CC BY
35
клиническая оценка профиля метилирования промоторных областей 8 генов хромосомы 3 и гена mgmt при люминальном типе рака молочной железы
д.А. рябчиков1, и.К. Воротников1, т.П. Казубская1, C.C. Лукина2, Е.А. филиппова2, А.м. Бурденный2, В.и. Логинов2, 3
1ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24; 2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; Россия, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8; 3ФБГНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1
Контакты: Денис Анатольевич Рябчиков dr.denisr@mail.ru
Введение. Эпигенетические изменения генов-супрессоров опухолевого роста рассматривают как наиболее тонкий и динамичный механизм регуляции генов, в том числе генов, вовлеченных в развитие рака молочной железы (РМЖ). Огромный интерес в изучении роли метилирования в патогенезе РМЖ представляют гены, расположенные на коротком плече хромосомы 3, и ген MGMT (10q26), для которых имеются крайне противоречивые данные об уровне их метилирования в опухолях. Цель исследования — изучение роли метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2, RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 и MGMTв патогенезе эпителиальных опухолей молочной железы.
Материалы и методы. Образцы опухолевой и окружающей гистологически неизмененной ткани от 174 больных РМЖ собраны и клинически охарактеризованы в ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Анализ метилирования ДНК проводили с использованием 2 независимых методов. Метилирование генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2 и MGMT изучали с помощью полимеразной цепной реакции, специфичной к метилированному аллелю. Анализ метилирования промоторных районов генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1 и NKIRAS1 выполняли с применением 2 метилчувствительныхрестриктаз — HpaII и HhaI — и последующей полимеразной цепной реакции.
Результаты. Показана статистически значимо высокая частота метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2 и MGMT в эпителиальных опухолях молочной железы по сравнению с гистологически нормальной тканью от тех же пациенток. Выявлены значимые корреляции частоты метилирования генов RARß2 и MGMT с различными клинико-морфологическими характеристиками злокачественного процесса. Впервые показана статистически значимая связь между метилированием генов RASSF1A, RARß2 и MGMT и выживаемостью пациенток.
Заключение. Полученные данные об эпигенетических нарушениях при люминальном типе РМЖ дополняют «молекулярный портрет» этого вида рака и вносят вклад в понимание его патогенеза. Выявленные особенности метилирования исследованных генов могут найти клиническое применение для разработки современных подходов к прогнозированию, профилактике и выбору тактики лечения РМЖ у пациенток московского региона.
Ключевые слова: метилирование, промоторная область, CpG-островок, рак молочной железы
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-38-45
CLINICAL ASSESSEMENT OF THE 8 GENES ON CHROMOSOME 3 wITH ALSO MGMT GENE PROMOTER REGIONS METHYLATON STATuS IN Patients wITH Breast CANCER LuMINAL HYSTOTYPE
D.A. Ryabchikov1, I.K. Vorotnikov', T.P. Kazubskaya1, S.S. Lukina2, E.A. Filippova2, A.M. Burdennyy2, V.I. Loginov2,3
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 24 Kashirskoe Sh., Moscow '15478, Russia;
2Institute of General Pathology and Pathophysiology; 8 Baltiyskaya St., Moscow '25315, Russia;
3Research Center of Medical Genetics; ' Moskvorech'e St., Moscow '15478, Russia
Background. Epigenetic changes of TSG are supposed as the most fine and active genes regulation mechanism in particular breast cancer (BC) genes pathway development. The most valuable results are awaited for methylation role of genes located on the short arm of chromosome 3 with also MGMT gene (10q26) in BC pathogenesis because of their ambiguous data for methylation status in tumors. Objective: to illustrate the specific methylation role of the RASSF'A, SEMA3B, RARfi2, RHOA, GPX', USP4, DAG', NKIRAS' and MGMT genes promoter regions in BC pathogenesis.
Materials and methods. Sample set of 174 BC patients consists of tumor and surrounding histologically normal tissue that were collected and clinically characterized in the N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology. Two substantive methods were used to evaluate DNA methylation status. To analyse RASSF1A, SEMA3B, RARft2 and MGMT genes methylation we used polymerase chain reaction specific for the methylated allele. Whereas for analyses RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 promoter regions genes methylation status was used methyl sensitive restriction analyses with 2 methyl sensitive endonuclaeses Hpall and Hhal with subsequent polymerase chain reaction.
