Тезисы II международного симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

ТЕЗИСЫ II МЕЖДУНАРОДНОГО СИМПОЗИУМА «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА»

22—23 января 2009 г., г. Москва

Симпозиум поддержан комплексным проектом «Разработка и выпуск опытных партий новых эффективных направленно-модифицированных терапевтических и диагностических средств постгеномной генерации для использования в онкологической практике» (шифр 2007-02-2.2-05-01-006), выполняемым в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники»

на 2007—2012 гг.

А. Ю. Бабаян1, С. В. Башкатов2, О. Б. Карякин2, Д. В. Залетаев1, М. В. Немцова1

ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ КАК ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ МАРКЕРОВ ПРОГНОЗА ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ РАКЕ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

1 Институт молекулярной медицины. ММА им. И. М. Сеченова, Москва, Российская Федерация 2 ГУ МРНЦ РАМН, Обнинск, Российская Федерация

Для определения риска неблагоприятного течения поверхностного рака мочевого пузыря (ПРМП) используется система клинико-морфологических критериев. Однако эта система не полностью отражает биологический потенциал ПРМП и нуждается в дополнительных маркерах. Цель исследования — поиск и характеристика молекулярно-генетических нарушений в качестве дополнительных маркеров неблагоприятного течения ПРМП. Диагностическая панель включала делеции 3р — , 9р — , 9д — , гена р53, мутации 7 и 10 экзонов гена FGFR3 и гиперметилирование промоторных районов генов RASSF1А, RARb, pl6l pl4, CDH1, определенные в операционном материале, полученном в результате трансуретральной резекции у 120 пациентов с ПРМП. Делеции 9р— достоверно чаще (р = 0,0057) выявляются в опухолях, склонных к быстрому рецидивированию (в течение первого года). Инвазия в подслизистый слой (рТ1) связана с аномальным метилированием генов RASSF1А (р = 0,02) и p16 (р = 0,03). Мутации гена FGFR3 не встречаются в низкодифференцированных опухолях (С3) (р = 0,056), однако в этой группе повышена частота делеций 3р— и 9д — (р = 0,026 и р = 0,04 соответственно) и метилирования гена RARb (р < 0,01). Определенная нами группа неблагоприятных молекулярно-генетических маркеров в сочетании с классическими клинико-морфологическими критериями поможет уточнить прогноз заболевания.

A. Y. Babayan1, S. V. Bashkatov2, O. B. Karyakin2, D. V. Zaletaev1, M. V. Nemtsova1

MOLECULAR GENETIC ALTERATIONS AND THEIR PROGNOSTIC VALUE IN SUPERFICIAL BLADDER CANCER.

1 Research. Institute for Molecular Medicine, I. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow,

Russian Federation 2 Medical Radiology Research. Centre RAMS, Obninsk, Russian Federation

Conventional histopathologic and morphologic factors are widely used to predict poor prognosis in patients with superficial bladder cancer undergoing transurethral resection. However, this system fails to accurately predict behavior of most bladder tumors and needs additional factors. We have attempted to establish whether some genetic alterations are associated with unfavorable clinical phenotype (recurrence rate, invasion, high grade) and to determine prognostic significance of these genetic alterations. The panel included loss of heterozygosity at 3p, 9p, 9q, and p53 loci, activating mutation in 7 and 10 exons FGFR3 and RASSF1A, pl6, pl4, RARb, CDH1 promoter hypermethylation. 9p— locus deletions were significantly more frequent in tumors with high recurrence rate (within one year) (p = 0.0057). RASSF1A (p = 0.02) and p16 (p = 0.03) promoter hypermethylation was associated with invasion into lamina propria (pT1). FGFR3 mutations were not found in high grade tumors (G3) (p = 0.056), while 3p and 9q deletions and RARb hypermethylation were associated with high grade tumors (p = 0.026, p = 0.04 and p < 0.01, respectively). The discovered genetic alterations can be used as additional prognostic markers to predict tumor behavior more accurately.

Б. А. Бакиров, К. Р. Хабибуллина, Д. О. Каримов, Т. В. Викторова

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ (а и р) У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

Башкирский государственный медицинский университет, Уфа, Российская Федерация

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) — это неопластический процесс, первично возникающий в костном мозге в результате опухолевой трансформации клетки — предшественницы лимфопоэза. ХЛЛ является моделью преждевременной клеточной смерти или апоптоза. Регуляторами апоптоза являются такие цитокины, как факторы некроза опухолей (ФНО а и Р), которые оказывают влияние на пролиферацию опухолевых клеток. Целью исследования является поиск прогностических критериев развития хронического лимфолейкоза на основе выявления генотипов, позволяющих использовать их в качестве молекулярно-генетических маркеров. Материалом служили образцы ДНК (104 больных ХЛЛ и 101 здоровых индивидов контрольной группы), выделенные из лимфоцитов периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Изучались замены гуанина на аденин в положении — 308 промоторного участка гена фактора некроза опухолей а ( — 308С^Л) и замены аденина на гуанин в положении +252 первого интрона гена фактора некроза опухолей Р ( + 252Л^С). Для оценки риска заболевания по генотипу был вычислен показатель отношения шансов (ОР). Показано, что комбинации генотипов ТНР*11/ЬТ*22 и ТНР*22/ЬТ*22 ассоциированы с повышенным риском ХЛЛ (ОР = 2,07 и 4,66 соответственно). Установлено, что комбинации генотипов ТЫР*11/ЬТ*22 и ТЫР*12/ЬТ*12 являются генетическими маркерами развития прогрессирующей формы ХЛЛ (ОР = 2,88 и 1,88 соответственно).

B. A. Bakirov, K. R. Habibullina, D. O. Karimov, T. V. Viktorova

POLYMORPHISM OF TUMOR NECROSIS FACTOR (a and p) GENES IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA

Bashkir State Medical University, Ufa, Russian Federation

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a neoplastic process that occurs primarily in bone marrow as a result of tumor transformation of lymphopoiesis precursor cells. CLL is a model of premature cell death or apoptosis. Regulation of apoptosis is a function of cytokines such as tumor necrosis factor (TNF-a and P), which influence proliferation of tumor cells. The aim of our investigation was to study predictive criteria for development of various forms of CLL by identifying marker genotypes. DNA samples (104 CLL patients and 101 control patients) were extracted from peripheral blood lymphocytes by phenol-chloroform method. The guanine/ adenine transition in —308 promoter region of TNFa gene ( — 308G^A) and adenine/guanine transition in + 252 position of intron 1 of TNFP gene ( + 252A^G ) were investigated. Odds ratios (OR) were computed for estimation of genetic risk of disease. We observed association of TNF*11/LT*22 and TNF*22/LT*22 genotypes with the highest risk of CLL (OR = 2.07 and 4.66 respectively). We also found that combinations of genotypes TNF*11/LT*22 and TNF*12/LT*12 were genetic markers of progressive form of CLL (OR = 2.88 and 1.88, respectively).

Г. Бернингер1, Е. Ю. Чиркова2

FISH-ПРОБЫ БЕЗ ПОВТОРОВ «ПОСЕЙДОН» — НОВЫЙ СТАНДАРТ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

1 ««Kreatech Diagnostics», Амстердам, Нидерланды

2 «Медико-диагностическая лаборатория», Москва, Российская Федерация

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является распространенной методикой для визуализации хромосомных нарушений в молекулярной цитогенетике. В данном докладе мы представляем новые пробы in situ для исследований в области онкологии и гематологии, которые не содержат повторяющихся последовательностей, широко представленных в геномной ДНК человека. При использовании проб, представляющих собой исключительно уникальные последовательности, можно получить более яркий сигнал и меньший фон по сравнению с обычными пробами FISH. Более того, не требуется использование ДНК Cot-1. Наши пробы без повторов производятся с использованием запатентованной универсальной системы сшивания, которая является новым химическим методом введения флуоров и других меток в нуклеиновые кислоты. Мы покажем некоторые типичные примеры применения в онкологии наших FISH-проб без повторов «Посейдон».

H. Berninger1, E. Y. Chirkova2

POSEIDON REPEAT-FREE FISH PROBES - SETTING A NEW STANDARD IN IN SITU HYBRIDIZATION

1 Kreatech Diagnostics, Amsterdam, the Netherlands

2 MDL, Moskow, Russian Federation

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a common technology for visualizing chromosomal aberrations in molecular cytogenetics. We are presenting novel in situ probes for oncology and hematology research, which are free from repetitive sequences that are abundantly present in human genomic DNA. Probes that represent only unique sequences provide brighter signals and less background compared to conventional FISH probes. In addition, the use of Cot 1 DNA can be avoided. Our repeat-free probes are manufactured by the patented Universal Linkage System (ULS), which is a novel chemical method to introduce flours and other labels into nucleic acids. We shall show some typical applications of our Poseidon Repeat-Free FISH probes in oncology.

Т. А. Богуш, Е. А. Дудко, М. В. Тихомиров, А. Б. Равчеева, А. В. Конухова, Л. А. Бахтадзе, К. К. Лактионов, Б. Е. Полоцкий, М. И. Давыдов

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО: НАУЧНЫЕ ФАКТЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

В докладе обсуждаются данные литературы и результаты собственных многолетних исследований молекулярных маркеров множественной лекарственной резистентности (MDR), ассоциированной с экспрессией АВС-транспортеров и других транспортных белков, выбрасывающих ксенобиотики из

клеток, с точки зрения их клинической значимости. Рассматривается эволюция представлений о механизме функционирования и внутриклеточной локализации АВС-транспортеров в нормальных и опухолевых клетках, в частности роль транспортных белков в защите ядерных мишеней от токсических агентов, в том числе и противоопухолевых препаратов. Анализируются результаты собственных исследований экспрессии функциональной активности маркеров множественной лекарственной резистентности в клетках немелкоклеточного рака легкого, в которых определена частота экспрессии и ко-экспрессии разных транспортных белков (в частности, Pgp и MRP), выявлены новые характеристики и механизмы регуляции функционирования молекулярных маркеров лекарственной резистентности. Предложен алгоритм рутинной характеристики фенотипа множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого. Сформулированы основные направления фармакологической стратегии преодоления множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого, в частности при применении ингибиторов функции транспортных белков.

T. A. Bogush, E. A. Dudko, M. V. Tikchomirov, A. B. Ravcheeva, A. V. Konukhova, L. A. Bakhtadze, K. K. Laktionov, B. E. Polotsky, M. I. Davydov

MOLECULAR MARKERS OF MULTIDRUG RESISTANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER: SCIENTIFIC DATA AND THEIR CLINICAL IMPLICATIONS

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

This report discusses literature data and our own studies of molecular markers of multidrug resistance (MDR), associated with expression of ABC-transporters and other transport proteins, that extrude various substances out of the cell, in the context of clinical importance. Evolution of conception of functioning and intracellular localization of ABC-transporters in normal and malignant cells is considered, particularly the role of transport proteins in protection of nuclear targets from toxic agents, including anticancer drugs. The paper analyzes results of our own investigations in functional activity of MDR markers in non small cell lung cancer specimens as defined by expression and co-expression of various transport proteins (particularly Pgp and MRP). New characteristics and mechanisms of regulation and functioning of molecular markers of drug resistance are discovered. An algorithm is recommended for routine analysis of MDR phenotype in non small cell lung cancer. The authors have identified principal directions of pharmacological strategy to overcome MDR in non small cell lung cancer, in particular administration of transport protein function inhibitors.

Э. А. Брага1, В. И. Логинов1, И. В. Пронина1, Д. С. Ходырев1, Т. П. Казубская2,

В. Д. Ермилова2, Е. Р. Забаровский3, Р. Ф. Гарькавцева2

ОТ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНАХ 3-й ХРОМОСОМЫ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ К ОНКОМАРКЕРАМ

1 Государственный научно-исследовательский институт, генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Российская Федерация

2 ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

3 Центр микробиологии, клеточной биологии и биологии опухолей, Институт Каролинска,

Стокгольм., Швеция

С применением новых оригинальных NotI-микропанелей и системы из 24 полиморфных маркеров на коротком плече 3-й хромосомы локализованы кластеры генов, вовлеченных в развитие эпителиальных опухолей. Для 13 генов 3р (RASSF1A, RBSP3, NPRL2, SEMA3B, RARbeta2, GPX1, DAG1, RHOA, MST1R/ RON, USP4, W91914, NKiRAS1, ITGA9) показаны структурные и/или функциональные изменения (ко-пийности, метилирования промоторных областей, уровня мРНК).

Изменения в генах RASSF1A, RARbeta2, SEMA3B и RHOA были наиболее специфичны, и их наблюдали с наиболее высокой частотой — 50—80%. Так, методом полуколичественной ОТ-ПЦР выявлено частое

снижение уровня мРНК супрессорного гена SEMA3B (49%, 25/51) при почечно-клеточном раке (ПКР). Для протоонкогена RHOA показано частое повышение уровня мРНК при немелкоклеточном раке легкого (83%, 33/40). С помощью метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования для супрессорных генов RASSF1A, RARbeta2 и SEMA3B показано частое метилирование промоторных областей в опухолях разных локализаций, например при ПКР с частотой 81% (48/59), 59% (36/61) и 53% (46/86) соответственно. Причем локализованный нами истинно промоторный CpG-островок гена SEMA3B подвержен метилированию при ПКР в полтора раза чаще, чем исследованный ранее интронный островок (53% по сравнению с 38%). Для генов RARbeta2 и SEMA3B показана достоверная корреляция между частотой случаев с аномальным метилированием и прогрессией ПКР (степенью анаплазии и клинической стадией).

Следует отметить, что упомянутые гены участвуют в регуляции клеточного цикла, апоптоза, пролиферации, дифференцировки и ангиогенеза. Данные по гиперметилированию RASSF1A, RARbeta2 и SEMA3B и аномальной экспрессии SEMA3B и RHOA можно использовать для разработки новых опухолеспецифичных маркеров для ранней диагностики и прогноза эпителиальных опухолей.

E. A. Braga1, W. I. Loginov1, I. V. Pronina1, D. S. Hodyrev1, T. P. Kazubskaya2, V. D. Ermilova2, E. R. Zabarovsky3, R. F. Garkavtseva2

FROM STRUCTURE-FUNCTIONAL ALTERATIONS IN CHROMOSOME 3 GENES IN EPITHELIAL TUMORS TO ONCOMARKERS

1 Russian State Genetics Centre "GosNIIgenetika", Moscow, Russian Federation

2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

3 Microbiology, Cell Biology and Tumour Biology Centre, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

Clusters of tumor significant genes were localized in the chromosome 3 short arm using novel original Notl-micro arrays and a system of 24 polymorphic markers. Structural and/or functional alterations (of gene copy number, promoter region methylation and mRNA level) were shown for 13 genes of 3p (RASSF1A, RBSP3, NPRL2, SEMA3B, RARbeta2, GPX1, DAG1, RHOA, MST1R/RON, USP4, W91914, NKiRASl, ITGA9).

