CC BY
37
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 139-146 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Lubyaga, Axenov-Gribanov, Madyarova, Gurkov, Lozovoy, Homich, Golubev and Timofeyev
ORIGINAL ARTICLE
The Impact of Experimental Hypoxia and Subsequent Normoxia on the Content of Some Ions and Markers of Physiological Stress-adaptation in Gastropod Species Lymnaea stagnalis
12 12 2
Lubyaga J.A. ’ , Axenov-Gribanov D.V. ’ , Madyarova E.V. ,
Gurkov A.N.1,2, Lozovoy D.V.2, Homich A.S.3, Golubev A.P.3,
1 2
Timofeyev М.А. ’
11rkutsk State University. 664003 Irkutsk, K. Marx str., 1, Russia
2 Institute of Biology at Irkutsk State University. 664003 Irkutsk, Lenin str., 3, Russia
3 International Sakharov Environmental University. 220070 Minsk, Dolgobrodskaya str., 23, Belarus
*Tel.:+7(3952) 600 893
*E-Mail: [email protected]
Received November 24, 2014
The purpose of this study was to evaluate the influence of hypoxia and subsequent normoxiaon the maintenance of respiratory pigment hemocyanin, total protein, lactate and some ions (Na +, K +, Ca2+, NH/, Mg2+) in the mantle liquid in palaearctic gastropod species Lymnaea stagnalis. It was shown that short-term experimental hypoxia leads to the activation of the physiological mechanisms of stress adaptation in widespread Palaearctic eurybiotic gastropod species and does not lead to the activation of the stress-resistance mechanisms on the biochemical and molecular levels.
Key words: gastropods, hypoxia, ion regulation, normoxia, stress
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
140
The Impact of Experimental Hypoxia and Subsequent Normoxia ...
ORIGINAL ARTICLE
Влияние экспериментальной гипоксии и последующей нормоксии на изменение содержания некоторых ионов и показателей физиологических стресс-адаптаций у легочного моллюска большого прудовика Lymnaea
stagnalis
Ю.А. Лубяга1,2, Д.В. Аксенов-Грибанов1,2, Е.В. Мадьярова2,
А.Н. Гурков1,2, Д.В. Лозовой2, А.С. Хомич3, А.П. Голубев3,
1 2
М.А. Тимофеев '
1 ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет». 664003 РФ, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1
2 НИИ биологии ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет». 664003 РФ, г. Иркутск, ул. Ленина, 3
3 Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова, 220070 Беларусь, г. Минск, ул. Долгобродская, 23
*Тел.:+7(3952) 600 893
*E-Mail: [email protected]
Поступила в редакцию 24 Ноября 2014 г.
Целью настоящего исследования была оценка влияния гипоксии и последующей нормоксии на содержание дыхательного пигмента гемоцианина, лактата и некоторых ионов (Na+, K+, Ca2+, NH4+, Mg2+) в мантийной жидкости палеарктического легочного моллюска Lymnaea stagnalis.
Показано, что кратковременная экспериментальная гипоксия приводит к активации физиологических механизмов стресс-адаптации у широко распространенного эврибионтного палеарктического вида гастропод, однако не приводит к активации биохимических и молекулярных механизмов стресс-защиты.
Key words: гастроподы, гипоксия, ионная регуляция, нормоксия, стресс
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Lubyaga et al.