Results. A statistically significant high frequency of RASSF1A, SEMA3B, RARfi2, and MGMT genes methylation in epithelial breast tumors compared with histologically normal tissue from the same patients was shown. Significant correlation of RARfi2 and MGMT genes methylation frequency considering the different clinical and morphological characteristics of the malignant process was revealed. The statistically significant relationship between methylation of RASSF1A, RARfi2 and MGMT genes and patient survival is shown for the first time.
Conclusion. The findings of epigenetic changes in the luminal BC supplement the "molecular picture" of this cancer and contribute to an understanding of its pathogenesis. The revealed features of investigated genes methylation can find clinical application for the development of modern approaches to prognosis, prevention and choice of tactics for treatment of BC in females of the Moscow region.
Key words: methylation, promoter region, CpG-island, breast cancer
Введение
Несмотря на успехи в развитии клинической и экспериментальной онкологии, рак молочной железы (РМЖ) остается самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин. Так, в России в год диагностируют более 53 тыс. новых случаев РМЖ. В Москве и Санкт-Петербурге эти показатели максимальные и составляют 52,3 и 48,1 на 100 тыс. женщин соответственно [1, 2]. По данным канцер-регистра в США на 2013 г., выявлено около 232 340 случаев РМЖ и зарегистрировано 39 620 летальных исходов от этой болезни [3]. На развитие данного заболевания оказывают влияние многие факторы, такие как образ жизни, гормональные, генетические и окружающие факторы среды, и, как известно, их канцерогенез является многоступенчатым процессом, включающим различные мо-лекулярно-генетические изменения, в том числе эпигенетические нарушения в генах, ассоциированных с развитием опухоли. Большинство из них — гены «домашнего хозяйства», обеспечивающие поддержание нормального функционирования клетки, ее защиту от факторов внешней среды и поддержание целостности ее структуры [4]. Эпигенетическая модификация (метилирование) регуляторных участков этих генов нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (methyl CpG binding proteins), и, кроме того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние [5, 6]. К таким генам относятся RASSF1A, SEMA3B, RARP2, RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1, расположенные на коротком плече хромосомы 3 (рис. 1) и ген MGMT (10q26).
Ген RASSF1A располагается в кластере связанных с канцерогенезом генов в районе 3p21.31 [7]. Белковый продукт гена относится к цитоплазматическим
белкам. Выявлено многообразие функций этого белка в клетке, например задержка клеточного цикла в фазе G1/S-перехода, влияние на содержание циклина D1 и фосфорилирование белка pRb [8]. Белок гена RASSF1A вовлечен также в индукцию апоптоза и стабилизацию микротрубочек [9]. Метилирование гена RASSF1A в опухолях различной локализации рассматривают как способ подавления его супрессорной функции при онкогенезе [10]. Похожая ситуация и с геном SEMA3B, расположенным в районе 3р21.31 [11].
Ген RHOA принимает участие в процессах формирования актинового цитоскелета, выполняет 3р
24,2 ]i NKIRAS1 23 li RARP2
21,33
21,31
I SEMA3B RASSF1A
Рис. 1. Расположение исследованных генов на 3р
важную роль в подвижности и адгезии клеток. Данный ген может вызывать экзогенно трансформацию клеток как in vitro, так in vivo. Предполагается, что RHOA участвует в инвазии и метастазировании опухолей [12]. Активация его экспрессии в эпителиальных опухолях может быть связана как с частичным деметилированием, так и с амплификацией локуса [13, 14]. Эти результаты согласуются с данными об онкогенном потенциале гена и его участии в инвазии [15].
Ген DAG1 кодирует дистрогликан — белок адгезии, который состоит из 2 субъединиц (трансмембранной и внеклеточной) и выполняет взаимосвязь внеклеточного матрикса с цитоскелетом. Описаны связи адгезии клеток с дистрогликаном, инвазией и метастазированием опухолей [16].
Ген GPX1 является наиболее распространенным членом семейства глутатионпероксидаз. Этот белок локализован в митохондриях, ядре и цитоплазме. Данный антиоксидантный селенопротеин играет важную роль в защите клеток от окислительного стресса и разрушения. Показано снижение уровней белкового продукта и матричной РНК в опухолях, и выявлена способность GPX1 подавлять рост эндо-телиальной линии клеток ECV304 [17]. В недавно опубликованных исследованиях других авторов, выполненных на клеточных линиях РМЖ и образцах опухолей у больных раком желудка, также продемонстрирована роль метилирования в регуляции GPX1 [18, 19]. Эти результаты согласуются с данными об опухолесупрессорной активности гена [17].
