CC BY
79
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ 101
УДК 616-006.04-08-059:615.837.3:616-092.4/.9 N. V. Andronova1, D. V. Filonenko1, V. Е. Bozevolnov3, A. L. Nikolaev3,1. М. Treshalin1, Н. М. Treshalina1, G. К. Guerassimova1, 0. L. Kaliya2, G. N. Vorozhtsov2 ANTICANCER THERAPY COMBINED WITH LOCAL ULTRASOUND (EXPERIMENTAL EVALUATION) 1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2 FGUP GNC «NIOPIK», Moscow 3 М. V. Lomonosov Moscow State University ABSTRACT The literature is becoming saturated with reports on the increase of the cytotocxicity of different anticancer or other chemical agents in combination with local ultrasound radiation of middle intensity (US). We used sonodinamics therapy to treat the transplanted intramuscular animal tumors. It was shown, that US alone increased the double time of tumor volume (t) more than 1,3-1,8 times. Sarcolysin, carboplatin, doxolem, 5-fluorouracil, methotrexat, and the new catali-tyc system of teraphtal+ascorbic acid were chosen to combine with sonodinamic agents. The additive or potential effect by the combined therapy was evaluated up to т >2,2-3,3. Key words: local ultrasound radiation of middle intensity, anticancer drugs, combined sonodynamic therapy, experimental evaluation. H. В. Андронова1, Д. В. Филоненко1, В. Е. Божевольнов3, А. Л. Николаев3, И. М. Трещалин1, Е. М. Трещалина1, Г. К. Герасимова1, О. JI. Калия2, Г. Н. Ворожцов2 КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛОКАЛЬНОГО УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2 ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва 3 МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва РЕЗЮМЕ В последние годы появились данные об усилении цитотоксичности различных противоопухолевых агентов под действием локального ультразвукового (УЗ) облучения средней интенсивности. Мы использовали такую со-нодинамическую терапию против перевиваемого холангиоцеллюлярного рака крыс РС1, трансплантированного внутримышечно. Среди противоопухолевых препаратов для сочетания с УЗ выбраны сарколизин, карбоплатин, доксолем, 5-фторурацил, метотрексат и новая каталитическая система терафтал+аскорбиновая кислота. Показано, что под влиянием одного УЗ время удвоения объема опухоли возрастает в 1,3-1,8 раза. При сонодинамиче-ской терапии этот показатель достигает 1,8-3,3. Ключевые слова: комбинированная сонодинамическая терапия опухоли, ультразвук, противоопухолевые агенты, экспериментальное исследование. ВВЕДЕНИЕ пии злокачественных новообразований привели к все- Первые попытки воздействия ультразвука (УЗ) общему разочарованию, и это направление не развива-на злокачественные опухоли относятся к началу 1930- лось. В последние годы интерес к применению УЗ х годов. В эксперименте на солидной карциноме Эрли- в онкологии возник снова и не только в связи с совер-ха не было получено ингибирования роста опухоли шенствованием УЗ-терапевтической техники, но и с от-[11]. Продолжавшиеся вплоть до 1950-х годов разроз- крытием так называемых сонодинамических эффектов ненные попытки клинического применения УЗ в тера- [3, 6]. Сонодинамическая терапия (СДТ) основана на
№3/том4/2005 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
102
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
резком увеличении цитотоксичности различных химических соединений при локальном воздействии УЗ на патологический очаг, что приводит к деструкции и гибели клеток пропорционально времени облучения [10, 12]. Подобные свойства обнаружены у различных противоопухолевых цитостатиков и некоторых химических агентов [1,2,10,12,13]. О механизме усиления цитотоксичности веществ под действием УЗ нет единого мнения [3, 4, 9, 13].
Цель исследования — оценка влияния локального УЗ-воздействия средней интенсивности на рост опухоли и эффективность различных противоопухолевых агентов при сочетании с УЗ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Животные. Опыты проведены на 300 самцах беспородных крыс массой тела 80-200 г разведения ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Животных ранжировали по группам («=5-7). Одну группу оставляли контрольной и вводили этим крысам внутрибрюшинно однократно физиологический раствор натрия хлорида. Другие группы получали однократно монохимиотерапию (XT) или УЗ. В основных группах проводилась СДТ (УЗ+препарат) в адекватных монотерапии схемах применения, животных содержали в виварии РОНЦ РАМН на брикетированных кормах.
