рядом с прибором 2 ч (во время облучения «пациентов»);
3) «контроль» - крысы находятся в другом помещении.
Прибор
Установка «УСДТ» представляет собой терапевтический ультразвуковой аппарат настольного типа. При необходимости он может быть установлен на передвижную роликовую платформу для удобства перемещения во внутрибольничных помещениях.
Терапевтическая эффективность установки обеспечивается сочетанным действием акустических колебаний двух частот (0,7 и 2,64 МГц). Акустическое поле в очаге поражения формируется сложением акустических полей отдельных облучателей, зафиксированных в матрице.
В сканирующим режиме воздействия равномерность суммарного акустического поля обеспечивается системой плоских облучателей, параллельно расположенных в матрице, или изменением угла взаимной ориентации облучателей.
УЗ воздействие
Крыс первой группы помещали в специальное фиксирующее устройство «домик», а УЗ воздействию подвергался только хвост животного, который опускали в ванну с водой.
У2 З был сфокусирован на участке площадью
0,9 мм2 на расстоянии 3-5 см от основания хвоста. Во всех исследованиях использовали подводный метод УЗ, контактная среда - вода при температуре 34,5-35,0 °С., время УЗ во всех исследованиях 10 мин. Изученные режимы УЗ представлены в табл.
Режимы УЗ при изучении безопасности аппарата «УСДТ
Таблица
Группы Частота поля НИ1 ЭИ2 РВ3 Т4 Доза5
1 1 2
Мгц Вт/см2 мин КДж
«пациент» 0,7 2,64 3,0 1,5 СО6 10 13,5
0,7 2,64 4,5 2,25 СО 10 20,25
0,7 2,64 6,0 3,0 СО 10 27,0
0,7 2,64 3,0 3,0 НО' 10 27,0
- 2,64 4,5 4,5 НО 10 40,5
0,7 2,64 6,0 6,0 НО 10 54,0
- - 3,0 1,5 СТ8 10х3 40,5
- - 6,0 3,0 СТ 10х3 81,0
«персонал» - - - - О9 120 -
‘НИ - номинальная интенсивность. 2ЭИ - эффективная интенсивность. 3РВ - режим воздействия. 4Т - время воздействия. 5 Доза УЗ рассчитывается по формуле: Доза = ЭИ х площадь воздействия х Т. 6СО - сканирующий режим однократно. 7НО - направленный режим однократно. 8СТ - сканирующий режим трехкратно. 9О - однократно.
»
Оценка состояния животных Проводилась в соответствии с методическими рекомендациям [2] и Административным регламентом изучения новой медицинской техники [1]. С помощью общепринятых функциональных и морфологических методик изучали локальную токсичность и общетоксическое действие. Исследования проводили на -1; 0; 1; 2; 7; 15 и 30 сутки после окончания воздействия. Следили за общим состоянием животных, количеством съеденного корма и выпитой воды, поведенческими реакциями. Последние включали тесты влияния на ЦНС. Степень возбудимости животных оценивали по уровню двигательной активности, агрессивности и писку животных («вокализация»). Нервно-мышечную возбудимость оценивали по наличию спонтанного тремора, судорог и изменения мы-
шечного тонуса. Для выявления вестибулярных расстройств оценивали рефлексы «позы», «походки» (атаксия и другие нарушения). Вегетативные нарушения оценивали по величине зрачка (миоз, мидриаз), наличию или отсутствию экзофтальма, сосудистым изменениям. Для оценки болевого эффекта и функционального состояния нервной системы исследовали рефлекторную оборонительную реакцию крыс. Определяли массу и ректальную температуру тела животных; проводили клинический анализ крови: общий уровень лейкоцитов и формула крови, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты, осмотическая резистентность эритроцитов. Выполняли стандартный биохимический анализ сыворотки крови с определением уровней: белка, альбумина, ЩФ, АЛТ, глюкозы, ЛДГ, билирубина, мочевины и креатинина.
Определяли диурез и выполняли клинический анализ мочи: цвет, pH мочи, белок, сахар, микроскопия осадка. Снимали ЭКГ, по которой оценивали частоту сердечных сокращений, время электросистолы - интервал QS, время полного сокращения и систолический показатель.