Ген USP4 кодирует убиквитинспецифическую протеазу 4-го типа, которая отщепляет убиквитин и на время останавливает процесс протеолитической деградации регуляторных белков, включая p27, р53, циклины, pRb, NF-kB, транскрипционные факторы E2F, c-jun, c-fos, онкогены c-myc и Ser/Thr-киназу c-mos. Описано повышение уровня матричной РНК USP4 при раке легкого [20].
Ген RARß2 (3p23 — p22.3) относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лигандактивирующими транскрипционными факторами [21]. Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды — витамин А и его биологически активные метаболиты. Представлены данные о том, что метилирование 5'-области и экзона 1 гена RARß2 сопровождается подавлением транскрипции гена в эпителиальных опухолях различных локализаций, в том числе при РМЖ [22].
Ген NKIRAS1 является гомологом онкогена Ras, который взаимодействует с фактором некроза NF-kB. Белковый продукт гена может функционировать как G-белки, проявляющие GTPазную активность. Данный ген принимает участие в регуляции деградации IkB и вместе с IkB может подавлять актив-
ность NF-kB [23]. NKIRAS1 идентифицирован с помощью гибридизации Notl-микропанелей в поиске генов, подверженных делециям, метилированию и амплификациям, как наиболее распространенная мишень структурных изменений такого типа в различных локализациях эпителиальных опухолей [8].
Ген MGMT кодирует фермент 06-метилгуа-нин-метилтрансфераза, участвующий в прямой репарации ДНК. Данный фермент выполняет активирующую функцию переноса метильной группы от 06-метилгуанина к остатку цистеина, что помогает восстановить нормальную структуру ДНК после вызванного алкильными соединениями повреждения [24]. В ряде работ обнаружено, что гиперметилирование CpG-островка MGMT взаимосвязано с инактивацией его транскрипции и, как правило, сопровождается перестройкой хроматина в неактивное состояние [25].
Одними из причин низкой выживаемости больных РМЖ являются бессимптомное течение на ранних стадиях, отсутствие достаточно эффективной диагностики заболевания и его устойчивость к химиотерапии. Известно, что нарушение паттерна метилирования ДНК наблюдается на всех стадиях канцерогенеза, что может быть использовано для диагностики и прогноза злокачественных опухолей [26].
В настоящей работе представлены результаты изучения метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2, RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 и MGMT в эпителиальных опухолях молочной железы. Определена частота метилирования промоторных районов (т. е. доля образцов, в которых наблюдали метилирование), и показана достоверная корреляция частоты метилирования этих районов с прогрессированием РМЖ.
Материалы и методы
Исследование проводили на выборке из 174 пациенток с РМЖ, проходивших обследование и лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Также использовали выборку здоровых женщин в качестве контрольной группы. У 6 (3,6 %) больных РМЖ наблюдалось билатеральное поражение, поэтому мы дополнительно анализировали результаты с учетом этого фактора. Больные описаны в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и гистологически на основании классификации Всемирной организации здравоохранения [27, 28]. У 127 (75,6 %) пациенток выявлен люминальный гистологический тип опухоли.
Всем больным на материале удаленной опухоли проведены рутинное гистологическое и иммуноги-стохимическое исследования. Во всех случаях одним
Оригинальные статьи 41
морфологом был выполнен пересмотр гистологических препаратов операционного материала, хранящихся в архиве патологоанатомического отделения: проведено уточнение гистологического типа опухоли и степени дифференцирования в соответствии с действующей классификацией опухолей молочной железы Всемирной организации здравоохранения (2013). Во всех случаях сделано иммуногистохими-ческое исследование экспрессии андрогеновых и эстрогеновых рецепторов, прогестерона, эпидер-мального фактора роста 2-го типа (Her2/neu) и про-лиферативной активности опухоли (индекс Ki-67). Данные по числу образцов представлены в табл. 1.