Alterations in RASSF1A, RARbeta2, SEMA3B and RHOA were highly specific and observed at the highest frequencies of 50 — 80%. For instance, decrease in mRNA level of SEMA3B tumor suppressor gene was detected at a 49% (25/51) frequency in renal cell carcinoma (RCC) using semi-quantitative RT-PCR. A frequent (83%, 33/40) increase in mRNA level was revealed for RHOA protooncogene in non-small cell lung carcinoma. Hypermethylation of promoter regions of RASSF1A, RARbeta2 and SEMA3B suppressor genes was found with high frequencies in tumors of various locations using methyl specific PCR and bisulfate sequencing. For example, in RCC the hypermethylation was found with frequencies 81% (48/59), 59% (36/61) and 53% (46/86), respectively. Of interest, true promoter SEMA3B CpG-island, localized by us, was methylated in RCC 1.5-fold more frequently than the earlier studied intronic island (53% vs. 38%). There was a significant correlation between the RARbeta2 and SEMA3B methylation frequencies and RCC progression (grade and stage).

Of importance, the mentioned genes are known to be involved in regulation of cell cycle, apoptosis, proliferation, differentiation and angiogenesis. The data on RASSF1A, RARbeta2and SEMA3B hypermethylation and RHOA and SEMA3B expression alterations can be used to design novel tumor specific markers for early diagnosis and prognosis of carcinomas.

А. Н. Грачев, Ю. Г. Кжышковска ИММУНОТЕРАПИЯ ОПУХОЛЕЙ: ОТ КЛЕТОК К ЦИТОКИНАМ

Медицинский факультет. Маннгейма, Гейдельбергский университет, Маннгейм, Германия

Начиная с 70-х гг. прошлого века исследователи всего мира пытаются использовать возможности иммунной системы при лечении злокачественных опухолей. Одна из первых клеточных иммунотерапий использовала цитотоксические свойства основного клеточного компонента врожденного иммуни-

тета — макрофагов. Их получали из моноцитов периферической крови, активировали бактериальными продуктами in vitro и вводили в кровоток пациента. К концу 80-х гг. стало ясно, что данный подход ожидаемых результатов не дает, и дальнейшая работа была сконцентрирована на использовании способности макрофагов и дендритных клеток презентировать антиген и активировать систему приобретенного иммунитета. Однако и эта стратегия до сих пор не увенчалась успехом. Так в чем же причина подобной устойчивости опухоли к активности иммунной системы?

Исследования показывают, что опухоль представляет собой не просто конгломерат опухолевых клеток, а содержит большое количество клеток стромы. Основным иммунным компонентом опухоли являются опухоль-ассоциированные макрофаги, которые не обладают цитотоксическими свойствами и не подавляют рост опухоли, а напротив, способны инактивировать противоопухолевую активность как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Фенотип этих макрофагов соответствует фенотипу макрофагов второго типа, получаемых в культуре при дифференцировке из моноцитов под воздействием цитокинов IL-4, IL-13, IL-10, TGF-P и таких иммунносупрессоров, как глюкокортикоиды и ретиноиды. При том что общей чертой различных популяций макрофагов второго типа является отсутствие продукции провоспалительных цитокинов, эти макрофаги имеют целый ряд молекулярных и функциональных различий. Так, IL-4 подавляет фагоцитарную и бактерицидную активность макрофагов, в то время как глюкокортикоиды стимулируют фагоцитарную и эндоцитарную активность макрофагов.

Молекулярные различия между популяциями макрофагов заключаются, прежде всего, в продукции цитокинов и хемокинов, определяющих тип иммунного ответа. Нами была исследована способность макрофагов менять свой фенотип в зависимости от микроокружения. Мы обнаружили, что независимо от условий, в которых макрофаги дифференцировались, они способны активно реагировать на бактериальные продукты и переходить в состояние активной стимуляции воспаления. Так же макрофаги, имеющие воспалительный фенотип, способны под воздействием IL-4 переходить в состояние макрофагов второго типа и подавлять развитие воспалительной реакции. Использование растворимых факторов, таких, как цитокины, растворимые рецепторы и антитела, для воздействия на функцию опухоль-ассоциированных макрофагов позволит лишить опухоль иммунологической защиты и повысить эффективность лечения. Для разработки подобных стратегий необходимы интегрирование уже существующих данных об активностях макрофагов и разработка математических моделей функционирования макрофагов, учитывающих индивидуальные особенности пациентов.

A. N. Gratchev, J. G. Kzyhskowska TUMOUR IMMUNOTHERAPY: FROM CELLS TO CYTOKINES

Medical Faculty Mannheim, University of Heidelberg, Mannheim, Germany

Starting from the 70s of the last century researchers all over the world have been trying to use capacity of immune system for the treatment of malignant tumours. One of the first cell-based immunotherapies used cytotoxic properties of the main cellular component of innate immunity — the macrophage. Monocyte-derived macrophages were treated with bacterial products to induce cytotoxic activities and re-injected into the patient's blood stream. At the end of the 80s it became clear, that this strategy did not bring expected results. Therefore all further work was concentrated on the usage of antigen presenting properties of macrophages and dendritic cells and their ability to stimulate adaptive immunity. However this strategy was unsuccessful as well. What is the reason for such immunologic resistance of tumour?

It is well established that tumour is composed not solely of tumour cells, but contains a large amount of stroma cells. The main immune component of the tumour is represented by tumour-associated macrophages that do not have cytotoxic activity and do not suppress tumour growth, but are able to inactivate anti-tumour activity of innate and adaptive immunity. Phenotype of these macrophages corresponds to the phenotype of type 2 macrophages that can be generated in culture by stimulating monocytes by IL-4, IL-13, IL-10, TGF-P and such immunosuppressors as glucocorticoids and retinoids. The common property of different subtypes of type

2 macrophages is the lack of inflammatory cytokine production. However there are numerous molecular and functional differences. For example IL-4 inhibits phagocytic and bactericidal activities of macrophages, while glucocorticoids stimulate phagocytic and endocytic activities.

Molecular differences between macrophage subpopulations encompass first of all the spectrum of produced cytokines and chemokines that defines the type of immune response. We investigated the ability of macrophages to change their phenotype in response to changes in the microenvironment. We found that independent of differentiation conditions macrophages were able to react to bacterial products by active stimulation of inflammation. Similarly stimulation by IL-4 induces anti-inflammatory activity in all populations of

macrophages. This phenotypic plasticity prompts to use soluble factors i.e. cytokines, soluble receptors and antibodies to influence functions of tumour-associated macrophages for inactivation of immunologic protection of tumours and improvement of treatment efficiency. To develop such therapeutic strategies it is essential to integrate already available data on macrophage activity and to create a mathematical model of macrophage functioning that will take into account individual genetic pattern of the patient.

Л. Е. Гуревич

РОЛЬ ПОЛИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК В НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ОПУХОЛЕЙ

ГУ Московский научно-исследовательский клинический институт, им.. М. Ф. Владимирского,

Москва, Российская Федерация

Выделяют два типа стволовых клеток: малочисленная популяция долгоживущих элементов с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки (истинные стволовые клетки) и более многочисленная популяция короткоживущих элементов, которые происходят от первых и способны к диф-ференцировке в тканевые предшественники. В организме человека тканевые полипотентные клетки существуют в разных органах: костном мозге, ЖКТ, коже, центральной нервной системе, скелетных мышцах, печени, поджелудочной железе и других. Эти клетки играют ключевую роль при физиологической, репаративной регенерации, неопластической трансформации.

Онкологическая патология поджелудочной железы (ПЖ), одновременно эндо- и экзокринного органа, представляет уникальные возможности для изучения иммунофенотипа и фенотипической изменчивости полипотентных клеток, трансформации одних клеточных типов в другие. Полипотентные клетки ПЖ локализуются в протоках и экспрессируют цитокератины 7, 8, 18 и 19. Под воздействием экзо- и эндогенных факторов они дифференцируются в ацинарные и эндокринные клетки, которые экспрессируют только цитокератины 8, 18.

На ранних этапах дифференцировки предшественников наблюдается коэкспрессия цитокератинов и виментина, что характерно для недифференцированных (анапластических) карцином ПЖ. Более всего иммунофенотипу полипотентных клеток соответствует иммунофенотип аденокарцином ПЖ (ЦК 7 + /ЦК19 + ), которые отличает крайне агрессивное клиническое течение. На более поздних этапах дифференцировки отмечается коэкспрессия экзокринных (цитокератина 19, ЭМА, муцинов) и нейроэндокринных маркеров (синаптофизина, хромогарнина А), что часто характерно для клеток смешанных экзоэндокринных и злокачественных нейроэндокринных опухолей ПЖ. Смешанные опухоли ПЖ часто возникают в рамках наследственных синдромов (МЭН-1, Гиппеля—Линдау, туберозном склерозе), когда происходит неконтролируемая пролиферация полипотентных клеток.

В 1990-х гг. Reubi и соавт. описали пять типов рецепторов к соматостатину, наличие которых на клетках НЭО ЖКТ является молекулярной мишенью для клинического использования аналогов со-матостатина при лечении соответствующих злокачественных опухолей. Изучение иммунофенотипа тканевых полипотентных клеток важно для практической онкологии, поскольку позволяет оценить степень дифференцировки, биологический потенциал, степень злокачественности опухолей и выбрать оптимальную тактику лечения.

L. E. Gurevich

POLYPOTENT CELLS IN PANCREAS NEOPLASTIC TRANSFORMATION. MOLECULAR MARKERS IN DEFINING DIFFERENTIATION STATE AND MALIGNANCY RATE OF TUMORS

M. F. Vladimirsky Moscow State Clinical Scientific Institute, Moscow, Russian Federation

There are two types of stem cells, i.e. a low-abundant population of long-living elements with high potential for proliferation and differentiation (true stem cells) and a more abundant population of short-living elements, originating from the former population that can differentiate into tissue precursors. Tissue polypotent cells exist in various human organs such as bone marrow, gastrointestinal tract (GIT), skin, central nervous system, skeletal muscles, liver, pancreas, etc. These cells play a key role in physiological and reparative regeneration, and also in neoplastic transformation.

Oncopathology of pancreas (simultaneously an endo-, and an exocrine organ) provides unique opportunity to study immunophenotype and phenotypical variability of polypotent cells, transformation of one cell type into another. Pancreatic polypotent cells are localized in ducts and express cytokeratins 7, 8, 18 and 19. They can differentiate into acinar and endocrine cells, expressing only cytokeratins 8 and 18, when stimulated by exo- and endocrine factors.

Vimentin and cytokeratin co-expression can be seen in early stages of precursor differentiation, and this property is common for undifferentiated (anaplastic) pancreatic carcinomas. Immunophenotype of highly aggressive pancreatic adenocarcinomas (CK7 + /CK19 + ) corresponds to the immunophenotype of polypotent cells. Later stages of differentiation are associated with co-expression of exocrine (cytokeratine 19, EMA, mucins) and neuroendocrine markers (synaptofisin, chromogarnin A), that is often typical for cells of mixed endo-and exocrine, and neuroendocrine malignant tumors of the pancreas. Mixed tumors of the pancreas often arise in the context of hereditary syndromes (MEN-1, von Hippel — Landau, tuberous sclerosis), when uncontrolled proliferation of polypotent cells occurs.

In the 1990s Rheubi et al. described five somatostatin receptor types that, if expressed on cells of GIT neuroendocrinal tumors, can be molecular target for somatostatin analogs in the treatment of these tumors. Study of polypotent cell immunophenotype is of much importance for practical oncology, because it helps to define tumor differentiation state, biological potential, malignancy rate and to choose an optimal therapy strategy.

А. С. Дворников1, В. А. Рыбко2 ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ ДЕРМАТОЗЫ: АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

1 Российский государственный медицинский университет, Москва, Российская Федерация

2 ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

К кожным паранеоплазиям относят характерные симптомокомплексы высыпаний, которые могут предшествовать или сопутствовать выявлению злокачественных опухолей или развиваться позже, в том числе в процессе лечения основного заболевания. Специфические поражения кожных покровов могут указывать на наличие у пациента злокачественного новообразования внутренних органов, в том числе на ранней стадии его развития без четко выраженных клинических проявлений и жалоб, характерных для органной патологии. В развитии паранеопластических синдромов в первую очередь придают значение гуморальным факторам, обусловленным секреторной активностью клеток опухолей (например, карциноидный синдром, глюкагономный синдром и т. д.) или иммунным ответом организма на антигены опухолевых клеток (паранеопластическая пузырчатка). Кроме того, по неизвестной причине некоторые воспалительные и пролиферативные дерматозы с повышенной частотой выявляются у пациентов со злокачественными опухолями внутренних органов (например, синдром Свита, гангренозная пи-

одермия). Они обычно протекают тяжелее, чем без сопутствующей опухоли. Скорее всего, это определяется генетически обусловленной предрасположенностью пациента к развитию паранеопластических кожных синдромов.

В клинической практике остро стоит вопрос о получении достоверных тестовых систем, дающих возможность дерматологу верифицировать наличие онкопатологии у пациента. Перспективным в данном случае представляется исследование белков сыворотки крови с помощью масс-спектрометрических методов. Мультифакторные механизмы возникновения и прогрессии онкопатологии требуют исследования панелей молекулярных маркеров для верификации риска возникновения, точной диагностики опухолевого процесса и индивидуального прогноза его течения.

A. S. Dvornikov1, V. A. Rybko2 PARANEOPLASTIC DERMATOSES: AN ACTUAL PROBLEM

1 Russian State Medical University, Moscow, Russian Federation

2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

There is a large class of cutaneous paraneoplastic syndromes correlating with many oncological diseases. These skin lesions can serve as specific early markers of cancer progression. Special types of dermatosis may serve as signs of malignancy, even at early stages of oncological disease without any clinical signs or patient's complaints, pathognomic for particular organ pathology. The genesis mechanisms of these syndromes are poorly understood, but there is evidence that the immune system may play a crucial role in this process. Immune reaction against tumor antigens is the cause of dermatosis in case of paraneoplastic bullous pemphigoid. Several syndromes are linked with secretory activity of malignant cells, as in case of carcinoid or glucagon syndromes. Development of such paraneoplastic syndromes may be related to patient's genetic predisposition to these reactions.

It is utterly important to develop tests to verify the presence of malignancy in patients with specific cutaneous lesions in the clinical practice. Mass-spectrometry of blood serum is a very promising method in this case. Complex mechanisms of cancer emergence and progression require development of molecular marker panels to evaluate cancer risk and to make accurate diagnosis and individual prognosis of the course of disease. Therefore, recognition of dermatologic paraneoplastic symptoms and syndromes contributes to the clinicians' oncologic alarm and can help to cure cancer patients.

А. И. Дмитриева12, В. В. Новицкий1, Н. В. Севостьянова1,2,

С. А. Коломиец2, В. А. Авхименко2

ПОЛИМОРФИЗМ GSTT1 И GSTM1У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО

1 ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет. Росздрава, Томск,

Российская Федерация

2 ОГУЗ Томский областной онкологический диспансер, Томск, Российская Федерация

Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 (нулевые и нормальные аллели обоих генов) был проанализирован у 255 больных раком легкого (РЛ). В качестве группы сравнения была использована выборка здоровых жителей г. Томска (n = 231). Средний возраст (±SD) больных РЛ составил 56,5 ± 8,7 года, здоровых индивидов 49,5 ± 5,4 года. В выборке РЛ было 232 мужчины и 23 женщины, в выборке здоровых жителей г. Томска было 141 мужчина и 89 женщин. Частота нулевого генотипа гена GSTT1 (48,6%) у больных раком легкого статистически значимо превышала аналогичный показатель у здоровых лиц (18,2%) (р = 0,0001) (OR = 4,26 раза, 95% ДИ 2,76—6,59). Сравнительный анализ частот нулевых генотипов гена GSTM1 показал, что частота GSTM1 0/0 у больных РЛ выше, чем в контроле (61,2 и 40,3%, соответственно, р = 0,0001) (OR = 2,34, 95% ДИ 1,60—3,42). У больных РЛ с метастазами частота GSTT1 регистрировалась значительно чаще, чем у больных без метастазов (55,5 и 40,7% соответственно; с2 = 4,71; р = 0,029). Следует отметить также, что для 0/0-генотипа GSTM1 была установлена

тенденция к увеличению нуль-генотипов у больных раком легкого с метастазами (66,4 и 55,1% соответственно; с2 = 2,7; p = 0,085). Данные, полученные в ходе исследования, указывают на наличие связи нулевых генотипов исследованных генов (GSTT1 0/0, GSTM1 0/0) с риском развития рака легкого.