Опухолевая модель. Всем крысам в мышцы (в/м) правой задней лапки трансплантировали холангиоцел-люлярный рак РС1, известный своей чувствительностью к алкилирующим агентам при раннем начале лечения [8]. В опытах использовали 3-7-й пассажи опухоли in vivo. Трансплантацию взвеси опухолевой ткани выполняли по 50 мг в 0,2 мл питательной среды 199. Размер опухоли измеряли на 10-14-е сутки после трансплантации, вычисляли средний объем (Vcp) и затем ранжировали, чтобы составить экспериментальные группы с разбросом показателя не более 10 %. К началу терапии объем опухоли составлял V0=9,5 (9,1-9,9) см3. Чувствительность к химиотерапии РС1 большого объема в литературе не описана.
Ультразвуковое воздействие. Для УЗ-воздействия использовали разработанную нами установку У СДТ, предназначенную для СДТ злокачественных опухолей. Установка состоит из 2 генераторов с частотой
0,88 МГц и 2,64 МГц, соответствующих усилителей и 2 мозаичных излучателей диаметром 20 мм, содержащих по 19 пьезоэлементов. Максимальная интенсивность излучательного элемента не превышала 3,0 Вт/см2. Автономное функционирование каждого излучателя обеспечивало соответствие конфигурации ультразвукового поля и очага поражения. Общая площадь, перекрываемая акустическим потоком, составляла около 100 см2. Акустические колебания вводили через контактную термостатированную среду. Излучатели располагали под прямым углом друг к другу. Для равномерного распределения акустической энергии в опухоли был сконструирован специальный штатив, позволяющий производить сканирование очага поражения.
Перед началом опыта крыс наркотизировали кета-мином, который вводили подкожно в дозе 60-70 мг/кг. УЗ проводили в ранее отработанном режиме: облучение с 2 полей под водой температуры 36 °С при интенсивности на 1-е поле 0,88 МГц (1,0 Вт/см2), на 2-е поле — 2,64 МГц (2,0 Вт/см2) [2].
Препараты. В сочетании с УЗ использованы различные противоопухолевые препараты: сарколизин, карбоплатин, доксорубицин, 5-фторурацил (5-ФУ) и метотрексат (МТХ). Учитывая, что опыты выполняли на развившихся опухолях, отличающихся меньшей чувствительностью к химиотерапии, противоопухолевые препараты вводили в оптимальных терапевтических дозах [7]. Для оценки эффективности комбинированного воздействия с УЗ препараты вводили также в */2 оптимальной дозы.
Противоопухолевые цитостатики вводили однократно внутрибрюшинно за 15-20 мин до УЗ: сарколизин — в дозе 4 и 8 мг/кг; карбоплатин — 30 мг/кг; до-ксолем — 5 мг/кг; 5-ФУ — 40 мг/кг; МТХ — 4 мг/кг.
Дозы новой бинарной каталитической системы те-рафтал (ТФ) с аскорбиновой кислотой (АК) [5] были подобраны эмпирически. Ранее нами было показано, что на фоне наркоза переносимые дозы ТФ уменьшаются в 2 раза. Поэтому ТФ вводили в субтерапевтиче-ской дозе 10 мг/кг (!/2 оптимальной дозы) за час до УЗ, АК — в дозе 22 мг/кг через 40 мин после ТФ.
Оценка эффективности терапии. Для оценки эффекта каждого воздействия определяли время удвоения объема опухоли х. Для этого до и после воздействия в разные сроки опухоли измеряли и рассчитывали средний объем: Уср=ахЬхс. Затем вычисляли У/У0 и графическим способом определяли х в сравниваемых группах. Об эффективности СДТ судили по коэффициенту К, который вычисляли по формуле:
К=тКОНТРОЛЬ/т ТЕРАПИЯ’ где ^КОНТРОЛЬ — в гРУппе контроля без специфического воздействия;
тТЕРАПИЯ — в ГРУппе, получившей УЗ и/или противоопухолевый препарат.
Наблюдение продолжали до 5-кратного увеличения опухоли, после чего животное умерщвляли эфиром.