141
Экологические характеристики видов в (пневмостом). По этой причине в природе он
значительной степени определяются встречается преимущественно в прибрежных или
физиологическими и биохимическими процессами, мелководных участках (до 1,5 - 2 м) водоемов, где
происходящими на уровне клеточного метаболизма имеет возможность периодически подниматься к
(Grieshaber et al., 1994). Одними из ключевых поверхности воды. Отсюда содержание
показателей, отражающих состояние организма и растворенного кислорода в воде обычно не
происходящие в нём процессы, являются рассматривается в качестве лимитирующего
механизмы ионной регуляции и физиологические фактора среды для L. stagnalis. Однако данный
показатели стресс-адаптации (Frederich et al., вид поглощает атмосферный кислород через
2000). Исследование данных механизмов стресс- легкое и растворенный в воде кислород, через
ответа у видов, обитающих в мелких пресноводных кожные покровы примерно в одинаковых
водоемах, представляет особый интерес, количествах. При этом кислород, поглощенный
поскольку такие экосистемы в наибольшей степени легким, поступает в гемолимфу, а проникший
подвержены различным антропогенным нагрузкам. диффузно через кожу (обычно не глубже 1 мм) - в
В частности, летнее повышение температуры тканевую жидкость (Stadnichenko et al., 1996). При
водоема приводит к понижению содержания необходимости, например, при резком повышении
растворенного кислорода в воде вследствие его уровня воды в водоеме и в зимний период, когда
диффузии в атмосферу и расходованием на водоем покрывается льдом, L. stagnalis полностью
окисление присутствующих в воде органических и переходит на дыхание растворенным в воде
неорганических загрязнителей (Konstantinov, кислородом, заполняя легкое водой и поэтому,
1986). может оказываться в условиях гипоксии. Для
Эврибионтный палеарктический вид оценки адаптивного потенциала L. stagnalis в
пресноводных легочных моллюсков Lymnaea условиях резких колебаний содержания
stagnalis (Linnaeus, 1758) является широко растворенного кислорода в воде природных
распространенным модельным объектом для водоемах нами проведена экспериментальная
исследования влияния условий среды обитания на оценка влияния гипоксии на содержание
физиологические и биохимические показатели дыхательного пигмента гемоцианина, лактата и
стресс-метаболизма (Wijsman et al., 1998; некоторых ионов (Na+, K+, Ca2+, NH4+, Mg2+) в его
Gnatishina et al., 2011; Coutellec et al., 2006). В мантийной жидкости.
теплый период года L. stagnalis дышит MATERIALS AND METHODS
преимущественно атмосферным воздухом, который Сбор взрослых представителей гастропод для
поступает в непарное легкое через крупное данного исследования проводили с водной
закрывающееся дыхательное отверстие растительности у поверхности озера,
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
142
The Impact of Experimental Hypoxia and Subsequent Normoxia ...
расположенного в черте г. Иркутска на о. Юность спектрофотометра CaryVarian - 50 (США).
(географические координаты: 52.268001, Измерение концентрации лактата проведено по
104.280998; 52.268086, 104.284055.). Оценку стандартным протоколам «Лактат-витал» (Витал
влияния гипоксии проводили посредством диагностикс, СПб) при длине волны 505 нм
экспонирования моллюсков в условиях (Axenov-Gribanov, 2013).
экспериментальной гипоксии при содержании Оценку содержания ионов (Na+, K+, Ca2+, NH4+,
кислорода в воде 3 мг/л в течение шести часов и Mg2+) проводили с применением метода
последующей нормоксии при 8-9 мг/л в течение безреагентной ионной хроматографии на приборе
трех часов при температуре вылова. При ICS - 2000 (Германия). Измерение концентрации
проведении экспериментов была использована ионов проведено по калибровочным графикам для
вода из водоема в местах отлова моллюсков. каждого анализируемого иона.
Эксперименты проведены в гипоксических Все эксперименты проведены в 7
склянках с притертой крышкой при температуре биологических повторностях. Биохимический
вылова организмов - 20-22°С. Условия гипоксии анализ каждой пробы был проведен в 3-х
достигались путем отсасывания кислорода из воды аналитических измерениях. Оценку достоверности
с применением мембранного насоса. проводили, используя двувыборочный u-критерий
Оценку содержания кислорода в воде Манна-Уитни. Статистический анализ проводили с
проводили с помощью оксиметра Extech Heavy использованием программы Statistica 8.0. На
Duty Dissolved Oxygen Meter 407510 (США). диаграммах указаны доверительные интервалы. * -
В ходе исследования проведена оценка обозначены случаи достоверного отличия значений
содержания дыхательного пигмента гемоцианина, от контрольного при доверительной вероятности -
общего белка, лактата и некоторых ионов (Na+, K+, 0,95.
Ca2+, NH4+, Mg2+) в мантийной жидкости RESULTS AND DISCUSSION
палеарктического вида гастропод. Мантийную В условиях экспериментальной гипоксии
жидкость для исследования получали путем происходит повышение содержания гемоцианина с
легкого укола ноги моллюска энтомологической 62,31±10,95 мг/мл до 113,15,95±21,84 мг/мл (рис.