Исследование выполняли на серийных депара-финизированных срезах опухолевой ткани с помощью биотин-стрептавидинового иммуноперо-ксидазного метода с антителами к эстрогеновым рецепторам a (SP1, Cell Marque), прогестерону (SP42, Cell Marque), андрогеновым рецепторам (F39.4.1, Biogenex), Her2 /neu (Herceptest, Dako) и Ki-67 (MIB1, Dako). Срезы толщиной 3—4 мкм депарафи-низировали и регидратировали по стандартной схеме. Оценку реакции гормональных рецепторов проводили в опухоли полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антигенположительных клеток [29].
Тотальную ДНК выделяли из образцов ткани молочной железы по стандартной методике фенол-хлороформной очистки. ДНК хранили при температуре —20 °С. Качество и концентрацию ДНК проверяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, США).
Анализ метилирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦр) и бисульфитной модификации днк. Метилирование генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2 и MGMT изучали с помощью ПЦР, специфич-
таблица 1. Патоморфологические характеристики образцов люми-нального РМЖ
фактор
Морфологическая форма:
протоковыи 104
дольковыи 10
смешанный 14
редкая 5
Her2/neu:
нет 108
есть 25
Ki-67:
нет 68
есть 65
Андрогены:
нет 6
есть 59
ной к метилированному аллелю (метилспецифичная ПЦР). Данный метод основан на бисульфитной конверсии ДНК, которая достигается взаимодействием молекул гидросульфита с цитозином с превращением последнего в урацил. В дальнейшем осуществляется амплификация исследуемого фрагмента ДНК с помощью ПЦР. При этом все остатки урацила и тимина амплифицируются как ти-мин, и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин [30]. Последовательности олигонуклео-тидных праймеров и условия проведения ПЦР взяты из выполненных ранее работ [31, 32].
Анализ метилирования промоторных районов генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 проводили с применением метилчувствительной реакции. Метод основан на способности метилчувствительных ре-стриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидроли-зованными участки, содержащие 5-метилцитозин. ДНК последовательно гидролизовали с 2 метилчув-ствительными рестриктазами Hpall (CCGG) и Hhal (GCGC) (Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США) в условиях, приведенных в протоколах фирмы-изготовителя, и использовали в качестве матрицы для ПЦР. Для амплификации применяли 2,5 мкл гидролизованной ДНК. Последовательности олиго-нуклеотидных праймеров и условия проведения ПЦР взяты из ранее выполненных работ [14].
Продукты ПЦР исследуемых и контрольных фрагментов генов разделяли одновременно путем электрофореза в 10 % полиакриламидном геле.
Статистический анализ данных проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0,05. Конкордантность данных по метилированию оценивали с помощью непараметрической ранговой корреляции Спирмена. Значимость корреляции по Спирмену (Rs) проверяли с помощью t-теста Стьюдента. Отсчет безрецидивной выживаемости определялся с использованием метода Каплана—Майера и системы для статистического анализа данных SPSS 20.0.
Результаты и обсуждение
Известно, что CpG-островки генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2, RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 и MGMT перекрывают 5' — область гена, включая старт транскрипции и участок промоторной области. У гена GPX1 CpG-островок охватывает промоторную область и весь ген. Статус метилирования CpG-островков указанных генах изучен на выборке из 174 парных образцов опухоль/неизмененная ткань у больных РМЖ, данные по частотам метилирования представлены в табл. 2. Обнаружено, что при оценке метилирования генов SEMA3B, RASSF1A, RARß2 и MGMT их частота в опухолевой ткани составила
n
Таблица 2. Частота метилирования генов в опухоли и гистологически нормальной ткани молочных желез
Ген Опухолевая ткань Нормальная ткань
n % n %
RASSF1A (n = 174) 55 31,6* 1 0,6
SEMA3B (n = 174) 66 37,9* 12 6,9
RARP2 (n = 174) 50 28,7* 9 5,2
MGMT (n = 174) 23 13,2* 0 0
USP4 (n = 92) 21 22,8 14 15,2
GPX1 (n = 92) 18 19,6 10 10,9
RHOA (n = 92) 12 13,0 8 8,7
DAG1 (n = 92) 19 20,7 15 16,3
NKIRAS1 (n = 92) 26 28,3 23 25,0
*Различия достоверны по сравнению с нормальной тканью (р <0,0001).
■
37,9; 31,6; 28,7 и 13,2 % соответственно, и во всех случаях была значимо выше, чем в образцах гистологически нормальной ткани (р <0,0001). Отмечено, что частота метилирования изучаемых генов весьма близка или совпадает с опубликованными результатами мировых исследований [33]. В то же время изменение статуса метилирования CpG-островков генов RHOA, USP4, GPX1, DAG1 и NKIRAS1 выявлено в меньшем количестве случаев (см. табл. 2) и различия в частоте метилирования в опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани статистически незначимы.