A. I. Dmitrieva1,2, V. V. Novitski1, N. VSevostyanova1,2, S. A. Kolomiets2, V. A. Avkhimenko2

POLYMORPHISM OF GSTT1 AND GSTM1 GENES IN LUNG CANCER

1 Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation

2 Tomsk Regional Oncology Dispensary, Tomsk, Russian Federation

Polymorphism of GSTT1 and GSTM1 biotransformation genes (null and normal alleles in both genes) was analyzed in 250 lung cancer patients. Healthy individuals (n = 231) served as a control group to compare frequencies of alleles and genotypes of the studied genes with those in lung cancer patients. Median age (±SD) of lung cancer patients was 56 + 8.7 yrs, median age of healthy individuals was 49 + 5.4 yrs. There were 23 women and 232 men with lung cancer. The control group consisted of 141 men and 89 women. The frequency of GSTT1 0/0 gene was significantly higher in lung cancer patients than in healthy individuals (48.6 and 18.2%, respectively; p = 0.0001) (OR = 4.26; 95%CI 2.76 — 6.59). The frequency of GSTM1 0/0 gene was 61.2% in lung cancer patients and 40.3% in the control group (p = 0.0001) (OR = 2.34; 95%CI 1.60 — 3.42). The frequency of homozygous alleles of GSTT1 0/0 was significantly higher in lung cancer patients with metastases than in lung cancer patients without metastases (55.5 and 40.7%, respectively; p = 0.026). It should be noted that similar observations were registered for GSTM1 0/0 (66.4 and 55.1%, respectively; p = 0.08). Therefore, high frequency of GSTT1 0/0 and GSTM1 0/0 in lung cancer patients allows prognosis of disease outcome and identification of groups at risk of cancer.

Д. Довжанский, Н. Лазар, К. Феликс, Д. Крысько, Б. Штрауб, М. Бюхлер, Й. Вернер

МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ КОННЕКСИНА 43 РЕДУЦИРУЕТ РОСТ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Клиника общей, висцеральной и трансплантационной медицины. Гейдельберккого университета,

Гейдельберг, Германия

Нарушение синтеза коннексинов и формирования гэп-соединений характерно для многих опухолевых процессов. Нами изучалось влияние модулирования систеза коннексинов на свойства роста раковых клеток поджелудочной железы in vitro. С этой целью проводилось воздействие на клеточные линии T3M4, ASPC и Panc-1 этаблированными стимуляторами коннексинов: 4-фенилбутиратом (4-ФБ) и рети-ноевой кислотой (РК). Пролиферация опухолевых клеток после воздействия на клетки вышеуказанными веществами изучалась с помощью анализа MTT. Количественная (вестерн-блот) и качественная (иммунная флуоресценция) детекция синтеза и локализации коннексина 43 в опухолевых клетках сравнивалась с функцией гэп-соединений (трансфер кальцеина, измеренный с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии).

4-ФБ и РК способствовали уменьшению пролиферации опухолевых клеток с максимальным эффектом в 23,7 + 4,2% наблюдений (ASPC), 12,5 + 3,3% (T3M4) и 52,5 + 5,1% (Panc-1) при использовании 3,5 мМ раствора 4-ФБ и в 83,6+4,2% (T3M4) и 57,8 + 4,2% (Panc-1) при использовании 25 мМ раствора РК, а также в 13,8 + 4,1% (ASPC) при использовании 100 мМ раствора РК. При этом воздействие 4-ФБ и РК приводило к увеличению синтеза коннексина 43 в клетках T3M4 (при использовании 1 мМ раствора 4-ФБ до

2,8 раза и 10 мМ раствора РК до 2,7 раза). В то же время заново синтезированный коннексин оставался в цитоплазме опухолевых клеток и не транспортировался к клеточной мембране. Модулирование синтеза коннексинов не приводило к улучшению функции гэп-соединений ни в одном из проводимых экс-

периментов. Модулирование синтеза коннексинов коррелирует с уменьшением пролиферации опухолевых клеток. Нарушение транспорта коннексинов из цитоплазмы к клеточной мембране может объяснить отсутствие улучшения функции гэп-соединений в панкреатических опухолевых клетках.

D. Dovjanskii, N. Lazar, K. Felix, D. Krysko, B. Shtraub, M. Buechler, J. Werner

MODULATION OF CONNEXIN43 EXPRESSION REDUCES GROWTH OF PANCREATIC TUMOR CELLS

Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, Heidelberg University Hospital, Heidelberg, Germany

Abnormalities in connexins synthesis and gap junctions formation are typical for many tumour processes. We studied the influence of modulation of connexins synthesis on growth characteristics of pancreatic tumour cells in vitro. For this purpose, cell lines T3M4, ASPC and Panc-1 were treated with common stimulators of connexins: 4-phenylbutyrate (4-PBA) and retinoic acid (RA). Proliferation of tumour cells after treatment was studied using MTT assay. Quantitative (using western-blot) and qualitative (using immunofluorescence) detection of synthesis and localization of connexin 43 in tumour cells was compared with gap junction functioning (calcein transfer measured using flow cytometry and fluorescent microscopy).

4-PBA and RA promoted decrease in tumour cells proliferation with strongest effect of 23.7 ± 4.2% (ASPC), 12.5 ± 3.3% (T3M4) and 52.5 ± 5.1% (Panc-1) using 3.5 mM solution of 4-PBA and of 83.6 ± 4.2% (T3M4) and

57.8 ± 4.2% (Panc-1) using 25 mM solution of RA, and of 13.8 ± 4.1% (ASPC) using 100 mM solution of RA. In this process, treatment with 4-PBA and RA led to increase in connexin 43 synthesis in T3M4 cells (by 2.8 times using

1 mM solution of 4-PBA and by 2.7 times using 10 mM solution of RA). At the same time, newly synthesized connexins remained in the cytoplasm of tumour cells and were not transported to plasma membrane. Modulation of connexins synthesis did not improve gap junctions functioning in any of the experiments. Modulation of connexins synthesis correlated with decrease in tumour cells proliferation. Impairment of connexins transport from cytoplasm to cell membrane can explain absence of improvement in gap junctions functioning in pancreatic tumour cells.

А. А. Должиков1,2, А. В. Иванов3, И. Н. Должикова1

ВЗАИМОСВЯЗИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

1 Белгородский государственный университет, Белгород, Российская Федерация

2 Белгородское областное патологоанатомическое бюро, Белгород, Российская Федерация

3 Курский государственный медицинский университет, Курск, Российская Федерация

Исследовано 1044 случая операбельного рака молочной железы. Иммуногистохимически определена экспрессия рецепторов эстрогенов (ЕЯ), прогестерона (РЯ), Ю-67, Нег2/пеи. БЯ-позитивные случаи составили 62,7%, РЯ-позитивные — 58,7%. При корреляционном анализе установлена средняя прямая связь между экспрессией ЕЯ и РЯ (г = 0,57). В возрасте до 35 лет БЯ-позитивные случаи составили 33,3%, РЯ-позитивные — 36,1%, статус БК + РЯ+ наблюдался лишь в 25,0%, а 58,3% составили наблюдения полного рецепторного негатива. Гиперэкспрессия Нег2/пеи в группе без неоадъювантной терапии составила в целом 14,5%. После неоадъювантной терапии ее частота увеличилась до 20,7%, в большей степени в возрастной группе до 55 лет (24%; в группе старше 55 лет — 17,9%). Достоверно чаще гиперэкспрессия Нег2/пеи наблюдается при статусе БЯ-РЯ- (20,9—26,1%). При БК-РК + она встречалась в 2—3 раза чаще, чем при БЯ+ РЯ-. В группе молодых пациенток (до 35 лет) гиперэкспрессия Нег2/пеи в целом выявлена у 16,7%, а при ЕЯ-РЯ-у 23,8%. В группах с БК + РЯ+ высокий уровень пролиферативной ак-

тивности (более 30% К1-67-позитивных клеток) выявлен только в 20% случаев. Напротив, при ЕЯ-РЯ-в 60,9% случаев имелся высокий уровень пролиферации. Корреляция между экспрессией ЕЯ, РЯ и К1-67 оказалась обратной (г = -0,46 и -0,40). Среди случаев с гиперэкспрессией Нег2/пеи более чем в 70% выявлен высокий индекс К1-67, однако линейной корреляции между данными показателями нет (г = 0,07).

A. A. Dolzhikov1,2, A. V. Ivanov3, I. N. Dolzhikova1 INTERRELATIONS OF BIOLOGICAL MARKERS IN BREAST CANCER

1 Belgorod State University, Belgorod, Russian Federation

2 Belgorod. Regional Pathology Department, Belgorod, Russian Federation

3 Kursk State Medical University, Kursk, Russian Federation

We studied 1044 cases with operable breast cancer. Expression of estrogen (ER) and progesterone (PR) receptors, Ki-67, Her2/neu was detected immunohistochemically. 62.7% of cases were ER-positive and 58.7% cases were PR-positive. Correlation analysis discovered average direct relationship between ER and PR expressions (r = 0.57). In the group under 35 years of age 33.3% of patients were ER-positive and 36.1% were PR-positive, ER + PR+ status was observed only in 25.0%, while 58.3% of cases were fully negative. Her2/neu overexpression in the group without neoadjuvant therapy was observed in 14.5% of cases. After neoadjuvant therapy the rate increased to 20.7%, to a greater extent in patients under 55 years (24% vs. 17.9% in patients above 55 years of age). Her2/neu overexpression was significantly more frequent in ER—PR— cases (20.9 to 26.1%). In ER—PR+ cases it was detected 2-3-fold more frequently than in ER+PR— patients. Among young (under 35 years) patients Her2/neu overexpression was found in 16.7% of cases in the group as a whole and in 23.8% in the ER—PR— subgroup. In ER + PR+ groups high proliferation activity (more than 30% of Ki-67-positive cells) was observed only in 20% of cases, cf. 60.9% in ER—PR— patients. Correlations between expressions of ER, PR and Ki-67 were inverse (r = —0.46 and —0.40). More than 70% of cases with Her2/neu overexpression had high Ki-67 index, though there was no linear correlation between these factors (r = 0.07).

Н. В. Жарков, Г. А. Хамидуллина, И. М. Жаркова

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ Е-КАДХЕРИНА И БЕЛКА р53 В КОЛОРЕКТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ С РАЗНЫМ КОЛИЧЕСТВОМ ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННЫХ МАКРОФАГОВ

Казахский НИИ онкологии и радиологии, Алматы, Республика Казахстан

Одним из маркеров прогрессии опухоли является снижение экспрессии Е-кадхерина (E-cad). Образование эпителиального пласта (развитие межклеточных контактов) коррелирует с накоплением белка p53 дикого типа, в то время как снижение экспрессии E-cad, наоборот, вызывает дестабилизацию и возникновение и накопление мутантного белка p53, и, как следствие, ингибируется апоптоз опухолевых клеток. Кроме того, в строме опухоли всегда присутствуют макрофаги, которые продуцируют широкий спектр различных веществ, в том числе и протеазы, способные расщеплять E-cad [C. E. Lewis, J. W. Pollard, 2006].

Цель исследования — выявить зависимость между уровнем экспрессии E-cad, белка p53 и количеством макрофагов (CD68 + ) в колоректальных опухолях (КО). По типу экспрессии Е-cad КО (n = 70) были разделены на 2 группы: с нормальной (группа 1) и аномальной (группа 2) экспрессией E-cad. Подсчет количества клеток CD68+ и E-cad+ проводился в 10 полях зрения при увеличении х400.

Нормальная экспрессия E-cad сохранялась в 19 из 70 КО (27,1%). У 51 больного с КО (72,9%) отмечались различные аномалии в экспрессии E-cad, такие, как цитоплазматическая, гетерогенная и мембранно-редуцированная экспрессия. В группе с нормальной экспрессией E-cad среднее количество клеток CD68+ составило 645,14 + 28,56. В группе с аномальной экспрессией E-cad количество клеток CD68+ было в 1,5 раза больше и составило 1348,28 + 14,82. Кроме того, в группе 1 в 13 из 19 (72,2%) КО экспрессия E-cad отмечалась более чем в 80% опухолевых клеток. В группе 2 экспрессия E-cad более чем в 80% клеток наблюдалась лишь в 8 из 51 КО (16,0%). Возрастание числа опухолей с аномальной экспрессией E-cad, ассоциированное с увеличением количества клеток CD68 + , является статистически досто-

верным (р < 0,005). Средний процент р53+ клеток в группе с нормальной экспрессией E-сad составил 32,3%. А в группе с аномальной экспрессией E-сad — 59,8%. Различия также статистически достоверны (р = 0,015). Отмечена отрицательная корреляционная зависимость между уровнем экспрессии Е-cad и количеством клеток СБ68 + (г = -0,401, р = 0,018) и уровнем экспрессии Е-cad и гиперэкспрессией белка р53 мутантного типа в опухолях толстой кишки (г = -0,373, р = 0,028). Между гиперэкспрессией р53 и количеством клеток СБ68+ имеется прямо пропорциональная зависимость (г = 0,389, р = 0,023).

Таким образом, опухоль-ассоциированные макрофаги, инфильтрирующие КО, могут непосредственно снижать уровень межклеточной адгезии и стимулировать накопление мутантного белка р53 в опухолевых клетках при колоректальном раке, тем самым повышая их злокачественный и метастатический потенциал.

N. V. Zharkov, G. A. Khamidullina, I. M. Zharkova

THE CHANGES OF E-CADHERIN AND p53 PROTEIN EXPRESSION IN COLORECTAL TUMOURS WITH DIFFERENT QUANTITY OF TUMOUR-ASSOCIATED MACROPHAGES

Kazakh Research. Institute of Oncology and Radiology, Almaty, Kazakhstan

One of the tumors progression marker is decrease in E-cadherin (E-cad) expression. Formation of epithe-lian layer (development of intercellular contacts) correlates with accumulation of wild type p53 protein, while downregulation of E-cad on the contrary is destabilizing, leads to emergence and accumulation of mutant p53 protein and, as a consequence, inhibition of apoptosis in tumour cells. Besides, macrophages are always present in tumor stroma, which produce a wide spectrum of various substances including protease, capable to split the E-cad [C. E. Lewis,J. W. Pollard, 2006].

The purpose of the study was to reveal dependences between level of expression of E-cad, p53 protein and quantity of tumor-associated macrophages (CD68+ cells) in colorectal tumours. By type of expression of E-cad all colorectal tumors (n = 70) were divided into 2 groups: with normal (group 1) and abnormal (group 2) expression of E-cad. Calculation of quantity of CD68+ and E-cad+ cells was performed on 10 fields of vision at magnification x400.