После окончания экспериментов по однократному и многократному УЗ воздействию животных умерщвляли. Вскрытие животных проводили сразу после умерщвления. Патоморфологическое исследование включало макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов и хвостов животных. Для гистологического исследования участки внутренних органов и хвоста от 3-5 крыс из каждой группы фиксировали в 10% нейтральном формалине и подвергали общепринятой гистологической обработке для получения парафиновых срезов толщиной 5-7 мкм. После депарафи-нирования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Участки хвоста после фиксации в формалине и промывки в спиртах дополнительно подвергали декальцинации в 5 %-ной азотной кислоте.
Микроскопию проводили на микроскопе Carl Zeiss, Jena (Германия). Полученные патоморфологические данные от животных после однократного и многократного воздействия УЗ с помощью установки «УСДТ» сравнивали с данными контрольных животных.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Office Excel 2003. За достоверные принимали различия при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Не выявлено влияния на организм животных группы «персонал». УЗ не оказало общетоксического действия на организм крыс из групп «пациент» ни в одном из изучавшихся режимов.
Однако в некоторых режимах, УЗ сопровождалось макроскопическими и микроскопическими проявлениями локальной токсичности, описанными далее. Гистологическая картина поперечных срезов хвоста интактных животных показана на рис.1 (см. вклейку).
Сканирующий однократный режим
После применения УЗ интенсивностью 3 Вт/см2 макроскопические изменения хвоста крыс в месте воздействия не выявлены как на 1, так и на 30 сутки. При гистологическом исследовании поперечных срезов хвостов крыс изменения структурных элементов хвоста - кожи, подкожной клетчатки, мышц, хряща и кости позвонков, стенки вен и артерий, сухожилий - не отмечены; морфологическая картина соответствует контролю (рис. 2а). Выраженная локальная токсичность обнаружена при гистологическом исследовании при интенсивности (И) >3 Вт/см2 (рис. 2 Б-Д). Спустя 1 сутки после УЗ воздействия интенсивностью 4,5 и 6 Вт/см2 у части крыс, в отличие от контрольных, отмечены изменения, которые выражались в отеке и мононуклеарной инфильтрации подкожной клетчатки; отеке, клеточной инфильтрации и деструкции пучков мышечных волокон, отрыве их от наружной соединительнотканной оболочки. Через 30 суток воспалительные изменения у большей части крыс исчезали; однако у единичных крыс обнаруживались участки мышц с признаками дистрофии, в некоторых артериях отмечено огрубение и отслаивание внутренней эластической мембраны, ее неравномерная извитость.
Направленный однократный режим
Через 1 сутки после применения УЗ интенсивностью 3 Вт/см2 у 2 из 3 крыс при наружном осмотре хвоста в месте УЗ воздействия макроскопические изменения не выявлены.
У одной крысы на месте воздействия УЗ хвост был несколько утолщен. Через 1 сутки после применения УЗ интенсивностью 4,5 Вт/см2 у всех крыс были отмечены макроскопические изменения в месте УЗ воздействия и рядом с ним в виде яркокрасных подкожных пятен.
У всех крыс обнаружены по 4 пятна, расположенные на некотором расстоянии друг от друга. На месте УЗ воздействия отмечали мацерацию кожи, отек и отсутствие волос. Сосуды хвоста были инъецированы.
Через 1 сутки после применения направленного УЗ интенсивностью 6 Вт/см2 у всех крыс в месте УЗ воздействия и рядом с ним обнаруживались подкожные кровоизлияния в виде красных и синих пятен. Отек тканей хвоста не был выражен, сосуды инъецированы, целостность кожи не нарушена.
При гистологическом исследовании поперечных срезов хвоста в этот срок после однократного направленного воздействия УЗ интенсивностью 3 Вт/см2 у животных отмечали умеренную воспалительную реакцию в подкожной клетчатке, выражавшуюся в отеке, несильной мононуклеарной инфильтрации, расширении и полнокровии вен; у одной крысы отмечали периваскулярное кровоизлияние (рис. 3. а, б).
При увеличении интенсивности УЗ до 4,5 и 6 Вт/см2 у всех животных были отмечены деструктивные и воспалительные изменения различной степени: отек кожи, подкожной соединительной ткани, выраженная мононуклеарная инфильтрация, гиперемия и красные тромбы в венозных сосудах, очаговая деструкция и дистрофия мышечных волокон, в цитоплазме некоторых макрофагов обнаруживались фагоцитированные обломки клеток.