Отметим, что у 133 из 174 пациенток был диагностирован люминальный подтип РМЖ, при этом у 6 больных зарегистрировано двухстороннее поражение молочных желез. По этой причине исследуемые пациентки были разделены на 3 независимые группы по подтипам РМЖ: люминальный РМЖ (n = 133), Erb-B2 (n = 13) и трижды негативный РМЖ (n = 28). Был проведен анализ статуса метилирования для каждой группы, для того чтобы установить значимость более «тяжелых» форм РМЖ в патогенезе заболевания. Также проанализирована частота метилирования исследуемых генов в группе с люминаль-ным подтипом РМЖ, чтобы оценить сохранение изменения статуса метилирования в опухоли по сравнению с гистологически нормальной тканью и подтвердить связь люминального гистологического типа РМЖ с изменением статуса метилирования исследованных генов и, соответственно, с патогенезом заболевания. Статистически значимых различий в изменении метилирования исследованных генов в зависимости от типа РМЖ не найдено. При этом сравнение внутри отдельных групп РМЖ показало, что изменение частоты метилирования генов
RASSF1A (30,8 %; р = 0,00001), SEMA3B (38,3 %; р = 0,00001), МОМТ (11,3 %; р = 0,00001) и ЯАЯр2 (27,1 %; р = 0,00001; рис. 2) в опухоли статистически значимо выше, чем в прилежащей нормальной ткани при люминальном подтипе РМЖ. Результаты мировых исследований противоречивы, и наши данные могут оказаться интересными для понимания роли генов хромосомы 3 в развитии люминального подтипа РМЖ.
Для оценки вклада метилирования исследованных генов в развитие отдельных подтипов люминаль-ного РМЖ выборка из 133 случаев люминального РМЖ была разделена на 3 независимые подгруппы: люминальный подтип А (п = 61 (45,9 %)), люминальный Нег2/пеи- подтип Б (п = 47 (35,3 %)) и люминальный Нег2/пеи+ подтип Б (п = 25 (18,8 %)). Данные по частотам метилирования исследованных генов представлены в табл. 3.
Отметим, что статистически значимых различий в частоте метилирования промоторных CpG-островков генов RASSF1A, SEMA3B, ЯИОА, ОРХ1,
RASSF1A | °'8 SEMA3B RARP2 MGMT NKIRAS1 DAG1 RHOA GPX1 USP4
0
30,8
38,3
0
3°
1 % 4°
Нормальная ткань
Люминальный РМЖ
Рис. 2. Уровень метилирования генов в образцах люминального РМЖ и нормальной ткани молочных желез
Таблица 3. Уровень метилирования генов в зависимости от подтипа люминального РМЖ
Ген Подтип А Подтип Б Her2neu- Подтип Б Her2/neu+
n % n % n %
RASSF1A 19 31,1 15 31,9 7 28,0
SEMA3B 22 36,1 18 38,3 11 44,0
RARß2 10 16,4 15 31,9* 11 44,0*
MGMT 2 3,3 8 17,0* 5 20,0*
USP4 8 24,2 6 24,0 4 30,8
GPX1 6 18,2 4 16,0 5 38,5
RHOA 6 18,2 4 16,0 1 7,7
DAG1 7 21,2 5 20,0 3 23,1
NKIRAS1 9 27,3 5 20,0 4 30,8
*Различия достоверны по сравнению с подтипом А прир <0,05.
USP4, DAG1 и NKIRAS1 при сравнении разных подтипов люминального РМЖ не найдено. При этом уровень частоты метилирования генов MGMT и RARß2 в образцах РМЖ подтипа А был статистически значимо меньше (р <0,05), чем в обоих подтипах Б (см. табл. 3). Так, частота метилирования RARß2 была 16,4 %, что в 2 и 3 раза меньше, чем у подтипов Б Her2/neu- и Her2/neu+. Частота метилирования для гена MGMT была в 5 и 6 раз ниже по сравнению с подтипами Б Her2/neu- и Her2/neu+. Полученные результаты указывают на связь этих генов с развитием люминального РМЖ подтипа Б, что согласуется с данными литературы [33—35]. Это позволяет рассматривать данные гены как молекулярные маркеры неблагоприятного прогноза РМЖ.