Normal expression of E-cad was observed in 19 of 70 CT (27.1%). 51 patients with colorectal cancer (72.9%) had marked anomalies in expression of E-cad, such as cytoplasmic, heterogeneous and membrane-reduced expression. In the group with normal expression of E-cad average quantity of CD68+ cells was 645.14 ± 28.56. In the group with abnormal expression of E-cad quantity of CD68+ cells was 1.5-times higher and reached 1348.28 ± 14.82. Besides, in group 1 expression of E-cad on more than 80% of tumour cells was marked in 13 of 19 colorectal tumors (72.2%). While in group 2 expression of E-cad on more than 80% of tumour cells remained only in 8 of 51 colorectal tumors (16.0%). Increase in the number of tumors with abnormal expression of E-cad associated with increase in quantity of CD68+ cells was statistically significant (p < 0,005). The average percent of p53+ cells in the group with normal expression of E-cad was 32.3%, and in the group with abnormal expression of E-cad reached 59.8%. The difference was statistically significant (p = 0.015). Negative correlation between level of expression of Е-cad and quantity of CD68+ cells (r = —0.401, p = 0.018) and between level of expression of Е-cad and overexpression of mutant p53 protein in colorectal tumors (r = —0.373, p = 0.028) was observed. There was a directly proportional dependence (r = 0.389, p = 0.023) between overexpression of p53 protein and quantity of CD68+ cells.

Therefore, tumor-associated macrophages infiltrating colorectal tumors can reduce intercellular adhesion and stimulate accumulation of mutant p53 protein in colorectal cancers thereby raising their malignant and metastatic potential.

Е. Н. Имянитов

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

НИИ онкологии им.. Н. Н. Петрова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Наиболее ясное обобщение признаков злокачественной трансформации представлено в работе основоположников молекулярной онкологии D. Hanahan и R. Weinberg, появившейся на страницах первого номера журнала «Cell» за 2000 г. и немедленно ставшей «классической». По мнению авторов, все или почти все опухоли характеризуются несколькими неотъемлемыми чертами, а именно: 1) самодостаточностью в отношении сигналов пролиферации, связанной с аутопродукцией факторов роста, соответствующих рецепторов или других компонентов сигнального промитотического каскада; 2) потерей чувствительности к сигналам, сдерживающим процесс пролиферации, обусловленной инактивацией супрессорных (антимитотических) белков; 3) замедлением процессов программируемой клеточной гибели, опосредованным дисбалансом биохимической регуляции процессов апоптоза; 4) неограниченным репликативным потенциалом клеток (преодолением «лимита Хэйфлика»), сопряженным с реактивацией экспрессии фермента теломеразы, и, как следствие, отсутствием физиологического укорачивания теломер; 5) стимуляцией процессов ангиогенеза в опухоли, вызванной экспрессией трансформированными клетками ангиогенных факторов и направленной на удовлетворение повышенных потребностей быстроделящихся неопластических компонентов в оксигенации; 6) способностью к инвазии и метастазированию, ассоциированной с продукцией опухолью гистолитических ферментов (протеаз), а также факторов, угнетающих локальный иммунитет; 7) геномной нестабильностью, опосредованной инактивацией систем репарации ДНК и нарушениями в молекулярном контроле клеточного цикла; 8) перестройкой стромальных компонентов, создающей более благоприятные условия для эволюции злокачественного клона.

Причиной приобретения подобных признаков являются соматические мутации, активирующие онкогены и инактивирующие гены-супрессоры. Помимо генов, кодирующих белки, в канцерогенезе принимают участие микроРНК — короткие некодирующие олигонуклеотиды, способные угнетать трансляцию и/или вызывать деградацию кодирующих РНК посредством связывания с комплементарными участками последних. Представления о механизмах рака постоянно эволюционируют. К наиболее сенсационным открытиям последних лет следует отнести гипотезу о существовании стволовых опухолевых клеток, демонстрацию паракринных взаимоотношений между первичной опухолью и ее метастазами, а также свидетельства о длительной персистенции «дремлющих» опухолевых клеток в организме излеченных онкологических пациентов.

E. N. Imyanitov FUNDAMENTAL REGULARITIES OF TUMOUR GROWTH

N. N. Petrov Institute of Oncology, St. Petersburg, Russian Federation

The most clear review of malignant transformation signs is presented in the work of founders of molecular oncology, D. Hanahan and R. Weinberg. This work was published in first issue of "Cell" in 2000, and instantly became classic. According to the authors, all or almost all tumours are marked with several essential features, namely 1) self-sufficiency in growth signals due to self-production of growth factors, corresponding receptors or other components of promitotic cascade; 2) insensitivity to anti-growth signals due to inactivation of suppressor (antimitotic) proteins; 3) suppression of programmed cell death due to imbalance in biochemical regulation of apoptosis; 4) limitless replicative potential of cells (overcoming "Hayflick limit") coupled with reactivation of telomerase and, consequently, absence of physiological telomere shortening; 5) sustained angiogenesis in tumour due to expression of angiogenic factors by tumour cells and aimed at satisfaction of increased needs of quickly dividing neoplastic components for oxygenation; 6) ability to invasion and metastasis formation due to production of histolytic enzymes (proteases) and suppressors of local immunity by tumour; 7) genomic instability due to inactivation of DNA repair systems and impairment of cell cycle molecular control; 8) rearrangement of stromal components providing favorable conditions for evolution of malignant clone.

Acquisition of such signs is governed by somatic mutations which activate oncogenes and inactivate suppressor genes. Besides protein-coding genes, carcinogenesis involves microRNAs — short noncoding oligonucleotides capable of translation suppression and/or degradation of coding RNAs via binding to their complementary regions. Knowledge about mechanisms of cancer is constantly evolving. Most sensational discoveries of recent years include hypothesis about cancer stem cells, demonstration of paracrine relations between primary tumour and its metastases and evidences of long persistence of "dormant" tumour cells in organisms of cured oncologic patients.

Б. Кайна

РЕПАРАЦИЯ ДНК И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА ПРИ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ АЛКИЛИРУЮЩИМИ АГЕНТАМИ: ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ТЕРАПИИ ГЛИОМ И МЕЛАНОМЫ

Отделение токсикологии, Университет. Майнца, Майнц, Германия

Химиотерапевтическими агентами первой линии при лечении глиом и меланомы являются алкили-рующие агенты. Такие вещества индуцируют множество различных типов повреждений ДНК, для некоторых из них показано канцерогенное, генотоксическое и цитотоксическое действие. Кроме того, такие препараты могут стимулировать рекомбинацию ДНК. Метилирующие агенты приводят к изменению нуклеиновых кислот и формированию 06-метилгуанина (O6MeG). Такие химические модификации ДНК вызывают мутации, и именно эта их функция является причиной большинства канцерогенных свойств алкилирующих агентов. Однако такие изменения ДНК репарируются ферментом-самоубийцей алкилтрансферазой (MGMT), которая считается важным маркером лекарственной устойчивости опухолей, в частности глиом.

Для меланомы ситуация до конца не ясна, т. к. устойчивость меланомы к алкилирующим агентам определяют и другие ферменты, например белки репарации неспаренных оснований. Мы тщательно исследовали апоптоз в клетках глиом и меланомы, вызванный 06MeG. Нами показано, что клеточная смерть проходит как по рецептор-зависимому, так и по митохондриальному пути и при этом происходит фрагментация ДНК с помощью двуцепочечных разрывов. 06MeG более эффективно стимулирует р53-зависимый рецептор-опосредованный апоптоз, чем эндогенный митохондриальный путь индукции клеточной смерти. Этот факт проясняет причину того, что клетки глиом с диким типом р53 являются более чувствительными к темозоломиду, чем клетки с мутантным аллелем этого белка. Интересно, что клетки глиом с диким типом р53 более устойчивы к хлороэтилирующим агентам (например к BCNU, CCNU, ACNU), чем клетки с мутантным р53. Такие препараты также применяются при терапии глиом. Этот факт указывает на двоякую роль р53: с одной стороны, он регулирует активность рецепторов смерти, с другой, защищает клетки от действия О6-хлорэтилгуанин-зависимого апоптоза (и некроза). Скорее всего, последнее действие р53 осуществляется через повышение экспрессии генов репарации ДНК (например, ddb2). Эти данные будут обсуждены в контексте химиотерапии глиом и меланомы.

Данная работа была поддержана грантами DFG KA724/13 and SFB724/B7.

B. Kaina

DNA REPAIR AND SIGNALING IN ALKYLATING DRUG INDUCED CELL DEATH: IMPLICATIONS FOR GLIOMA AND MELANOMA THERAPY

Department of Toxicology, University of Mainz, Mainz, Germany

Alkylating agents are the first line therapy in patients with glioma and malignant melanoma. These agents induce a dozen of different DNA damages, some of them being carcinogenic, genotoxic, recombinogenic and cytotoxic. An important DNA damage induced by methylating drugs is O6-methylguanine (O6MeG). This damage causes mutations and is responsible for most of the carcinogenic effects of alkylating drugs. The

damage is repaired by the suicide enzyme alkyltransferase (MGMT), which is considered to be a very important marker of drug resistance in gliomas.

For malignant melanomas the situation is less clear since other mechanisms of alkylation drug resistance come into play as well, such as mismatch repair. O6MeG is a potent trigger of the programmed cell death (apoptosis) pathway. We have studied in detail how apoptosis induced by O6MeG is executed in glioma and melanoma cells. We have shown that cell death is executed both via the death receptor and the mitochondrial pathway, with DNA double-strand breaks (DSB) involved. The efficiency of O6MeG to trigger the p53 dependent death receptor pathway is higher than the p53 independent endogenous mitochondrial pathway, which explains why p53 wt glioma cells are more sensitive to temozolomide than p53 mutated cells. Interestingly, p53 wt glioma cells are more resistant than p53 mutant glioma cells to chloroethylating agents, such as BCNU, CCNU and ACNU, which are also applied in glioma therapy. This indicates that p53 has a dual role: one is regulation of the death receptor, the other is protection against O6chloroethylguanine-induced apoptosis (and necrosis), very likely by upregulation of repair genes (notably ddb2). These data will be discussed as to their clinical implications for glioma and melanoma therapy.

The study was supported by DFG KA724/13 and SFB724/B7.

Э. В. Крупнова1, Н. Н. Чакова1, Е. П. Михаленко1, Н. В. Чеботарева1, Ю. Е. Демидчик2, А. А. Жилко2, Е. Н. Шлома2

АССОЦИАЦИЯ МЕЖДУ A61G ПОЛИМОРФИЗМОМ ГЕНА EGF И РИСКОМ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

1 Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь

2 Минский городской клинический онкологический диспансер, Минск, Республика Беларусь

Эпидермальный фактор роста (EGF) является лигандом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), который участвует в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток, а также в инициации ангиогенеза. Описан функционально значимый полиморфизм гена EGF в нетранслируе-мой области в позиции +61 (A61G полиморфизм). Известно, что клетки с генотипом АА продуцируют достоверно меньший уровень EGF, чем клетки с генотипами GG или GA. Результаты исследований ассоциации A61G полиморфизма EGF с развитием онкологических заболеваний противоречивы. Целью нашей работы было изучение влияния A61G полиморфизма EGF на риск развития онкологических заболеваний. Методом ПЦР-ПДРФ проведен анализ полиморфизма A61G гена EGF у больных немелкоклеточным раком легкого и раком яичников. Не выявлено достоверной разницы между частотой встречаемости генотипов GA и GG у больных раком легкого и в контрольной группе (ОР 1,97; ДИ 0,97—3,98; р =

0,08). Однако у больных плоскоклеточным раком легкого эти генотипы встречались в 2 раза чаще, чем у пациентов с аденокарциномой. У больных раком яичников обнаружено достоверное увеличение частоты генотипов GA и GG (ОР 5,09; ДИ 1,38—18,7; р = 0,017) по сравнению с контрольной группой. Начаты исследования по изучению генетического полиморфизма сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) — одного из ключевых индукторов ангиогенеза.

E. V. Krupnova1, N. N. Chakоva1, A. P. Mikhalenko1, N. V. Chebotareva1,

A. A. Zilko2, Y. E. Demidchik2

ASSOCIATION BETWEEN AG1G POLYMORPHISM OF EGF GENE AND RISK OF CANCER

1 Institute of Genetics and Cytology NASB, Minsk, Belarus

2 Minsk Oncological Clinical Dispensary, Minsk, Belarus

Epidermal growth factor (EGF) is a ligand of epidermal growth factor receptor (EGRFR) which is involved in proliferation, differentiation and apoptosis of cells as well as in angiogenesis initiation. Functionally

significant EGF polymorphism is described in untranslated region in +61 position (A61G polymorphism). Cells with AA genotype are known to produce significantly less EGF than those with GG or GA genotypes. Data about association of A61G polymorphism of EGF with cancer development are equivocal. The aim of our study was to analyze the influence of A61G polymorphism of EGF on the risk of cancer development. A61G polymorphism of gene EGF was analyzed in non-small cell lung cancer patients and ovary cancer patients. No significant difference was revealed between occurrences of genotypes GA and GG in lung cancer patients and in the control group (OR 1.97; CI 0.97 — 3.98; p = 0.08). However, these genotypes were found 2-times more frequently in squamous cell lung cancer patients than in adenocarcinoma patients. A significant increase in the frequency of GA and GG genotypes was observed in ovary cancer patients (OR 5.09; CI 1.38—18.7; p = 0.017) as compared to the control group. Investigations are under way to study genetic polymorphism of vascular endothelial growth factor (VEGF), a key inducer of angiogenesis.

Н. Л. Лазаревич, Д. И. Флейшман, М. В. Макарова, Н. Е. Доннер, И. Ф. Кустова, Д. А. Шавочкина, Е. С. Чучуев, Ю. И. Патютко

ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ В КООРДИНАЦИИ АКТИВНОСТИ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ

ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

Тканеспецифические транскрипционные факторы, формирующие регуляторные каскады, которые определяют спецификацию и дифференцировку эпителиальных клеток в онтогенезе, играют центральную роль в контроле функциональных и морфологических свойств различных типов клеток. Одной из наиболее изученных систем тканеспецифической регуляции является сеть гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), которые определяют установление и поддержание дифференцировки нескольких типов эпителиальных клеток.

Одним из центральных звеньев этой регуляторной сети является ядерный рецептор HNF4a. Нарушение экспрессии этого гена ассоциировано с прогрессией гепатоцеллюлярных карцином (ГК) грызунов и человека и приводит к ускорению пролиферации, нарушению эпителиальной морфологии, появлению способности к метастазированию и дедифференцировке. Восстановление функции HNF4a в клетках дедифференцированной ГК мыши вызывает частичную реверсию злокачественного фенотипа как in vitro, так и in vivo. В ГК человека транскрипция изоформы HNF4a1 полностью утрачена в 7 и понижена в 5 из 17 ГК (71%), не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита. Подавление экспрессии HNF4a коррелирует с неблагоприятным прогнозом течения заболевания. Таким образом, транскрипционный фактор HNF4a в клетках гепатоцитарного происхождения является вероятным опухолевым супрессором.