У отдельных крыс наблюдали повреждение и десквамацию эпидермиса, скопление под ним серозно-фибринозного экссудата (рис. 3. В-Е). К 30 суткам у части крыс отмеченные изменения различной степени выраженности сохранялись.
УЗ-воздействие в данном режиме вызывает выраженную локальную дозо-зависимую токсичность во всем, изученном интервале И.
Сканирующий трехкратный режим
Наружный осмотр хвоста крыс на 1 и 30 сутки после воздействия УЗ в 3-кратном сканирующем режиме не выявил признаков повреждения в хвосте крыс на месте воздействия.
При гистологическом исследовании поперечных срезов хвоста крыс через 1 и 30 суток после окончания 3-кратного применения УЗ интенсивностью 3 Вт/см2 макроскопические изменения в структурных элементах хвоста - кожи, подкожной клетчатки, мышц, хряща и кости позвонков, стенки артерий и вен, сухожилий не выявлены.
При гистологическом исследовании морфологическая картина аналогична таковой у крыс контрольной группы и крыс после однократного УЗ воздействия интенсивностью 3 Вт/см2.
При увеличении интенсивности УЗ до 6 Вт/см2 при 3-кратном применении через 1 сутки у всех 5 крыс хвост в месте воздействия УЗ был бочковидно утолщен, отечен; у одной крысы обнаружено подкожное кровоизлияние в виде красного пятна.
60 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ...
Через 30 суток после 3-кратного применения УЗ интенсивностью 3 Вт/см2 утолщение хвоста сохранялось лишь у одной крысы из 52 а после применения УЗ интенсивностью 6 Вт/см в том же режиме наблюдалось у 4 из 5 крыс. У контрольных крыс изменения хвоста отсутствовали.
При гистологическом исследовании поперечных срезов хвоста через 1 сутки после окончания 3-кратного применения УЗ интенсивностью 6 Вт/см2 в хвосте в месте воздействия УЗ отмечены изменения, сходные с однократным применением УЗ интенсивностью 4,5 и 6 Вт/см2, которые выражались в отеке и клеточной инфильтрации подкожной клетчатки и пучков мышечных волокон; в последних наблюдались признаки разобщения и деструкции. Через 30 суток отмеченные выше изменения у большей части крыс исчезали, а у единичных были минимальными.
Таким образом, УЗ воздействие высокой интенсивности аппаратом «УСДТ» приводит к развитию локальных изменений в тканях хвоста, вызывая воспалительные и деструктивные изменения в подкожной соединительной ткани и мышцах.
В наших опытах 10-минутное озвучивание хвоста крыс в сканирующем однократном терапевтическом режиме при И = 3 Вт/см2 не сопровождалось развитием местных токсических эффектов. Во всех остальных изученных режимах наблюдались выраженные локальные изменения, наиболее выраженные и длительные при однократном прямом воздействии УЗ, генерируемого установкой «УСДТ». Однако ни в одном из использованных режимов облучение участка хвоста крыс не сопровождалось общетоксическим действием. Не выявлено также какого-либо токсического действия на крыс, находившихся рядом с работающей установкой «УСДТ». Таким образом, при использовании установки «УСДТ» безопасным является сканирующий режим УЗ с интенсивностью 3 Вт/см2.
Заключение
Результаты доклинического изучения на крысах показывают, что терапевтический аппарат «УСДТ» потенциально безопасен для пациентов и персонала при соблюдении рекомендаций и правил в соответствии с принципами действия УЗ прибора.
Литература
1. Административный регламент федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития по исполнению государственной функции по регистрации изделий медицинского назначения. http://www.medexpert.ru/document/registration/25/
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под ред. Хабриева Р.У. - Издание второе, переработанное и дополненное. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Федеральное государственное учреждение Научный Центр Экспертизы Средств Медицинского Применение. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
3. Установка ультразвуковой сонодинамической терапии «УСДТ». Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05174 от 3о июня 2009 г.
4. Myhr G. Multimodal cancer treatment: real time monitoring, optimization, and synergistic effects // Technol Cancer Res Treat. - 2008 - 7(5) - P. 409-14.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