Нами был проанализирован статус метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2 и MGMT с учетом патоморфологических характеристик люминаль-ного РМЖ (см. табл. 1). Показано, что в группе больных с гиперэкспрессией Her2 уровень метилирования RARß2 значимо выше, чем в группе с Her2-(44 % против 23,1 %;р <0,05). Повышенный уровень Ki-67 статистически значимо ассоциирован с метилированием генов MGMT (20 % против 2,9 %; p <0,05) и RARß2 (38,5 % против 16,2 %; p <0,05).
Нами изучена корреляция среднего уровня смертности и выживаемости пациенток со статусом метилирования в зависимости от уровня метилирования 9 исследованных генов. Среднее время наблюдения составило 98,75 ± 53,36 мес (4,10—208,06 мес, медиана 100,6 мес). За этот период 22 (17,3 %) из 127 пациенток умерли, прогрессия зарегистрирована у 30 (23,6 %). Анализ смертности больных люминальным РМЖ в зависимости от метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RARß2, MGMT, USP4, GPX1,
■ Метилирование ■ Нет метилирования
Рис. 3. Частота смертности больных люминальным РМЖ в зависимости от метилирования 9 исследованных генов
RHOA, DAG1 и NKIRAS1 показал достоверную корреляцию для 3 генов: RASSF1A, RARfi2 и MGMT(рис. 3). Для RASSF1A уровень смертности увеличился в 2,9 раза, для RARfi2 — в 2,3 раза и для MGMT — в 3,5 раза.
Тенденция к снижению общей выживаемости больных с метилированием генов RASSF1A, RARfi2 и MGMT начала выявляться уже через год (рис. 4). Так, 5- и 10-летняя выживаемость больных без метилирования RASSF1A составила 93,5 и 85,5 %, с метилированием эти показатели достоверно ниже — 80,3 и 65,3 % соответственно (р = 0,007; см. рис. 4а). У больных без метилирования RARp2 5- и 10-летняя выживаемость — 91,3 и 83,7 %, с метилированием показатели достоверно ниже — 84,3 и 67,2 % соответственно (р = 0,038; см. рис. 4б). У пациентов с метилированием MGMT 5- и 10-летняя выживаемость — 92,9 и 84,1 %, с отсутствием метилирования достоверно ниже — 63,8 и 42,5 % соответственно (р = 0,0008; см. рис. 4в). Выявленная нами связь
44 Оригинальные статьи
Умерли Живы
t. 1- i —I 4 4. — H E ет м сть м етил етш иров иро ания ванне
l -, i. 1 T I— 1
t « 1
1 4..- - "п 1
1
0 12 24 36
72 84
108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 Время, мес
а
в
Умерли Живы
1 — ч Нет лети лир ован ия
1 •— - 1 1 П — ■v. 1 tcib мет илир ова ние
L.
•1 •1
« - ■ ■ 1
1 t ч
1 1. _ M
0,30 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216
Время, мес
б
Умерли Живы
t: о- H «-а -M—M — - ет м сть ети мет» пирс лир ван ован ия ие
« ( il -г н- 1,
» i-t- - 1 —H—
1-
i- h —
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 Время, мес
метилирования гена RASSF1A с выживаемостью пациенток с люминальным РМЖ согласуется с данными зарубежных исследователей [36].
Заключение
Таким образом, в настоящей работе изучено метилирование промоторных районов 9 генов у больных РМЖ, проживающих в Москве и Московской области. Показана статистически
Рис. 4. Общая выживаемость больных люминальным РМЖ в зависимости от метилирования генов RASSF1A (а), ЯАЩ>2 (б), MGMT (в)
значимо высокая частота метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RARp2 и МОМТ в эпителиальных опухолях молочной железы по сравнению с гистологически нормальной тканью от тех же пациенток. Выявлены значимые корреляции частоты метилирования генов RARp2 и МОМТ с различными клинико-морфологическими характеристиками злокачественного процесса. Впервые продемонстрированы связь метилирования промо-торных районов этих генов с люминальным фенотипом Б и статистически значимая связь метилирования генов RASSF1A, RARp2 и МОМТ с выживаемостью пациенток.