Нарушение функции ГЯФ отмечено также в других опухолях эпителиального происхождения. Мы предполагаем, что тканеспецифические факторы, которые определяют ключевые этапы реализации определенных дифференцировочных программ и способны модулировать сигналы, поступающие извне в клетку, могут рассматриваться как перспективные кандидаты на роль опухолевых супрессоров в тех типах тканей, где они играют наиболее значимую роль.

Работа поддержана грантами РФФИ 07-04-01422 и 07-04-12151-офи.

N. L. Lazarevich, D. I. Fleyshman, M. V. Makarova, N. E. Donner, I. F. Kustova,

D. A. Shavochkina, E. S. Chuchuev, Y. I. Patutko

TISSUE-SPECIFIC TRANSCRIPTION FACTORS IN COORDINATION OF THE ACTIVITY OF SIGNALING PATHWAYS IN TUMOR PROGRESSION

N. N. Blokhin Russian Cancer Research. Center RAMS, Moscow, Russian Federation

Tissue-specific transcription factors forming the regulatory cascades which determine specification and differentiation of epithelial cells during embryogenesis play the central role in the control of functional and morphological properties of various cell types. Hepatocyte nuclear factors (HNFs) network is one of the most investigated tissue-specific regulatory systems which controls initiation and maintenance of differentiation of several epithelial cell types.

HNF4a nuclear receptor is a central element of this regulatory network. Deregulation of this gene is associated with progression of rodent and human hepatocellular carcinoma (HCC) and induces increase in cell proliferation, loss of epithelial morphology, dedifferentiation and metastasis. Restoration of HNF4a expression in dedifferentiated cells induces partial reversion of highly malignant phenotype both in vitro and in vivo. In human HCC samples HNF4a1 transcription is completely lost in 7 and significantly decreased in 5 of 17 HCCs (71%) not associated with hepatitis B virus infection. Decreased HNF4a expression correlates with poor prognosis. HNF4a is therefore a candidate tumor suppressor for hepatic cells.

HNFs dysfunction was also reported in other epithelial tumors. We suppose that tissue-specific transcription factors which control the key steps of certain differentiation programs and can receive and modulate extracellular signals may be considered promising tumor suppressor candidates for their corresponding tissues.

The work was supported, by grants from Russian Foundation, for Basic Research. (07-04-01422 and 07-04-12151-ofi).

Л. Н. Любченко1, Н. И. Поспехова1, А. А. Пароконная1, М. Б. Стенина1,

С. М. Портной1, С. А. Тюляндин1, В. В. Брюзгин1, А. В. Карпухин2,

Р. Ф. Гарькавцева1

РЕДКИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ. ЗНАЧЕНИЕ КЛИНИКО-МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

1 ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

2 ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Российская Федерация

Основная часть злокачественных новообразований относится к мультифакториальным заболеваниям, этиологическими факторами которых являются как внешнесредовое воздействие, так и наследственная предрасположенность. Однако в некоторых семьях причиной возникновения заболевания является консервативный генный дефект с парадоксально высоким риском развития органоспецифичной и синдромальной патологии. Некоторые онкологические синдромы часто не диагностируются ввиду их низкой частоты в популяции. В таких случаях молекулярно-генетическое исследование является определяющим тактику диагностики, лечения и профилактики.

Синдром Ли-Фраумени (СЛФ) — редкое аутосомно-доминантное заболевание, впервые описанное в 1969 г., ассоциированное с возникновением двустороннего рака молочной железы (РМЖ) у молодых женщин и накоплением в семьях мягкотканных и остеогенных сарком, опухолей головного мозга и адренокортикального рака. Высокая частота герминальных ТР53 мутаций обуславливает высокую экспрессивность и пенетрантность заболевания в течении жизни. В ряде случаев семьи с наследуемыми ТР53 мутациями не удовлетворяют критериям классического СЛФ. Пример сегрегации только РМЖ мы наблюдали в семье с наследуемой герминальной нонсенс-мутацией Я306Х в 8 экзоне гена

ТР53. Следует отметить, что заболевание и у матери, и у дочери было диагностировано на фоне существующей беременности в возрасте 26 лет. При скрининге кодирующей части гена ТР53 из 19 пациенток молодого возраста (до 30 лет), страдающих РМЖ с онкологически отягощенным анамнезом, инактивирующие герминальные ТР53 мутации были выявлены у 2 (10,5%). В одном случае мутация возникла de novo. Известный ТР53 полиморфизм Arg72Pro наследовали 6 (31,5%) больных. В изучаемой группе пациенток прослеживалось значительное повышение частоты интронного ТР5З варианта Int3dup16 в гомозиготном состоянии по сравнению с популяционным контролем. С целью дифференциальной диагностики при СЛФ следует учитывать, что ДНК-тестирование гена CHEK2 выявляет гетерозиготное но-сительство мутаций в 10% случаев. Таким образом, ген-супрессор CHEK2 обуславливает предрасположенность не только к развитию РМЖ, что необходимо учитывать при медико-генетическом консультировании пациентов-носителей.

L. N. Liubchenko1, N. I. Pospekhova1, A. A. Parakonnaya1, M. B. Stenina1, S. M. Portnoy1, S. A. Tjulandin1, V. V. Briuzgin1, A. V. Karpuhin2, R. F. Garkavtseva1

RARE INHERITED CANCER SYNDROMES. IMPORTANCE OF CLINICO-MOLECULAR DIAGNOSTICS

1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow, Russian Federation

2 Research Centre for Medical Genetics RAMS, Moscow, Russian Federation

Majority of malignant neoplasms are related to multifactorial diseases, whose etiological factors are the influence of environment and hereditary predisposition. However, in several families the reason for disease occurrence is conservative genetic defect with ironical high risk of organ-specific and syndromatic pathology development. Several cancer syndromes are often never diagnosed in view of their low incidence. In such circumstances, molecular genetic study is the determining method in diagnostics, treatment and prophylaxis.

Li-Fraumeni Syndrome (LFS) — a rare autosomal-dominant disease, which was first observed in 1969, associated with the appearance of bilateral breast cancer in younger women and with uptake of soft-tissue and osteogenic sarcomas, brain tumors and adrenocoritcal tumors in the families. Increased frequency of germ-cell TP53 mutations gives rise to high expressiveness and penetrance of disease in life-time. In a number of cases, families with inheritable TP53 mutations did not satisfy the classical criteria of LFS. An instance of segregation only in breast cancer was observed in families with inheritable germ-cell nonsense mutation of R306X in exon 8 of TP53 gene. It should be noted that the disease was diagnosed both in mother and daughter during the pregnancy at an age of 26 years. During screening of the coding part of TP53 gene in 19 patients of younger age (up to 30 years) suffering from breast cancer with cancer-burdened history, inactivating germ-cell TP53 mutations were found in 2 (10.5%) patients. In one case the mutation occurred de novo. The famous TP53 polymorphism Arg72Pro was inherited in 6 (31.5%) patients. In the study group, patients were on follow-up for a significantly high frequency of intronic TP53 variant Int3dup16 in homozygous condition when compared with the population control. It should be noted that, in differential diagnosis of LFS, DNA-testing of CHEK2 gene shows heterozygous carriage of mutations in 10% of cases. Thereby, gene-suppressor CHEK2 stipulates susceptibility not only to the development of breast cancer, which should be taken to consideration during medico-genetic counseling of patient carriers.

О. Г. Лютаревич

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ В ИССЛЕДОВАНИЯХ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ

Московское представительство компании «Миллипор», Москва, Российская Федерация

Современная наука располагает широким арсеналом методов для исследования онкозаболеваний на молекулярном уровне. Уникальные проточные цитометры «Guava EasyCyte Plus» за счет использования микрокапиллярной ячейки отменяют использование проточной («несущей») жидкости.

Компактные и простые в работе и обслуживании, эти приборы позволяют одновременно детектировать до 4 красителей и боковое светорассеяние в образцах, автоматически забираемых из 96-луночного планшета или 10 микропробирок. Вместе с тем такие цитофлуориметры позволяют реализовать все основные применения классического подхода в проточной цитометрии. Значительный технический прорыв в молекулярно-биологических исследованиях реализован в технологии иммуномультиплексирования xMAP от «Luminex». В данной технологии используются полистирольные микросферы с флуоресцентными репортерами. В одном реакционном объеме возможно определение до 100 аналитов. Помимо самого прибора компания «Millipore» предлагает широкое разнообразие наборов, позволяющих детектировать такие онкомаркеры, как MIF, лептин, пролактин, остеопонин, CA-125, IGF-II, а также до 42 цито-кинов/хемокинов, TGF-beta, гормоны гипофиза и щитовидной железы, адипокинетические и гастроинтестинальные гормоны, маркеры костных и сердечно-сосудистых заболеваний, маркеры сепсиса, апоптоза. Компания «Millipore» представляет описанные технологии для исследования онкозаболеваний в России.

O. G. Liutarevich NEW METHODS IN MOLECULAR CANCER RESEARCH

Millipore Moscow office, Moscow, Russian Federation

The modern science applies various methods to study cancer diseases at molecular level. Unique Guava EasyCyte Plus flow cytometers make sheath fluid unnecessary due to application of the patented micro-capillary flow cell. These compact and easy-to-use devices can detect up to 4 colors and side scattering. Samples are automatically loaded from 96-well microplates or 10 microtubes. The flow cytometers can also perform all basic applications of classical flow cytometry. The xMAP technology developed by Luminex is a significant technical breakthrough in molecular biology. This technology is based on polystyrol microspheres with fluorescent reporters and allows up to 100 unique assays to be multiplexed within a single sample. Besides the instrument itself Millipore offers a large variety of kits for detection of onkomarkers such as MIF, leptin, prolactin, osteo-pontin, CA-125, IGF-II, and up to 42 cytokines/chemokines, hormones, osteo- and cardiovascular markers, markers of sepsis and apoptosis. Millipore supplies these technologies for cancer research in Russia.

Н. Н. Мазуренко

ЗНАЧЕНИЕ МУТАЦИЙ КОМПОНЕНТОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ

ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

Многие компоненты митогенных сигнальных путей, включая большое число протеинкиназ, играют центральную роль в развитии биологических процессов, таких, как клеточный рост, дифференциров-ка, апоптоз. Среди ключевых сигнальных путей, которые функционируют в клетке независимо и параллельно и нарушения или взаимодействие которых наиболее часто встречаются в опухолях, — сигнальные каскады MAPK/RAS и PI3K/AKT. Хотя прогрессия опухоли сопровождается многочисленными генетическими нарушениями, лишь некоторые мутации определенных генов становятся маркерами заболевания. Достаточно хорошо изучены рецепторные тирозинкиназы, активирующие мутации которых приводят к круциальным изменениям в передаче митогенных сигналов. Мутации вызывают конформа-ционные и функциональные изменения белков, что используется при создании новых противоопухолевых препаратов молекулярно направленной, или таргетной, терапии. Среди мишеней таргетной терапии — рецепторы EGFR и HER2, KIT, PDGFRA, BCR-ABL, лиганд VEGF.

Сегодня наибольшее распространение получили таргетные препараты — моноклональные антитела к клеточным рецепторам либо лигандам и ингибиторы протеинкиназ. Иресса и Тарцева, представляющие собой небольшие ингибиторы тирозинкиназных доменов EGFR, оказались эффективны только в случаях немелкоклеточного рака легкого (аденокарциномы), при которых обнаружены мутации в тиро-зинкиназном домене рецептора EGFR. Нарушения сигнальных путей могут возникать также вследствие

мутаций внутриклеточных белков, наиболее значимыми являются нарушения в генах KRAS и BRAF. Определение мутаций KRAS необходимо при колоректальном раке, т. к. мутации нивелируют терапевтический эффект препарата цетуксимаб у больных с амплификацией гена EGFR. Перспективным представляется комбинированное применение таргетной терапии с цитостатическими препаратами, более эффективно может быть одновременное подавление сигнальных каскадов, запускаемых EGFR и RAS. В ряде случаев мутационный анализ важен для уточнения диагностики и прогноза.

Стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST) являются ярким примером применения таргетной терапии в онкологии. Характерным отличительным признаком стромальных опухолей ЖКТ является наличие мутаций генов KIT и PDGFRA в 90% случаев. Важно, что тип мутации коррелирует с локализацией, морфологическими особенностями, клиническим течением и злокачественным потенциалом GIST, а также определяет чувствительность к различным таргетным препаратам (Гливек, Сутент и др.). Важность молекулярно-генетических исследований для клинической онкологии не вызывает сомнений, и можно надеяться, что в ближайшие годы анализ активирующих мутаций генов станет важным и необходимым тестом, позволяющим индивидуализировать диагностику, прогноз и лечение онкологических заболеваний.

N. N. Mazurenko

SIGNIFICANCE OF ONCOGENIC MUTATIONS IN THE COMPONENTS OF INTRACELLULAR SIGNALING CASCADES FOR TUMOR DIAGNOSTICS AND TREATMENT

N. N. Blokhin Russian Cancer Research. Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

Many components of intracellular regulatory networks play an important role in cell proliferation, differentiation and apoptosis. MAPK/RAS and PI3K/AKT kinase pathways are activated in the cell independently and their aberrations frequently occur in tumors. Many genetic aberrations are associated with tumor progression, but only few gene mutations can be used as prognostic or predictive markers. Activating mutations of several receptor tyrosine kinases cause crucial aberrations in cell signaling. Mutated proteins with various conformation and functional abnormalities are molecular targets for cancer therapy. Monoclonal antibodies to cell receptors or ligands as well as the targeted protein-tyrosine kinase inhibitors represent a major advance in cancer treatment. The most frequent targets include EGFR, HER 2, KIT, PDGFRA, BCR-ABL and VEGF.

In some cases the specific site of abnormality depends on tumor type or subtype. Small EGFR inhibitors, gefitinib (Iressa) and erlotinib (Tarceva), are effective only in non small cell lung cancers (adenocarcinomas) with mutations in EGFR tyrosine kinase domain. Activation of MAP kinase pathway may occur through mutations in RAS family proteins or BRAF serine/threonine kinases. Therefore, KRAS mutations appear to preclude improved survival of patients with metastatic colorectal cancer after therapy with monoclonal antibody (cetuxymab) targeted at EGFR. There are new promising approaches including target therapies in combination with cytostatics. Mutational analysis is also important for tumor diagnostic and prognosis.

Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are a leading model for kinase-targeted therapies in oncology. 90% of GISTs have KIT and PDGFRA activating mutations that distinguish them from other mesenchymal tumors. Recently BRAF mutations were found in some GISTs with KIT and PDGFRA wt that also demonstrated the activation of MAPK/RAS pathway. The success of GIST story is based on correlation between the type of mutation and the location, morphology, clinical behavior and malignant potential of GIST as well as response to target therapy (imatinib, sunitinib).

Д. С. Михайленко1, А. М. Попов2, Р. В. Курынин3, Л. Э. Завалишина4, Д. В. Залетаев1

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ СПОРАДИЧЕСКОМ РАКЕ ПОЧКИ

1 ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Российская Федерация

2 ГУ МРНЦ РАМН, Обнинск, Российская Федерация

3 Урологическая клиника ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова, Москва, Российская Федерация

4 ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт, им.. П. А. Герцена Росздрава,

Москва, Российская Федерация

Ежегодно в мире регистрируют около 200 000 новых случаев рака почки (РП), что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии. Целью настоящего исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при РП, направленный на поиск и характеристику потенциальных маркеров заболевания.