булавкой (Stadnichenko et al., 1999). 1А), что свидетельствует об активации
Оценку содержания гемоцианина проводили физиологических реакций стресс-адаптации и об
при длине волны 335 нм, предварительно разбавив интенсификации транспорта кислорода в
пробы в 100 раз и осадив форменные элементы стрессовых условиях (Morris et al., 1988: Lorenzon
центрифугированием в течение 5' при 16100 rpm, et al., 2008). При этом важно отметить, нормоксия в
5°С (Frederich et al., 2000). Содержание гемоцианина и лактата проводили с помощью течении 3 часов после 6 часовой гипоксии не
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Lubyaga et al.
143
приводила к восстановлению уровня гемоцанина межклеточную среду из-за недостатка энергии,
до контрольных значений. снижения интенсивности активного транспорта
Принимая во внимание, что в ходе работы не ионов и вымывания Ca2+ из раковины. Ранее
отмечали изменения содержания лактата в проведенными исследованиями Мартемьянова
мантийной жидкости относительно контрольных В.И. (2011) на примере D. polymorpha показано,
величин - 0,115±0,02 мМоль/г (рис. 1Б), это что повышенная концентрация Ca2+ в гемолимфе
указывает на то, что данный тип стрессового пресноводных двустворчатых моллюсков является
воздействия не приводит к увеличению доли защитной реакцией в ответ на разные по качеству
анаэробных процессов в клетке (Grieshaber et al., экстремальные воздействия (температура,
1994; Ekkekakis et al., 2004) и существенных токсиканты) (Martem'yanov, 2011), что
перестроек в метаболизме гастропод, обеспечивает поддержание pH гемолимфы.
затрагивающих биохимические и молекулярные Таким образом, кратковременная
механизмы стресс-адаптации не происходит. индуцированная гипоксия приводит к активации
Материалы по оценке содержания ионов Na+, физиологических механизмов стресс-адаптации у
K+, Mg2+ , NH4+ и Ca2+ в мантийной жидкости эврибионтного вида большого прудовика и не
контрольной выборки L. stagnalis представлены на приводит к активации биохимических и
рисунке 2. Содержание ионов составило: Na+ - молекулярных механизмов стресс-защиты.
146,29±26,55 мМоль/л; K+ - 4,49±0,33 мМоль/л; Mg2+ В экспериментальных условиях при
- 14,37±2,41 мМоль/л; NH4+- 1,04±0,11 мМоль/л; принудительном кожном дыхании (через покровы
Ca2+ - 21,08±5,19 мМоль/л. тела и заполненное водой легкое) выживаемость
В ходе исследования показано, что большого прудовика при температуре, близкой к
концентрации ионов Na+, K+, Mg2+ и NH4+ 20оС, не превышает 44-50 ч (Stadnichenko et al.,
оставались неизменными в течение всего 1996), что указывает на ограниченность
эксперимента, в то время как концентрация ионов физиолого-биохимических механизмов адаптации
Ca2+ повысилась уже к 3 часам экспозиции в большого прудовика к дефициту растворенного
условиях гипоксии до 35,07±6,52 мМоль/г и кислорода в воде. Поэтому в теплый период года
сохранялась на повышенном уровне после 3х атмосферное дыхание у данного вида является
часовой нормоксии от суммарной 6 часовой преобладающим. В зимний период, при
гипоксии (рис. 3). температурах, близких к 0оС, потребности в
По-видимому, индуцированное гипоксией кислороде у большого прудовика, как
среды обитания повышение концентрации Ca2+ в пойкилотермного организма, резко снижаются, что
мантийной жидкости связано с выходом ионов в позволяет ему существовать исключительно за счет растворенного в воде кислорода.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
мМоль/л
144
The Impact of Experimental Hypoxia and Subsequent Normoxia ...
150
100
S
t
50
0
■ Гемоцианин
Рисунок 1. Изменение содержания гемоцианина (1-А) и лактата (1-Б), в мантийной жидкости L. stagnalis при экспозиции в условиях гипоксии и нормоксии.
Рисунок 2. Содержание катионов в мантийной жидкости L. stagnalis в контрольных условиях.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
Lubyaga et al.