Полученные данные обрабатывали статистически, используя доверительные интервалы для средних сравниваемых величин по стандартному методу Стью-дента в модификации Р. Б. Стрелкова.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Действие локального УЗ на рост опухоли крыс Действие одного УЗ на рост РС1 демонстрируют данные табл. 1-4, расчет времени удвоения объема опухоли представлен на рис. 1-4. Видно, что в группе контроля без воздействия скорость роста опухоли достаточно высокая, в серии из 4 опытов время удвоения размеров опухолевого узла составляет 3-6 дней. У крыс, получивших УЗ-воздействие, наблюдали некоторое замедление роста опухоли (т=4-8 дней) вне зависимости от скорости роста опухоли. Эффективность УЗ соответственно выражается как К=1,1—1,7,
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ 103
что свидетельствует о слабом противоопухолевом дей- зы цитостатика получен противоопухолевый эффект, ствии УЗ, генерируемом на установке УСДТ. который характеризуется как К=2,2 и 2,8.
СДТ с сарколизином
Соотношение средних объемов опухолей У/У0 на 5, 9 и 13-е сутки в группах представлено в табл. 1, расчет времени удвоения опухоли х — на рис. 1. Видно, что в группе контроля т составляет 6 дней, что свидетельствует о сравнительно медленном росте опухоли. В группе УЗ наблюдали некоторое замедление роста опухоли — т:=8 дней, в группе с одним сарколизином х=6 дней; в группе СДТ с сарколизином в дозе 4 мг/кг х=13 дней, а при дозе 8 мг/кг — 17 дней.
Таблица 1
Эффективность СДТ с сарколизином
Группа Относительный объем опухоли (V,/V„) X, дни К
Сутки после воздействия
0-е 5-е 9-е 13-е
Контроль (физиологичес -кий раствор) 1,0 1,8 3,8 6,2 6 —
УЗ 1,0 1,5 2,5 3,7 8 1,3
Сарколизин (8 мг/кг) 1,0 1,8 3,9 6,2 6 1,0
Сарколизин (4 мг/кг) + УЗ 1,0 1,1 1,6 2,0 13 2,2
Сарколизин (8 мг/кг) + УЗ 1,0 U 1,3 1,4* 17 2,8
* 2-кратное увеличение среднего объема опухолей на 17-е сутки
Сутки после лечения
"—Контроль (физраствор) ■ УЗ |
—*—•Сарколизин 8 мг/кг “• - Сарколизин 4 мг/кг + УЗ —Сарколизин 8 мг/кг + УЗ________________________
Рис. 1. Эффективность СДТ с использованием сарколизина
Таким образом, в этом опыте один УЗ оказал слабое противоопухолевое действие, К=1,3. Сарколизин в изученных дозах не действовал на рост опухоли, К=1,0. При СДТ с сарколизином в зависимости от до-
СДТ с карбоплатином или доксолемом Соотношение средних объемов опухолей У/У0 на 2,7 и 10-е сутки в группах представлено в табл. 2, расчет времени удвоения опухоли х показан на рис. 2. Видно, что в этом опыте в группе контроля х составило 4 дня, т. е. рост опухоли был более быстрый, чем в первом опыте. В группе с одним УЗ также отмечена задержка роста опухоли, х=7 дней. В группах, получивших карбоплатин в дозе 30 мг/кг, х=4 дня. В группе СДТ с карбоплатином х=13 дней. В группе с доксолемом в дозе 5 мг/кг х=4 дня. В группе СДТ с доксолемом х=12 дней.
Таблица 2
Эффективность СДТ терапии с карбоплатином или доксолемом
Группа Относительный объем опухоли (\'7\'с>) т, дни к
Сутки после воздействия
0-е 2-е 7-е 10-е
Контроль (физиологический раствор) 1,0 1,6 2,9 4,3 4 —
УЗ 1,0 1,3 2,0 2,8 7 1,7
Карбоплатин (30 мг/кг) 1,0 1,5 2,8 4,5 4 1,0
Доксолем (5 мг/кг) 1,0 1,6 3,1 4,4 4 1,0
Карбоплатин (30 мг/кг) + УЗ 1,0 1,1 1,4 1,7 13 за
Доксолем (5 мг/кг) + УЗ 1,0 1,1 1,4 1,8 12 3,0
*1 ><^2 2 .4
-о- і —
1 4 „ 7 10 13
Сутки после лечения
1 Контроль * 4 УЗ
“А" 2 Карбоплатин 30 мг/кг ——Ж —■*' 5 Доксолем 5 мг/кг
3 Карбоплатин 30 мг/кг+УЗ “0-6 Доксолем 5 мг/кг+УЗ
Рис. 2. Эффективность СДТ с использованием карбоплатина и доксолема:
1 — контроль (физиологический раствор); 2 — карбоплатин (30 мг/кг); 3 — карбоплатин (30 мг/кг) +
- УЗ; 4 — УЗ; 5 — доксолем (5 мг/кг); 6 — доксолем (5 мг/кг) + УЗ
Таким образом, один УЗ оказал в этом опыте слабое противоопухолевое действие, К=1,8. Карбоплатин или доксолем в изученных дозах не действовал на рост опухоли, К=1,0. При СДТ с карбоплатином или доксо-лемом получен значимый противоопухолевый эффект — К=3,2 и 3,0 соответственно,
СДТ с 5-фторурацилом или метотрексатом Соотношение средних объемов опухолей V/V0 на
3, 7 и 11-е сутки в группах представлено в табл. 3. Расчет времени удвоения опухоли х показан на рис. 3. Видно, что в этом опыте скорость роста опухоли несколько больше, чем в предыдущем. В группе контроля х составило 3 дня. Относительное увеличение скорости роста РС1 от опыта к опыту является следствием прогрессии в результате пассирования in vivo.