В работе исследовали 127 образцов РП. Мутации в гене VHL выявляли с помощью SSCP-анализа и последующего секвенирования. Потерю гетерозиготности в областях локализации генов VHL, RASSF1, FHIT, TP53 определяли по STR-маркерам. Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 изучали с помощью МЧ-ПЦР. Соматические мутации VHL были определены в 39 образцах светлоклеточного РП, из них 33 мутации идентифицированы впервые. Хотя бы одно из нарушений VHL (мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование) обнаружено у 54% пациентов с I стадией заболевания, что свидетельствует в пользу инактивации VHL на ранних стадиях светлоклеточного РП. Аллельные делеции двух и более генов-супрессоров в области 3р ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза. Метилирование VHL определено в 14,2%, RASSF1 — 52,8%, FHIT — 54,3%, SFRP1 — 33,1% и CDH1 — 41,7% первичных опухолей, а метилирование как минимум одного из этих генов — в 85,0% образцов. Метилирование CDH1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки и наличием метастазов. Полученные результаты указывают на возможность использования комплексного анализа VHL, потери гетерозиготности генов-супрессоров в области 3р, а также метилирования CDH1 при разработке системы молекулярно-генетических маркеров РП.

D. S. Mikhaylenko1, A. M. Popov2, R. V. Kurynin3, L. E. Zavalishina4, D. V. Zaletayev1

ANALYSIS OF THE MOLECULAR GENETIC ALTERATIONS IN SPORADIC RENAL CELL CANCER

1 Research. Centre for Medical Genetics RAMS, Moscow, Russian Federation

2 Medical Radiological Research. Center RAMS, Obninsk, Russian Federation

3 Clinic of Urology, I. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow, Russian Federation

4 P. A. Hertzen Cancer Research. Institute, Moscow, Russian Federation

Annually 200,000 cases of renal cell cancer (RCC) are registered worldwide, this disease may therefore be considered one of the most actual problems in oncourology. The aim of our study was complex molecular genetic analysis of RCC to find and to characterize RCC potential markers.

We conducted analysis of 127 RCC samples. Mutations in the VHL gene were detected by SSCP and sequencing. Loss of heterozygosity (LOH) in the loci of genes VHL, RASSF1, FHIT, and TP53 was tested using STR-markers. Methylation of genes VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, and CDH1 was investigated by methyl-sensitive endonucleases and subsequent PCR. Somatic mutations in the VHL were identified in 39 clear cell RCC samples, 33 of them were not described previously. VHL alterations (mutations, LOH and/or methylation) were found in 54% patients with stage I disease that was evidence in favor of VHL inactivation at early stages of clear cell RCC carcinogenesis. LOH in two or three 3p genes was associated with metastasis. Methylation of VHL was observed in 14.2%, RASSF1 in 52.8%, FHIT in 54.3%, SFRP1 in 33.1%, and CDH1 in 41.7% of primary tumors, at least one of the tested genes was methylated in 85% RCC cases. CDH1 methylation was associated with tumor

invasion through the kidney capsule, as well as metastases in regional lymph nodes and distant metastases. The results of our study have demonstrated that VHL complex analysis, LOH of 3p tumor suppressor genes, and CDH1 methylation may be useful in design of RCC molecular markers system.

С. В. Петровr, И. Мачадо2", И. В. Булычева3, Р. Ногуэра2, А. Пеллин2,

П. Баччини4, Ф. Бертони4, А. Лломбарт-Бош2

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ МЕЛКОКРУГЛОКЛЕТОЧНЫХ ОПУХОЛЕЙ КОСТЕЙ И МЯГКИХ ТКАНЕЙ. АНАЛИЗ НА ТКАНЕВЫХ МАТРИЦАХ 17 НАБЛЮДЕНИЙ, СХОДНЫХ С САРКОМОЙ ЮИНГА

1 Отделение патологической анатомии Республиканского клинического онкологического диспансера,

Казань, Российская Федерация

2 Отдел патологии медицинского факультета Университета Валенсии, Валенсия, Испания

3 Отделение патологической анатомии больницы № 62, Москва, Российская Федерация

4 Институт ортопедии Риззоли, Болонья, Италия

На парафиновом материале с помощью технологии тканевых матриц (TMA), иммуногистохимии, цитогенетических (FISH) и молекулярно-биологических (RT-PCR) методов был уточнен диагноз 17 мелко-круглоклеточных опухолей костей и мягких тканей, имевших гистологическое сходство с саркомой Юинга (EWS). Оказалось, что у 8 больных был классический вариант EWS, у 1 — крупноклеточная EWS, у 1 — атипическая EWS и у 1 — эндотелиальный вариант EWS. У 2 больных был поставлен диагноз примитивной нейроэктодермальной опухоли (PNET), у 1 — синовиальной саркомы, у 1 — эмбриональной рабдомиосаркомы, у 1 — недифференцированной саркомы высокой степени злокачественности и у 1 — диффузной B-клеточной крупноклеточной лимфомы. Технология тканевых матриц позволяет на одном блоке, содержащем большое число опухолевых образцов, выполнить и оценить результаты применения целого ряда диагностических методик. Подчеркивается, что диагностика мелкокруглоклеточных опухолей требует использования комплекса современных методов, обеспечивающих качественную характеристику каждого новообразования

Проект поддержан грантами FIS, Мадрид (PI04/0822, G03/89), PROTHETS (EC cn503036).

* Поддержан программой ««Una nau de solidaritat» Университета Валенсии.

** Поддержан персональным, грантом. AECC (Валенсия, Испания).

S. V. Petrov1', I. Machado2", I. V. Boulytceva3, R. Noguera2, A. Pellin2, P. Bacchini4,

F. Bertoni4, A. Llombart-Bosch2

NEW APPROACHES IN THE DIAGNOSIS OF SMALL CELL ROUND TUMORS OF BONE AND SOFT TISSUE. AN ANALYSIS OF 17 CASES CONSISTENT WITH EWING SARCOMAS USING TISSUE MICROARRAY TECHNOLOGY

1 Department of Pathology, Republic Clinical Oncological Dispensary, Kazan, Russian Federation

2 Department of Pathology, Medical School, University of Valencia, Valencia, Spain

3 Department of Pathology, Hospital № 62, Moscow, Russian Federation

4 Orthopedics Institute Rizzoli, Bologna, Italy

The aim of our investigation was to evaluate small cell round tumors (SCRTs) of bone and soft tissue using a new diagnostical approach and to offer an algorithm for the daily diagnostics of this group of the tumors. 17 SCRTs were studied via immunohistochemistry, cytogenetics (FISH) and molecular biology methods (RT-PCR). After the using of additional methods final diagnoses were as follows: 8 patients had conventional classic EWS, 1 had large cells EWS, 1 had atypical EWS and 1 had EWS with endotheliomatous features. 2 patients

had PNET, 1 had synovial sarcoma, 1 had embryonal rhabdomyosarcoma, 1 had high grade undifferentiated sarcoma and 1 had diffuse large cell B lymphoma. TMA technology allows executing of several diagnostic methods on the same block and accurate evaluation of all assessed tumors. FISH detection of EWS break apart has advantage compared to RT-PCR because of lower sensitivity of the latter. Modern diagnosis of SCRTs requests obligatory application of complex contemporary diagnostic procedures that provide qualitative evaluation of each tumor.

Project supported by grants PI04/0822, G03/89 from FIS (Madrid) and PROTHETS (EC cn503036).

* Received support through, the program. 'Una nau de solidaritat' from the University of Valencia, Spain.

** Supported, by a grant from the AECC, Valencia, Spain

М. О. Прилуцкая1, О. В. Балукова2, Н. А. Дьякова2, И. Б. Зборовская2

ВЫСОКОЕ КАЧЕСТВО БИОМАТЕРИАЛОВ — ОБЯЗАТЕЛЬНОЕ УСЛОВИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСПЕШНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ В ОБЛАСТИ БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

1 «ProteoGenex, Inc. Biothechnology», Калвер-сити, США

2 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

Значительные достижения в области биомолекулярных технологий в последние годы повысили точность и чувствительность методов исследования, используемых в онкологии, а также ускорили возможность перехода к персональной медицине. Образцы человеческих тканей, используемые в исследованиях в области онкологии, являются основным источником получения молекулярных данных для определения специфичных биомаркеров, которые в дальнейшем могут быть использованы для лечения, диагностики и предупреждения рака. Достоверность и надежность молекулярных данных, полученных в исследованиях, в большой степени зависит от качества анализируемых биологических образцов, поэтому в последнее время значительно повысились требования к их качеству. Нехватка стандартизованных биологических образцов высокого качества является значительным препятствием в области онкологических исследований. В докладе представлены условия и методы, необходимые для получения высококачественного биоматериала.

Процесс сбора и хранения всех типов биоматериалов, таких, как замороженные ткани, парафиновые блоки, кровь, сыворотка, плазма и т. д., должен всегда выполняться в строгом соответствии со стандартными протоколами. Для обеспечения качества биоматериала и во избежание вариабельности результатов исследований различные типы биообразцов должны быть приготовлены в соответствии со стандартными процедурами для каждого типа веществ (РНК, ДНК, белок, липиды и т. д.). Температура тканей, предназначенных для замораживания, должна быть снижена как можно быстрее после отбора. Длительность обработки этих материалов должна быть минимальной, т. к. замораживание является конечным этапом приготовления образцов. Необходимо строго избегать размораживаний уже замороженных тканей. Для таких видов тканей, как кровь, немедленная обработка может быть не настолько важной и оптимальное время обработки может различаться в зависимости от метода анализа, для которого этот образец будет использован. С каждого образца, предназначенного для молекулярных и иных исследований, должны быть приготовлены дополнительные стекла, окрашенные гематоксилином и эозином, с целью определения доли опухолевых клеток в замороженной ткани. Эти же стекла могут быть использованы для подтверждения качества материала и патологического диагноза.

M. O. Prilutskaya1, O. V. Balukova2, N. A. Djakova2, I. B. Zborovskaya2

BIOSPECIMENS QUALITY AS AN ESSENTIAL REQUIREMENT FOR SUCCESS IN BIO MOLECULAR TECHNOLOGY

1 ProteoGenex, Inc. Biothechnology Culver City, USA

2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research. Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

Significant advances in biomolecular technology in recent years have increased greatly the power and precision of analytical tools used in cancer research and accelerated the drive toward personalized medicine. Human specimens that serve as analytes for these new and developing technology platforms are a critical resource for basic and translational research in cancer as a direct source of molecular data from which targets for therapy, detection, and prevention are identified and molecular taxonomies of cancer are derived. Reliability of molecular data derived from these new analysis platforms depends on quality and consistency of biospecimens being analyzed. Increased requirements for biospecimen quality have become a pressing need across the research enterprise. The lack of standardized, high-quality biospecimens is widely recognized as a significant roadblock to cancer research. In this presentation I shall summarize some steps needed to obtain high-quality biomaterial.

Preparation and storage of all types of fresh frozen tissues, paraffin embedded tissues, blood, serum, plasma etc. should be in compliance with standardized protocols. Individual types of biospecimens should be handled according to SOPs specific for each biospecimen type (RNA, DNA, proteins, lipids) to ensure their quality and to avoid variables in research studies. For solid tissue samples temperature should be reduced as soon as possible after collection. Biospecimen processing time should be minimized if freezing is the stabilization endpoint. For other types of biosamples, such as blood, rapid processing may not be critical, and optimal processing time may vary depending on analysis method for which this biospecimen is intended. Unnecessary thawing and refreezing of frozen biospecimens should be avoided. To confirm quality of fresh frozen tissue samples extraction of total RNA is needed with RNA analyses using Agilent Bioanalyser to follow. H&E slides should be prepared from each fresh frozen tissue sample for the diagnosis, evaluation of percentage of tumor cells in frozen sample and quality conformation.

Н. В. Севостьянова1,2, А. М. Некрасова1, А. П. Кошель2, А. И. Дмитриева1, Е. С. Андреева1, Н. Н. Плотникова1, В. В. Новицкий1

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

1 ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет. Росздрава, Томск,

Российская Федерация

2 НИИ гастроэнтерологии Сибирского государственного медицинского университета, Северск,

Российская Федерация

Обследован 61 пациент со злокачественными новообразованиями желудка и кишечника I—IV стадий. Группу сравнения составили 30 пациентов с хроническими заболеваниями и доброкачественными изменениями в слизистой ЖКТ и 100 здоровых доноров сопоставимого пола и возраста. Злокачественные неоплазии были представлены, в основном, аденокарциномами различной степени дифференцировки (83,3%), перстневидноклеточным (7,4%) и недифференцированным раком (9,3%). Типирование образцов по генам СЯТТ1 и СЯТМ1 проводили путем мультиплексной ПЦР.

Частота гомозигот по нулевому аллелю (0/0) гена GSTT1 в контрольной группе обследованных оказалась несколько ниже популяционной (23,3%) и составляла 15%. В исследованных выборках наибольшая частота нулевого генотипа гена GSTT1 была отмечена у больных со злокачественными образованиями ЖКТ, при этом различия между онкологическими больными и здоровыми лицами оказались статистически значимыми (с2 = 36,3, p = 0,0001). Риск рака ЖКТ возрастает в 5,99 раза (95% ДИ 3,10—11,73) у здоровых лиц с генотипом GSTT1 0/0. Частота гомозигот по нулевому аллелю GSTM1 в контрольной группе обследованных соответствовала таковой в популяции Северо-Западного региона России (42,2%) и составляла 43,0%. У больных раком ЖКТ частота гомозигот GSTM1 0/0 (59,4%) превышала популяционный уровень и статистически значимо отличалась от соответствующих показателей у обследованных здоровых лиц (с2 = 7,20, p = 0,007). У здоровых лиц с генотипом GSTМ1 0/0 риск развития рака легкого возрастает в 1,96 раза (95% ДИ 1,16—3,32). У больных раком ЖКТ с метастазами частота гомозигот по генотипу GSTT1 0/0 оказалась достоверно выше соответствующих значений у таких больных без метастазов (59,0 и 42,0% соответственно, p = 0,022). Следует отметить также, что подобная зависимость была установлена и для 0/0-генотипа гена GSTM1 (67,3 и 50,6% соответственно, p = 0,022).

N. V. Sevostyanova1,2, A. M. Nekrasova1, A. P. Koshel2, A. I. Dmitrieva1, S. I. Martov2, E. S. Andreeva1, V. V. Novitskyi1

POLYMORPHISM OF GSTT1 AND GSTM1 GENES IN PATIENTS WITH GASTROINTESTINAL MALIGNANT NEOPLASMS

1 Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation

2 Research. Institute of Gastroenterology of the Siberian State Medical University, Seversk, Russian Federation

The study group included 61 patients with stage I — IV gastric and intestinal carcinomas. The control group consisted of 30 patients with chronic diseases and benign changes in the mucous membrane of the gastrointestinal tract (GIT) and 100 age and sex matched healthy donors. Malignant neoplasias were represented, mainly, by adenocarcinomas of various differentiation degree (83.3%), signet ring cell carcinoma (7.4%) and non-differentiated cancer (9.3%). GSTT1 and GSTM1 genotype has been analyzed by PCR.