145
Рисунок 3. Изменение содержания катионов в условиях гипоксии и нормоксии
ACKNOWLEDGEMENT
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 14-04-00501_а (приобретение расходных материалов), 14-3450051 (стажировка А.С.Хомича), РНФ 14-14-00400 (приобретение расходных материалов), базовой (1354) и проектной (6.382.2014) частей государственного задания, программы стратегического развития ФГБОУ ВПО «ИГУ» (приобретение расходных материалов), гранта молодых ученых ФГБОУ ВПО «ИГУ» и совместной программы академических обменов DAAD -Минобрнауки РФ М. Ломоносов 2014-2015.
REFERENCES
Axenov-Gribanov D.V. (2013) Comparative evaluation of the impact of changes in the ambient
мантийной жидкости L. stagnalis при экспозиции в
temperature at the Baikal and Palaearctic organisms with focus on energy metabolism and nonspecific stress response: Dis. thesis. ISU, Irkutsk, 169 p.
Coutellec M.A., Lagadic L. (2006) Effects of selffertilization, environmental stress and exposure to xenobiotics on fitness-related traits of the freshwater snail Lymnaea stagnalis. Ecotoxicology. 15(2) 199-213.
Ekkekakis P., Hall E.E., Petruzzello S.J. (2004). Practical markers of the transition from aerobic to anaerobic metabolism during exercise: rationale and a case for affect-based exercise prescription. Preventive medicine. 38(2) 149-159.
Frederich M. et al. (2000) Haemolymph Mg (2+) regulation in decapod crustaceans: physiological
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
146
The Impact of Experimental Hypoxia and Subsequent Normoxia ...
correlates and ecological consequences in polar areas. Journal of experimental biology. 203(8) 1383-1393.
Gnatishina L..L., Fal'fushinskaya G.I., Golubev O.P., Dallinger R., Stoliar O.B. (2011) Role of metallothioneins in adaptation of Lymnaea stagnalis (Mollusca: Pulmonata) to environment pollution. Hydrobiological Journal. 47(5) 56 - 66.
Grieshaber M.K., Hardewig I., Kreutzer U. (1994) Physiological and metabolic responces to hypoxia in invertebrates. Rev. physiol. Biochem.
Pharmocol, 125. 44 - 147.
Konev O.J., Afonin V., Dromashko S. (2006) Age-related changes in the cellular composition of the mantle and the liquid spectrum cytomorphological signs of genetic damage gemotsitov Lymnaea stagnalis. Cytology and Genetics. 40(6) 21-27.
Konstantinov, A.S. (1986). General hydrobiology. MM: VSh. 4 ed. 483 p.
Lorenzon S. et al. (2008) Stress effect of two different transport systems on the physiological profiles of the crab Cancer pagurus. Aquaculture. 278(1) 156-163.
Martem'yanov V.I. (2011) Effect of the mineral composition of the external environment on the performance of water-salt metabolism instill in Rybinsk reservoir dreysseny Dreissena
polymorpha Pallas. Russian journal. biol. Invasions, 2. 120-134.
Morris S., Taylor A. C., Bridges C. R. (1988). Response of haemolymph oxygen affinity to simultaneous salinity and oxygen stress in the
intertidal prawn Palaemonelegans (Rathke). Comparative Biochemistry and Physiology Part A:
Physiology. 90(1) 31-39.
Stadnichenko A.P., Slastenko N.N., Gouzenko O.V., Svitelsky N.N., Sychevsky A.S. (1996) The effect of trematode infestations and exposure to nitrate lead to lung and skin breathing Lymnaea stagnalis (Mollusca: Lymnaeidae). Parazitologiya. 30(1) 76 -80.
Stadnichenko A.P., Ivanenko L.D. et al. (1999) The influence of trematode invasion on soderzhaniegemotsianina in the hemolymph of the pond snail (Gastropoda, Pulmonata, Lymnaeidae). Parasitology. 33(2). 125 - 128.
Timofeev MA (2010) Ecological and physiological aspects of adaptation to environmental factors of endemic Baikal and palearctic amphipods: Dis. thesis., TSU, Tomsk, 384 p.
Wijsman T. et al. (1988) Hyperglycaemia in relation to
anoxia and stress in the freshwater snail Lymnaea
stagnalis. Comparative Biochemistry and
Physiology Part B: Comparative Biochemistry.
89(1), 55-63.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014