Таблица 3
Эффективность СДТ терапии с 5-фторурацилом или метотрексатом
Группа Относительный объем опухоли (Vi/Vo) X, дни К
Сутки после воздействия
0-е 3-и 7-е 11-е
Контроль (физиологический раствор) 1,0 1,9 3,6 5,4 3 —
УЗ 1,0 1,8 3,0 4,5 3,5 1Л
5-ФУ (40 мг/кг) 1,0 2,0 4,4 5,7 3 1,0
МТХ (4 мг/кг) 1,0 1,8 2,8 5,0 3 1,0
5-ФУ (40 мг/кг) + УЗ 1,0 1,0 1,6 2,3 10 3,3
МТХ (4 мг/кг) + УЗ 1,0 0,9 1,5 2,2 10 3,3
В этих условиях в группе УЗ х=3,5 дня. В группе, получившей 5-ФУ в дозе 40 мг/кг, т=3 дня. В группе СДТ с 5-ФУ или СДТ с МТХ х=10 дней.
Таким образом, в этом опыте один УЗ оказал минимальное ингибирующее действие на рост опухоли, К=1,2. 5-ФУ или МТХ в изученных дозах не действовали на рост опухоли, К=1,0. При СДТ с 5-ФУ или МТХ получен противоопухолевый эффект, К=3,2 для обеих схем СДТ.
СДТ с каталитической системой терафтал+ас-корбиновая кислота
Соотношение средних объемов опухолей У/У0 на
2, 7 и 10-е сутки в группах представлено в табл. 4. Расчет времени удвоения опухоли х показан на рис. 4. Видно, что в этом опыте в группе контроля х составило 3,5 дня, т. е. скорость роста опухоли такая же, как в предыдущем эксперименте. В группе с одним УЗ х=4 дня. В группах, получивших ТФ+АК в дозе 10+22 мг/кг, т=4 дня. В группе СДТ с каталитической системой х=7 дней.
Таблица 4
Эффективность СДТ с каталитической системой терафтал+аскорбиновая кислота
Группа Относительный объем опухоли (Vt/Vo) т, дни К
Сутки после воздействия
0-е 2-е 7-е 10-е
Контроль (физиологический раствор) 1,0 1,6 2,9 4,3 3,5
УЗ 1,0 1,4 2,6 4,1 4 1,1
ТФ+АК (10+22 мг/кг) 1,0 1,5 2,6 3,9 4 1,1
ТФ+АК (10+22 мг/кг) + УЗ 1,0 1,3 2,0 3,1 7,0 2,0
1 Контроль (фнз. Раствор) -*• УЗ
• 5-ФУ 40 мг/кг —Ж—Метотрексат 4 мг/кг
-X- 5-ФУ 40 мг/кг+УЗ —Метотрексат 4 мг/кг+УЗ
Рис. 3. Эффективность СДТ с использованием 5-фторурацила и метотрексата
Г*1"— Кмтрмь (фпрасгма) • • • VI |
1—*—ТОИ-АК та мг/кг —ТФ+АК 10+22 мг/кг+УЗ
Рис. 4. Эффективность СДТ с использованием с каталитической системы терафтал+аскорбиновая кислота
Таким образом, один УЗ или одна каталитическая система практически не оказали ингибирующего действия на рост опухоли в опыте, К=1,1. При СДТ с каталитической системой ТФ+АК получен противоопухолевый эффект, К=2,0.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение эффективности комбинированной со-нодинамической терапии у наркотизированных крыс с развившейся опухолью РС1 среднего объема 9,5(9,1-^9,9)см3 с помощью локального УЗ-воздей-ствия в сочетании с различными противоопухолевыми агентами показало, что:
1. Однократное локальное УЗ-воздействие с 2 полей частотой 0,88 и 2,64 МГц и интенсивностью соответственно 1 и 2 Вт/см2 оказывает ингибирующее действие на развившийся гепатоцеллюлярный рак крыс РС1 с увеличением времени удвоения опухоли в 1,1-1,7 раз.