GSTM1 null genotype 0/0 in control subjects was 15%, i.e. less than the population rate (23.3%). Higher percentage of GSTM1 null genotype was noted in patients with GIT malignancies. Differences between groups of cancer patients and healthy individuals were statistically significant (c2 = 36.3; p = 0.0001). Risk for GIT cancer development increased by 5.99 times (95% CI 3.10—11.73) in healthy subjects with GSTT1 genotype 0/0. Rate of GSTM1 null genotype in control subjects was 43.0% and corresponded to that observed in population of the north-western region of Russia (42.2%). In patients with GIT carcinoma GSTM1 0/0 (59.4%) exceeded the population level and was statistically significant compared with corresponding parameters of the observed healthy individuals (c2 = 7.20; p = 0.007). In healthy persons with GSTM1 0/0 the risk for lung cancer development increased by 1.96 times (95% CI 1.16 — 3.32). In patients with GIT carcinoma and metastases the frequency of homozygous alleles of GSTT1 0/0 was significantly higher than in lung cancer patients having no metasta-ses (59.0 and 42.0%, respectively; p = 0.022). In should be noted that similar dependence was established for GSTM1 0/0 (67.3 and 50.6%, respectively; p = 0.022).

Е. И. Субоч1, А. А. Машевский1, А. С. Бабенко2, С. А. Усанов2

ОЦЕНКА УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ПРОТООНКОГЕНА ЕRBB2 МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

1 ГУ Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им.. Н. Н. Александрова, Минск, Республика Беларусь

2 ГНУ Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь

Цель — разработка метода количественной оценки уровня экспрессии протоонкогена ERBB2 у больных раком молочной железы (РМЖ)с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Исследовано 155 образцов опухолей больных РМЖ. Выделение общей РНК проводили набором РНК-ВТК, для оценки уровня экспрессии ERBB2 использован набор cerbB2TM (ИБОХ НАНБ). В качестве референтного метода выполнено 136 иммуногистохимических (ИГХ) исследований опухолей больных РМЖ с использованием поликлональных антител и системы визуализации LSAB2+ («Dako»). Сконструированы праймеры и TaqMan зонды для количественной обратно-транскрибированной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) генов ERBB2 и GAPDH (внутренний контроль). Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты указанных генов, для создания внутреннего стандарта. Определено пороговое значение отсутствия или наличия гиперэкспрессии (0,15) по результатам ПЦР относительно ИГХ (ROC-анализ). Гиперэкспрессия ERBB2 присутствовала в 43 (27,7%) образцах. Статистический анализ показал отсутствие значимых различий (р = 0,0584) выявления гиперэкспрессии ERBB2 с помощью ИГХ и ОТ-ПЦР. Созданы наборы для выделения общей РНК из образцов опухолевой ткани и оценки уровня экспрессии протоонкогена ERBB2 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Разработанный метод характеризуется быстротой, экономичностью, получением количественного результата при минимальном содержании РНК в пробе и может являться дополнением к стандартным методикам (FISH, ИГХ) определения ERBB2-стaтусa у больных РМЖ.

E. I. Suboch1, A. A. Mashevsky1, A. S. Babenko2, S. A. Usanov2

EVALUATION OF ЕRBB2 PROTOONCOGENE EXPRESSION LEVEL BY MEANS OF REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN BREAST CANCER PATIENTS

1 N. N. Alexandrov National Cancer Centre, Minsk, Belarus

2 Institute of Bioorganic Chemistry, National Academy of Sciences, Minsk, Belarus

The objective of the study was to design a technique for quantitative evaluation of ERBB2 protooncogene expression level using real-time polymerase chain reaction in breast cancer patients. One hundred and fifty-five breast carcinoma samples were examined. Total RNA was extracted with RNA-VTK, cerbB2TM (IBCh NASB) was used to evaluate ERBB2 expression. For reference, 136 immunohistochemical (IHC) assays of breast tumors were made using polyclonal antibodies and the LSAB2+ (Dako) visualization system. Primers and TaqMan probes were designed for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of ERBB2 and GAPDH genes (internal control). Recombinant plasmids containing fragments of the above-mentioned genes were obtained to establish the internal standard. The threshold value of overexpression absence or presence (0.15) by PCR results related to IHC (ROC analysis) was determined. ERBB2 overexpression was present in 43 (27.7%) samples. Statistical analysis showed no significant differences (р = 0.0584) in detecting ERBB2 overexpression by IHC and qRT-PCR. Kits are produced for total RNA extraction from tumor tissue samples and evaluation of ERBB2 protooncogene expression by real-time qRT-PCR. The developed technique is rapid, efficient, ensures quantitative analysis with minimal RNA content in the sample and can be supplemental to standard techniques (FISH, IHC) for determining ERBB2 status in breast cancer patients.

А. Тавитьян

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ И РАЗВИТИЕ ПРОТЕОМНЫХ ПОДХОДОВ ДЛЯ КЛИНИЦИСТОВ

Институт Кюри, Париж, Франция

В течение последних 30 лет, после открытия клеточных протоонкогенов, исследования в области молекулярной биологии злокачественных клеток привели к описанию более 300 генов, которые задействованы в механизмах онкогенеза в опухолях всех типов. Были определены новые индивидуальные факторы, повышающие риск онкологических заболеваний (общая генетика) и молекулярные механизмы злокачественной трансформации (соматическая генетика). Такие элементы могут быть крайне важны не только для описания возможных мишеней, но и для ранней диагностики, прогноза течения заболевания и его предотвращения. Для полного понимания всех механизмов канцерогенеза необходимо проводить современные исследования геномных, транскриптомных и протеомных нарушений в больших группах опухолей определенных типов и классифицировать молекулярные нарушения, приводящие к развитию заболевания.

Протеомные исследования дополняют геномные подходы, предоставляя дополнительную информацию и, таким образом, крайне важны как для научных, так и для клинических целей. В ближайшем будущем лечение онкологических заболеваний должно стать эффективной персонализированной терапией. Однако существуют различные технические проблемы в исследовании протеома: 1) затрудненная автоматизация разделения и анализа белков; 2) методы детекции мало представленных белков с большим динамическим диапазоном требуют значительного технического совершенствования; 3) для изучения посттрансляционных модификаций потребуется предварительное исследование белков, например анализ структуры, общих аминокислотных последовательностей, а также активных сайтов для синтеза блокирующих моноклональных антител, или аптамеров; 4) необходима параллельная разработка высокопроизводительных биоинформатических инструментов, которые будут способствовать более точному анализу и построению точных баз данных.

A. Tavitian

MOLECULAR MARKERS AND DEVELOPMENT OF PROTEOMIC APPROACHES FOR THE CLINICIAN

Institut Curie, Paris, France

Over the last 30 years, since the discovery of cellular proto-oncogenes, study in molecular biology of cancer has resulted in description of more than 300 oncogenes involved in mechanisms of oncogenesis in cancers of all types. Novel cancer individual risk factors have been identified (constitutional genetics) and molecular mechanisms of malignant transformation (somatic genomics) have been described. These elements may be crucial to characterize putative targets, but they may also be important for early diagnosis, prognosis and prevention. To understand all the underlying mechanisms of carcinogenesis, comprehensive study of genetic, transcriptomic and proteomic alterations should be undertaken in large series in certain types of tumors to identify molecular based classification.

Proteomic studies complement genomics-based approaches, provide additional information and therefore, are highly important for both scientific and clinical issues. In the near future cancer treatment should become more effective and personalized. However there are certain technical challenges in proteomic technological processes, e.g. 1) protein separation and analysis are difficult to automate; 2) detection methods for low-abundant proteins with a broad dynamic range require many technological improvements; 3) analysis of post translational modifications requires preliminary selection of proteins, i.e. analysis of structure, common amino acid sequences, active sites for the synthesis of trapping monoclonal antibodies or aptamers; 4) in parallel, development of high-performance informatics tools is needed and should contribute to more accurate analysis and generation of precise databases.

Е. Г. Тимонина1, С. О. Подвязников1, О. А. Чегринец2, О. П. Колбацкая2,

В. А. Спиридонова3, З. Д. Жарова2, Е. М. Трещалина2, Е. Ю. Григорьева2,

Н. Н. Тупицын2

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА КОСТНОМОЗГОВЫХ МИКРОМЕТАСТАЗОВ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ГОЛОВЫ И ШЕИ

1 ГОУДПО РМАПО, Москва, Российская Федерация

2 ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

3 НИИ ФХБ им.. А. Н. Белозерского, МГУ, Москва, Российская Федерация

В последние годы появились публикации (D. Calnot и соавт., 2004) о клинической значимости обнаружения костномозговых микрометастазов плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) на основе экспрессии гена Е48 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и радиоактивным проявлением (гибридизация с 32Р-меченной пробой). Метод позволяет обнаруживать одну метастатическую клетку среди 107 миелокариоцитов. Нами проведено исследование костного мозга у 34 больных ПРГШ. Во всех случаях костный мозг был детально изучен морфологически. Метастатического поражения и каких-либо особенностей гемопоэза не выявлено. Стандартным методом ОТ-ПЦР экспрессия гена Е48 не выявлялась (РНК из (0,4—5,4) х 107 миелокариоцитов). С целью повышения чувствительности ОТ-ПЦР нами на модельной системе (клетки линии А431) использованы: проявление продукта ДНК-красителем SYBR, Саузерн-блоттинг с иммуноферментным (субстрат ECL) или иммунофлуоресцентным проявлением (FITC, сканирование на Typhoon 9440) включенного BRDU, радиомечение 32Р-цитозином с Саузерн-блоттингом и радиоавтографией. Оптимальным явился радиоактивный метод. Экспрессия гена Е48 выявлена в костном мозге 5 из 14 больных ПРГШ (35,7%), что соответствует данным литературы (до 40%). В настоящее время проводится анализ клинической значимости выявления микрометастазов ПРГШ данным высокочувствительным методом.

E. G. Timonina1, S. O. Podviaznikov1, O. A. Chegrinets2, O. P. Kolbatskaya2, V. A. Spiridonova3, Z. D. Zharova2, E. M. Treschalina2, E. Y. Grigorieva2, N. N. Tupitsyn2

MOLECULAR DIAGNOSTICS OF SQUAMOUS CELL HEAD AND NECK CANCER MICROMETASTASES IN BONE MARROW

1 Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow, Russian Federation

2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Centre RAMS, Moscow, Russian Federation

3 Research Institute of Physicochemical Biology, Moscow State University, Moscow, Russian Federation

Clinical significance of bone marrow (BM) micrometastases from squamous-cell head and neck cancer (SCHNC) was recently confirmed (D. Calnot et al., 2004). The method is based on expression of E48-gene by RT-PCR and radioactively-labeled 32P probe hybridization. Sensitivity is 1 tumor cell per 107 myelocaryocytes. We studied BM samples from 34 patients with SCHNC. BM was carefully analyzed morphologically in all cases. No BM metastatic involvement or haematopoietic peculiarities were detected. Expression of E48-gene was not detected by standard RT-PCR (RNA from 0.4 — 5.4 х 107 BM cells). To increase RT-PCR sensitivity in a model system (A431 cell line) we used the following methods: detection of RT-PCR product with SYBR, Southern blotting followed by the immunoenzymatic visualization (ECL as substrate) or immunofluorescent detection (FITC, Typhoon 9440-scanning) of BRDU incorporation, radiolabeling with 32P-cytosine followed by Southern blotting and radioautography. Radioactive method appeared optimal. E48 expression in BM was detected in 5 of 14 patients with SCHNC (35.7%), which was comparable with the literature rate (up to 40%). Now we are analyzing clinical significance of BM micrometastases from SCHNC.

М. А. Турчанинова1, А. А. Мещеряков2, Д. В. Ребриков3

ПРОФИЛЬ РНК ЦИТОКИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ИНСТРУМЕНТ ПРИ РАННЕМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

1 ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва, Российская Федерация

2 ГУ РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН, Москва, Российская Федерация

3 ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва, Российская Федерация

Исследования последних лет показали, что анализ внеклеточных ДНК и РНК, циркулирующих в плазме крови, является многообещающим диагностическим подходом. Оценка качественного и количественного профиля циркулирующих в кровотоке нуклеиновых кислот может стать удобным инструментом для диагностики, мониторинга и прогнозирования самых разных клинических состояний. В настоящее время внеклеточные ДНК и РНК используют для диагностики рака (в том числе и на ранних стадиях, когда опухоль еще не различима инструментальными методами анализа) и при мониторинге беременности (на основе анализа нуклеиновых кислот плода, циркулирующих в крови матери, можно, например, установить пол и резус-фактор плода). Цитокины — группа полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных функций организма. Исходя из гипотезы о появлении в кровотоке свободных нуклеиновых кислот в результате интенсивной гибели клеток в местах воспаления, можно предположить, что профиль представленности РНК цитокинов в плазме крови может характеризовать течение иммунных процессов самой разной локализации. В настоящей работе проанализирован профиль представленности РНК 14 цитокинов в плазме крови пациентов с диагнозом рак молочной железы. Результаты сопоставлены с результатами подобного обследования контрольной группы здоровых людей. Полученные данные показали, что относительные концентрации внеклеточных транс-криптов меняются в случае развития заболевания. Данный факт позволяет рассматривать этот показатель в качестве дополнительного диагностического и прогностического признака у больных раком молочной железы.

M. A. Turchaninova1, A. A. Mescheryakov2, D. V. Rebrikov3

CHARACTERIZATION OF SOME CYTOKINES GENE EXPRESSION PROFILE IN PLASMA OF PATIENTS WITH BREAST CANCER

1 Institute of Immunology, Moscow, Russian Federation

2 N. N. Blokhin. Russian Cancer Research. Center RAMS, Moscow, Russian Federation

3 ZAO "DNA-Technology", Moscow, Russian Federation

Recent studies have shown that analysis of extracellular nucleic acids is a promising diagnostic approach. Assessment of qualitative and quantitative profiles of circulating nucleic acids can be a convenient tool for monitoring and prognosis of various clinical states. At present circulating plasma nucleic acids are used for cancer diagnosis (including early stages, when the tumor is undetectable by instrumental methods of analysis) and pregnancy monitoring (circulating fetal nucleic acids are a source of genetic material for assessment of abnormal chromosome numbers and gender determination, diagnosis of genetic diseases, and monitoring of pregnancy-associated complications). Cytokines are a category of signaling molecules that are critical for the development and functioning of both the innate and adaptive immune responses. Cell death in the middle of inflammation is a possible source of circulating nucleic acids. Basing on this hypothesis one can assess cytokine gene expression profile in plasma. It is known that DNA and RNA circulating in plasma can be used for diagnostic purposes. However, the majority of researchers believe that this diagnostic approach has a much greater potential, and qualitative and quantitative profiles traced by DNA and RNA in plasma can be used as an indicator of the state of an organism as a whole. The aim of this study was to investigate a possible correlation between levels of extracellular nucleic acids in plasma and development of breast cancer. We have analyzed relative concentrations of extracellular RNA transcripts of 14 cytokines. The study was performed in 100 pa-

tients with breast cancer. The results were compared with those in healthy control group. The data showed that the relative concentrations of extracellular transcripts changed in cancer patients. This observation opens new opportunities for the diagnosis and prognosis of allergopathology.