Полученные данные об эпигенетических нарушениях при люминальном типе РМЖ дополняют «молекулярный портрет» этого вида рака и вносят вклад в понимание его патогенеза. Выявленные особенности метилирования исследованных генов могут найти клиническое применение для разработки современных подходов к прогнозированию, профилактике и выбору тактики лечения РМЖ у пациенток московского региона.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 14-15-000654).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Состояние онкологической помощи населению России в 2014 году. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старин-ского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2015. С. 5-11.
2. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2008 г. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2010;21(S2):52-86.
3. Safarpour D., Tavassoli F.A. A targetable androgen receptor-positive breast cancer
subtype hidden among the triple-negative cancers. Arch Pathol Lab Med 2015;139(5):612-7. DOI: 10.5858/ arpa.2014-0122-RA. PMID: 25310144.
4. Buganim Y., Rotter V. p53: balancing tumour suppression and implications for the clinic. Eur J Cancer
2009;45(Suppl 1):217—34.
DOI: 10.1016/S0959-8049(09)70037-1.
PMID: 19775621.
5. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 2002;16(1):6-21. DOI: 10.1101/ gad.947102. PMID: 11782440.
6. Prokhortchouk E., Hendrich B. Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs? Oncogene 2002;21(35):5394-9.
DOI: 10.1038/sj.onc.1205631. PMID: 12154402.
7. Zabarovsky E.R., Senchenko V., Loginov V. et al. Positional cloning of tumor suppressor genes from 3p21.3 involved in major human cancers. In book: Horizons in Cancer Research. Ed. F. Columbus. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2011, 42, chapter 4. Pp. 103-127.
8. Dmitriev AA., Kashuba V.I., Haraldson K. et al. Genetic and epigenetic analysis
of non-small cell lung cancer with NotI-microarrays. Epigenetics 2012;7(5):502-13. DOI: 10.4161/epi.19801. PMID: 22491060.
9. Agathanggelou A., Cooper W.N., Latif F. Role of the Ras-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers. Cancer Res 2005;65(9):3497-508. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-4088. PMID: 15867337.
10. Kashuba V., Dmitriev A.A., Krasnov G.S. et al. NotI microarrays: novel epigenetic markers for early detection and prognosis of high grade serous ovarian cancer.
Int J Mol Sci 2012;13(10):13352-77. DOI: 10.3390/ijms131013352. PMID: 23202957.
11. Брага Э.А., Ходырев Д.С., Логинов В.И. и др. Метилирование в регуляции экспрессии генов хромосомы 3 и генов микроРНК при светлоклеточ-ном почечно-клеточном раке. Генетика 2015;51(6):668-74.
12. Horiuchi A., Imai T., Wang C. et al. Up-regulation of small GTPases, RhoA and RhoC, is associated with tumor progression in ovarian carcinoma.
Lab Invest 2003;83(6):861-70. PMID: 12808121.
13. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В. и др. Изменение метилирования генов из критичных районов хромосомы 3 в эпителиальных опухолях. Молекулярная медицина 2011;1:3-10.
14. Логинов В.И., Пронина И.В., Бурден-ный А.М. и др. Роль метилирования в регуляции экспрессии функционально значимых генов хромосомы 3: RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 -в опухолях молочной железы. Молекулярная медицина 2014;6:30-7.
15. Ma L., Liu Y.P., Geng C.Z. et al. Overexpression of Rhoa is associated with progression in invasive breast duct
carcinoma. Breast J 2010;16(1):105-7. DOI: 10.1111/j.1524-4741.2009.00860.x. PMID: 19912238.
16. Brennan P.A., Jing J., Ethunandan M., Gorecki D. Dystroglycan complex in cancer. Eur J Surg Oncol 2004;30(6):589-92. DOI: 10.1016/j. ejso.2004.03.014. PMID: 15256230.
17. Faucher K., Rabinovitch-Chable H., Barriere G. et al. Overexpression
of cytosolic glutathione peroxidase (GPX1) delays endothelial cell growth and increases resistance to toxic challenges. Biochimie 2003;85(6):611-7. PMID: 12829378.
18. Min S.Y., Kim H.S., Jung E.J. et al. Prognostic significance of glutathione peroxidase 1 (GPX1) down-regulation and correlation with aberrant promoter methylation in human gastric cancer. Anticancer Res 2012;32(8):3169-75. PMID: 22843889.
19. Kulak M.V., Cyr A.R., Woodfield G.W. et al. Transcriptional regulation of the GPX' gene by TFAP2C and aberrant CpG methylation in human breast cancer. Oncogene 2013;32(34):4043-51. DOI: 10.1038/onc.2012.400.