2. Сарколизин, карбоплатин, доксолем, 5-фторура-цил или метотрексат в терапевтических дозах не влияют на рост развившейся опухоли РС1 большого объема, К=1,0—1,1.
3. Комбинированная СДТ развившейся опухоли РС1 при сочетании УЗ с сарколизином, карбоплати-ном, доксолемом, 5-фторурацилом или метотрексатом дает возможность получить противоопухолевый эффект с увеличением времени удвоения опухоли в 2,2-3,3 раза.
4. Лучшие результаты при СДТ (К>3,0) получены с использованием 5-фторурацила, метотрексата или карбоплатина.
5. Слабый противоопухолевый эффект СДТ (К=2,0), полученный с каталитической системой те-рафтал+аскорбиновая кислота, связан с использованием субтерапевтических доз препаратов из-за плохой совместимости терафтала и наркоза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андронова Н. В., Николаев А. Л., Абрамов С. В. и др. Эффективность локального ультразвукового воздействия на опухоль с помощью УСДТ в сочетании с терафталом и другими соносенсибилизаторами // Рос. биотерап. журн. — 2003. — Т. 2, №1. — С. 12-13.
2. Андронова Н. В., Николаев А. Л., Трещалина Е. М и др. Эффективность локального ультразвукового облучения опухолей мышей в сочетании с фталоци-
анинами кобальта // Рос. биотерап. журн. — 2002. — Т.
1, № 2. — С. 110-111.
3. Николаев А. Л., Раевский П. М. Сонодинамичес-кая терапия злокачественных опухолей // Рос. хим. журнал. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 105-111.
4. Николаев А. Л., Чичерин Д. С., Герасимова Г. К. и др. Механизм кристаллизации в полимерных гелях в аспекте сонодинамической терапии онкологических заболеваний // Доклады Академии наук. — 2003. — Т. 390, № 1. —С. 59-61.
5. Сыркин А. Б., Жукова О. С., Кикоть Б. С. и др. Терафтал — новый препарат для бинарной каталитической терапии злокачественных опухолей // Рос. хим. журн. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 140-146.
6. Тер Хаар Г. Р. В кн.: Применение ультразвука в медицине / Под ред. К. Хилл. — М.: Наука, 1989.
7. Treshalina Н, Kobliakov V., Duzheva Т. et al. Biochemical and Morphological Profiles of Cholangiocellular Carcinoma PC-1 after Subcutaneous and Intrahepatic Transplantation // Экспериментальная онкология. — 2001. — Т. 23, № 2. — С. 126-130.
8. Experimental Evapuation of Antitumor drugs in the USA and USSR and Clinical correlations / Ed. by A. Goldin, I. Kline and Z. Sof’ina, A. Syrkin. — NCI Monograf 55, 1980. — P. 56-57, 128-129.
9. Misik V, Riesz P. EPR characterization of free radical intermediates formed during ultrasound exposure of cell culture media // Free Radical Biology and Medicine.
— 1999. — Vol. 26, No. 7/8. — P. 936-943.
10. Mohamed М. М., Mohamed M. A., Fikry N. M. Enhancement of antitumor effects of 5-fluorouracil combined with ultrasound on Ehrlich ascites tumor in vivo. H Ultrasound in Med. Biol. — 2003. — Vol. 29, No. 11. — P. 1635-1643.
Szent-Gyorgi A. Chemical and Biological effects of ultrasound radiation // Nature. — 1933. — Vol. 131. — P. 278-281.
11. Umemura S., Yumita N„ Umemura K. et al. Sonodinamiccaly induced effect of rose bengal on isolated sarcoma 180 cells // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1999. — Vol. 43. — P. 389-393.
12. Yumita N.. Sakata I., Nakajiama S. et al: Ultrasonically induced cell damage and active oxygen generation by 4-formyloximeetylidene-3-hydroxyl-2-vinyl-deuterio-porphynyl(IX)-6-7-diaspartic acid: on the mechanism of sonodynamic activation // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — P. 179-184.
M°3/tom4/2005
I-------------------------