Г. А. Хамидуллина, Е. Н. Середа, К. Ш. Нургазиев, А. И. Жусупова

ЭКСПРЕССИЯ МАРКЕРОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА В РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Казахский научно-исследовательский институт, онкологии и радиологии, Алматы., Казахстан

Ежегодно в Казахстане регистрируется 3100 новых случаев рака молочной железы (РМЖ), 5-летняя выживаемость составляет 49,5%, в связи с этим проблема РМЖ является актуальной и требует изучения. Perou с соавт. в 2000 г. предложили новую молекулярно-генетическую классификацию РМЖ, основанную на полном кластерном анализе 1753 генов. В результате выделены 4 подтипа: люминально-подобный, базально-подобный, НЕР2-позитивный и нормально-подобный. В 2006 г. M. Laakso с соавт. опубликовали схематическую классификацию РМЖ, основанную на цитокератиновом профиле. В настоящее время на основании этих двух классификаций в практику вошло суррогатное выделение предложенных подтипов РМЖ, основанное на иммуногистохимическом исследовании РЭ, РП и HER2neu: подтипы люминальный А (РЭ + ПР + HER2neu—) и люминальный Б (РЭ + ПР + HER2neu + ), подтип HER2neu + , базальный подтип (РЭ — ПР — HER2neu — ).

Цель исследования — изучение экспрессии белка Ki-67 и белка р53 в различных молекулярногенетических подтипах РМЖ. Объектом исследования послужили образцы ткани РМЖ 164 женщин (клинический материал Казахского НИИ онкологии и радиологии МЗ РК за 2007—2008 гг.). Гистологическое исследование проводилось по стандартной методике. Определяли гистологический тип опухоли согласно классификации ВОЗ (Лион, 2003), степень злокачественности по методу Scarff— Bloom—Richardson в модификации Elston и Ellis. Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием реагентов фирмы DAKO. При оценке экспрессии рецепторов стероидных гормонов пользовались полуколичественным методом по D. C. Allred и соавт. (1998). Оценка экспрессии HER2neu проводилась в соответствии со стандартами, утвержденными FDA для HercepTest™. Экспрессия белка Ki-67 оценивалась: низкий уровень — менее 20%, высокий уровень — более 20% (T. Pletilainen и соавт., 1996). Экспрессия белка р53: высокий уровень — положительная реакция более чем на 10% ядер опухолевых клеток, низкий уровень — менее чем на 10% ядер. Все полученные данные были занесены в созданную реляционную базу данных с проведением последующего компьютерного анализа. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием статистических программ «SPSS 11.5» и «Statistica 6.0».

Все больные разделены на 4 группы: люминальный подтип А составил 46%, люминальный подтип Б —18%, подтип HER2neu+ — 17%, базальный подтип — 19%. При люминальном подтипе А средний возраст составил 50 ± 1,08 года (31—82 года, интервал возраста 51 год), люминальном подтипе Б — 48 ± 1,55 года (35—67 года, интервал возраста 32 года), базальном подтипе — 48 ± 2,14 года (25—71 год, интервал возраста 46 лет), подтипе HER2neu+ — 50 ± 1,89 года (31—69 лет, интервал возраста 38 лет). Установлено преобладание инвазивного протокового РМЖ во всех исследованных группах больных (64—89%). Средний возраст больных РМЖ в различных группах был примерно одинаков (48—50 лет). В группе с люминальным подтипом Б РМЖ выявлена 4-кратная разница между больными азиатской и европейской групп, тогда как в других трех подтипах разница не превышала 2 раз. Наиболее высокий уровень пролиферативной активности опухолевых клеток (Ki-67) наблюдался в базальном подтипе РМЖ (54,9%), наименьший — в люминальном подтипе А (24,2%), что в 2,3 раза меньше (р = —0,946). Положительная экспрессия апоптотического белка р53 чаще встречалась в базальном подтипе РМЖ (74%), что в 2,2 раза выше, чем в люминальном подтипе А (р = —0,286). Выявлена положительная корреляционная зависимость между экспрессией p53 в базальном подтипе и подтипе HER2neu+ (р = 0,288) и отрицательная корреляционная зависимость — в люминальном подтипе А и подтипе HER2neu+ (р =

— 0,286). Получены достоверные результаты отрицательной корреляционной зависимости между уровнями экспрессии Ki-67 и р53 в люминальном подтипе А (р = —0,555) и положительной корреляционной зависимости в базальном подтипе РМЖ (р = 0,285). Установлена высокая пролиферативная активность и высокий уровень апоптоза опухолевых клеток при базальном подтипе РМЖ и относительно низкий

уровень этих же показателей при люминальном подтипе А, что согласуется с литературными данными (М. Ьаакво и соавт., 2006).

G. A. Khamidullina, E. N. Sereda, K. S. Nurgaziev, A. K. Zhussupova

EXPRESSION OF MARKERS OF THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS AT VARIOUS SUBTYPES OF BREAST CANCER

Kazakh Research Institute of Oncology and Radioilogy, Almaty, Kazakhstan

Every year 3100 new cases of breast cancer (BC) are registered in Kazakhstan, the five years' survival rate is 49.5 %; therefore the problem of BC is actual and demands further study. In 2000 Perou et al. offered a new molecular and genetic classification of BC based on full cluster analysis of 1753 genes. As a result four subtypes such as luminal-like, basal-like, HER2-positive and normal-like subtypes were identified. In 2006 M. Laakso et al. published the charted classification of BC based on cytokeratin profile. Basing on these two classifications surrogate BC subtypes are identified by results of immunohistochemical study of ER, PR and HER2neu, i.e. luminal A (ER + PR+HER2neu—), luminal B (ER + PR+HER2neu +), HER2neu+ and basal (ER—PR — HER2neu — ) subtypes.

The purpose of this study was to analyze expression of protein Ki-67 and squirrel p53 in various molecular and genetic subtypes of BC. Objects of the study were samples of breast tumour tissue of 164 women with diagnosis of BC (clinical specimens from the Kazakh Research Institute of Oncology and Radiology HM RK, 2007 — 2008). Histological study was made by standard procedure. Histological type of tumours was established according to the CART classification (Lyons, 2003), tumour grade was evaluated by the Scarff—Bloom — Richardson method in modification of Elston and Ellis. Immunohistochemical study was made using reagents supplied by DAKO. Assessment of steroid hormone receptor expression involved a semiquantitative method of D. C. Allred et al. (1998). Evaluation of HER2neu expression was made according to FDA-approved standards for HercepTest ™. Ki-67 expression was estimated as low, if found on less than 20% of cells, and high, if found on more than 20% of cells (T. Pletilainen et al., 1996). Expression of protein P53: high level was defined as positive reaction on more than 10% of tumour cell nuclei and low level as positive reaction on less than 10% of the nuclei. AH findings were entered into the framed relational database and computer analysis was made. Statistical processing of the received results was made using statistical programs "SPSS 11.5" and "STATISTICA 6.0".

All patients were divided into 4 molecular and genetic subtypes, i.e. luminal A (ER + PR + HER2neu — , 46%), luminal B (ER + PR+HER2neu + , 18%), HER2neu+ (17%), basal (ER—PR—HER2neu—, 19%) subtypes. Mean age was 50 ± 1.08 years (from 31 to 82 years, interval 51 years) in the luminal A subtype, 48 ± 1.55 years (from 35 to 67 years, interval 32 years) in the luminal B subtype, 48 ± 2.14 years (from 25 to 71 years, interval 46 years) in the basal subtype, 50 ± 1.89 years (from 31 to 69 years, interval 38 years) in the HER2neu+ subtype. Prevalence of infiltrative ductal BC was established in all investigated patient groups (64 — 89%). Mean age of BC patients in study groups was similar (48 — 50 years). In the group with luminal subtype of BC there was a 4-fold difference between patients of the Asian and European populations, whereas in other three subtypes the difference did not exceed 2-fold. The highest level of proliferative activity of tumour cells (Ki-67) was observed in the basal subtype of BC (54.9%), the lowest was found in luminal A (24.2%), that was 2.3-fold less (p =

— 0.946). Positive expression of apoptotic protein p53 was also more often met in basal subtype of BC (74%) and was 2.2-fold higher than in luminal A subtype (p = —0.286). There were a positive correlation between p53 expression in basal and HER2neu+ subtypes (p = 0.288) and a negative correlation in luminal A and HER2neu + subtypes (p = —0.286). We found the highest proliferative activity and a high level of apoptosis of tumour cells in the basal subtype of BC and a rather low level in the luminal A subtype, and this finding corresponded to the literature data (M. Laakso, M. Tanner, J. Nilsson et al., 2006).

Е. В. Хомутов, О. П. Шатова

ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ОТ ЭКСПРЕССИИ СЭ34

Донецкий национальный медицинский университет, им.. М. Горького, Донецк, Украина

Скорость опухолевого роста во многом зависит от скорости ангиогенеза. Показатель микроангио-генеза СБ34 может быть использован как маркер ранних стадий онкозаболеваний. Целью нашего исследования было определение взаимосвязи количества СБ34 со стадией заболевания и с активностью тромбоцитарного фактора роста эндотелия сосудов (РБ-БССР), который обладает тимидинфосфори-лазной активностью (ТФ). Исследовали 60 больных раком молочной железы (РМЖ) на разных стадиях заболевания в возрасте 35—70 лет. Определение СБ34 проводили иммуногистохимически, подсчет выполняли в 200 стандартных полях при помощи световой микроскопии, определение активности РБЕСР в сыворотке крови проводили спектрофотометрически.

Максимальная экспрессия СБ34 была у женщин с РМЖ в возрасте 45—55 лет (климактерический период). У пациенток с III стадией РМЖ (большой размер опухоли Т4, наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы N1—2) и низкой степенью гистологической дифференцировки (С3) количество СБ34 было максимальным и в среднем составляло 130 ± 10 в поле зрения по сравнению с женщинами, у которых наблюдалась I стадия заболевания и высокая степень дифференцировки — 80 ± 10 в поле зрения. Количество СБ34 достоверно положительно коррелировало с активностью тромбоцитарного фактора роста эндотелия сосудов (г2 = 0,73). Низкая дифференцировка и высокая экспрессия СБ34 при РМЖ достоверно коррелирует с высокой активностью тимидинфосфорилазы в сыворотке крови. Определение активности ТФ в сыворотке крови является критерием микроангиогенеза, что можно использовать для диагностики РМЖ на ранних стадиях.

E. V. Khomutov, O. P. Shatova

DEPENDENCE OF PLATELET-DERIVED ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR ACTIVITY ON CD34 EXPRESSION

Donetsk National Medical University, Donetsk, Ukraine

The rate of cancer growth depends considerably on the rate of angiogenesis. CD34 is an indicator of microangiogenesis and can be used as a marker of early stages of cancer. The aim of our study was to determine relationship of CD34 level with disease stage and activity of platelet-derived endothelial growth factor (PD-ECGF) that has thymidine phosphorylase (TP) activity. The study was carried out in 60 women with breast cancer (BC) of different stages, aged 35 to 70 years. Determination of CD34 was performed using immunohistochemistry. The count was obtained from 200 standard fields with light microscope. PDEGF activity in blood serum was determined spectrophotometrically.

Maximum CD34 level was found in BC patients 45 — 55 years of age (menopause). Patients with stage III BC (large tumor size T4, metastasis in regional lymph nodes N1—2) and low tumor differentiation (G3) demonstrated the highest CD34 levels of 80 ± 10 in field of view. CD34 levels correlated significantly with PD-ECGF activity (r2 = 0.73). Low tumor differentiation and high CD34 expression in BC patients correlated significantly with high activity of TP in blood serum. Determination of TP activity in blood serum is a microangiogenesis criterion that can be used in early diagnosis of BC.

А. Ф. Черноусов, Т. В. Хоробрых, М. В. Немцова, А. И. Глухов, И. И. Быков

МАРКЕРЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА ЖЕЛУДКА

ММА им.. И. М. Сеченова, Москва, Российская Федерация

Диагностика облигатных предраковых состояний — путь улучшения результатов лечения рака желудка. Возможности патоморфологического выявления этапов раковой трансформации оказываются недостаточными. Выявление маркеров генетической нестабильности, позволяющее диагностировать предрак в участках дисплазии и метаплазии, включает изучение изменений областей генов — регуляторов клеточного цикла, показателей метастатической и инвазивной активности, генов адгезионных белков, факторов активности неоангиогенеза, метилирования ДНК, теломеразы, потери гетерозиготности в биоптатах.

A. F. Chernousov, T. V. Horobryh, M. V. Nemtsova, A. I. Gluhov, 1.1. Bykov

GENETIC INSTABILITY MARKERS IN DIAGNOSTICS OF THE STOMACH CANCER

I. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow, Russian Federation

Diagnosis of obligate precancer conditions is a way to improve results of treatment of stomach cancer. Pathomorphologic evaluation of cancer transformation is insufficient. Detection of genetic instability markers that allow diagnosis of precancer in dis- and metaplasia sites includes study of changes in cellular cycle regulatory genes, metastasis and invasion activity indicators, genes of adhesive fibers, factors of neoangiogenesis activity, DNA methylation, telomerase, loss of heterozygosity in biopsies.

Е. В. Четверина, А. Б. Четверин

ВОЗМОЖНОСТИ НАНОКОЛОНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Институт белка РАН, Пущино, Российская Федерация

Наноколонии, состоящие из молекул ДНК, образуются при осуществлении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в полиакриламидном геле. Поскольку каждая колония представляет собой потомство одиночной молекулы, обнаружение и подсчет наноколоний позволяют прямо определять титр мишени (искомых молекул ДНК или РНК) в анализируемом образце. Нами разработана полная диагностическая процедура, основанная на использовании наноколоний. Эта процедура выявляет в клинических образцах до 100% молекул ДНК-мишени и 50% молекул РНК-мишени, что эквивалентно чувствительности 1 и

2 молекул соответственно. Процедура испытана путем определения абсолютного титра РНК-мишеней в цельной крови для выявления минимальной остаточной болезни при лейкозе, а также для поиска РНК-маркеров злокачественных опухолей. Публикации зарубежных лабораторий демонстрируют, что применение наноколоний (часто называемых «полониями») позволяет на порядки повысить чувствительность и производительность Я№-анализа (анализа однонуклеотидного полиморфизма геномов), определения лекарственной устойчивости вирусов и злокачественных опухолей, выявления множественных вариантов альтернативного сплайсинга мРНК, а также высокопроизводительного секвенирования геномов, что также может быть применено для диагностики.

E. V. Chetverina, A. B. Chetverin POTENTIALS OF NANOCOLONIES FOR THE DIAGNOSIS OF CANCER

Institute of Protein Research. RAS, Pushchino, Russian Federation

Nanocolonies consisting of DNA molecules are generated during polymerase chain reaction (PCR) in polyacrylamide gel. Since each colony is progeny of a single molecule, detection and count of nanocolonies allow direct measurement of target (the assayed DNA or RNA molecules) titers in samples. We developed a complete diagnostic procedure based on the use of nanocolonies. This procedure detects up to 100% of DNA and 50% of an RNA target molecules in clinical samples, i.e. the method sensitivity is 1 and 2 molecules, respectively. The procedure was tested by measurement of absolute mRNA titers in whole blood for monitoring of minimal residual disease in leukemia patients and for detection of RNA markers of malignant tumors. Publications from foreign laboratories demonstrate that use of nanocolonies (often referred to as "polonies") leads to increase by several orders of magnitude in sensitivity and performance of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis, detection of drug resistance of viruses and malignant tumors, determination of multiple variants of alternative mRNA splicing and high-throughput genome sequencing, that can also be used for diagnostic purposes.