PMID: 22964634.
20. Hwang S.J., Lee H.W., Kim H.R. et al. Ubiquitin-specfic protease 4 controls metastatic potential through p-catenin stabilization in brain metastatic lung adenocarcinoma. Sci Rep 2016;6:21596. DOI: 10.1038/srep21596.
PMID: 26883469.
21. Xu X.C. Tumor-suppressive activity
of retinoic acid receptor-beta in cancer. Cancer Lett 2007;253(1):14-24. DOI: 0.1016/j.canlet.2006.11.019. PMID: 17188427.
22. Wu L., Shen Y., Peng X. et al. Aberrant promoter methylation of cancer-related genes in human breast cancer. Oncol Lett 2016;12(6):5145-55. DOI: 10.3892/ ol.2016.5351. PMID: 28105221.
23. Chen Y., Vallee S., Wu J. et al. Inhibition of NF-kappaB activity by IkappaBbeta in association with kappaB-Ras. Mol Cell Biol 2004;24(7):3048-56.
DOI: 10.1128/MCB.24.7.3048-3056.2004. PMID: 15024091.
24. Sato A., Sunayama J., Matsuda K.I. MEK-ERK signaling dictates DNA-re-pair gene MGMT expression and temo-zolomide resistance of stem-like glioblas-toma cells via the MDM2-p53 axis. Stem Cells 2011;29(12):1942-51.
DOI: 10.1002/stem.753. PMID: 21957016.
25. Abouzeid H.E., Kassem A.M., Abdel Wahab A.H. et al. Promoter hypermeth-ylation of RASSF'A, MGMT, and HIC-' genes in benign and malignant colorectal tumors. Tumour Biol 2011;32(5):845-52. DOI: 10.1007/s13277-011-0156-7. PMID: 21274674.
26. Kulis M., Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet 2010;70:27-56. DOI: 10.1016/B978-0-12-380866-0.60002-2. PMID: 20920744.
27. Sobin L.Y., Wittekind Ch. UICC - TNM classification of malignant tumours. New York: Wiley-Liss, 2002. Pp. 193-195.
28. World health organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. Eds.: F.A. Tavassoli, P. Devilee. Lyon: IARC Press, 2003.
29. Lester S.C., Bose S., Chen Y.Y. et al. Protocol for the examination of specimens from patients with invasive carcinoma of the breast. Arch Pathol Lab Med 2009;133(10):1515-38.
DOI: 10.1043/1543-2165-133.10.1515. PMID: 19792042.
30. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucl Acids Res 1994;22(15):2990-7. PMID: 8065911.
31. Казубская Т.П., Логинов В.И., Ходырев Д.С. и др. Метилирование генов RASSF1A, RAR02, SEMA3B в эпителиальных опухолях молочной железы, яичников и полинеоплазии. Опухоли женской репродуктивной системы 2012;1(12):61-9.
32. Бурденный А.М., Челышева Д.С., Ходырев Д.С. и др. Роль гиперметилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT в развитии рака молочной железы и яичников. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2015;26(2):39-44.
33. Feng W., Shen L., Wen S. et al. Correlation between CpG methylation profiles and hormone receptor status in breast cancers. Breast Cancer Res 2007;9(4):R57. DOI: 10.1186/bcr1762. PMID: 17764565.
34. Park S.Y., Kwon H.J., Choi Y. et al. Distinct patterns of promoter CpG island methylation of breast cancer subtypes are associated with stem cell phenotypes. Mod Pathol 2012;25(2):185-96.
DOI: 10.1038/modpathol.2011.160. PMID: 22037257.
35. Asiaf A., Ahmad S.T., Malik A.A. et al. Protein expression and methylation of MGMT, a DNA repair gene and their correlation with clinicopathological parameters in invasive ductal carcinoma of the breast. Tumour Biol 2015;36(8):6485-96. DOI: 10.1007/ s13277-015-3339-9. PMID: 25820821.
36. Xu J., Shetty P.B., Feng W. et al. Methylation of HIN-1, RASSF1A, RIL and CDH13 in breast cancer is associated with clinical characteristics, but only RASSF1A methylation is associated with outcome. BMC Cancer 2012;12:243. DOI: 10.1186/1471-2407-12-243. PMID: 22695491.
