CC BY
42УДК 633.63:575.174.015. 3 doi.org/10.24411/2413-5518-2021-10205
ование растений сахарной свёклы на устойчивость к засолению
Тестир
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук (e-mail: arpnal@rambler.ru) Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биолог. наук Т.С. РУДЕНКО, мл. научн. сотрудник А.В. МОИСЕЕНКО, мл. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
Как показывает практика возделывания культурных растений, наибольших успехов в создании урожайных, устойчивых и высококачественных сортов и гибридов, отвечающих требованиям современного производства, можно добиться при организации селекционной работы на молекулярно-генетической основе [1, 2]. За последние три десятилетия на помощь традиционной селекции пришли новые технологии — технологии ДНК-маркеров, что сделало селекцию более эффективной, отвечающей современным реалиям. Молекулярно-генетические маркеры являются надёжным инструментом в руках экспериментатора, так как в основном наследуются сцепленно, моноген-но и доминантно [4, 6, 10].
Как известно, влияние абиотических стрессоров на растения сахарной свёклы крайне негативно сказывается на урожае данной культуры, что является большой проблемой для продовольственной безопасности. В ответ на изменения климата и ухудшение состояния окружающей среды растения инициируют молекулярные, клеточные и физиологические изменения, чтобы адаптироваться к различным типам абиотического стресса. Селекционно-ценными являются солеустойчивые растения, толерантные и к засухе. Засоление приводит к созданию в почве низкого (отрицательного) водного потенциала, поэтому поступление воды в растение сильно затруднено. Чтобы противостоять таким стрессам, растения отвечают программируемыми изменениями экспрессии генов на уровнях транскрипции, процессинга и трансляции мРНК.
Цель исследования
В связи с вышеизложенным цель исследования заключалась в проведении молекулярно-генетического тестирования селекционных образцов сахарной свёклы на наличие генов устойчивости к засолению.
Материалы и методы исследований
В качестве материалов для исследования нами были использованы проростки МС-линий сахарной свёклы, сростноплодных опылителей, гибридов, полученных с их участием, предоставленные доктором сельскохозяйственных наук В.П. Ошевневым и кандидатом сельскохозяйственных наук Н.П. Грибановой. Выделение суммарной ДНК из растительной ткани осуществляли наборами для выделения ДНК (ООО «Синтол») [5]. Классическая полимеразно-цепная реакция (ПЦР) была проведена на амплифи-каторе Genius (Великобритания). Условия проведения ПЦР оптимизировали в соответствии с характеристиками используемых праймеров. Для выявления генов, контролирующих работу белков семейства NHX-антипортеров, ответственных за адаптацию растений к засолению, были использованы специфические олигонуклеотиды NHX4, NHX5.1, NHX5, созданные в программе PRIMER BLAST (NCBI) [3].
Солевой стресс моделировали путём обработки 10 растений каждого генотипа 3мМ раствором NaCl в качестве контроля, а также при действии концентрации 70мМ и 210мМ в качестве индуктора стресса. Активность аскорбатпероксидазы в листьях сахарной свёклы изучали по модифицированной методике Nakano, Asada (1981). Уровень экспрессии генов NHX1, NHX4, NHX5 и APX1 был исследован методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX 96 (США).
Результаты исследований и их обсуждение
Одним из важных направлений на современном этапе исследований является идентификация генов устойчивости к абиотическому фактору — засолению. Большой успех в решении проблемы адаптации растений к засолению достигнут с развитием методов молекулярной генетики, что позволило идентифицировать многие гены, активирующиеся при засолении.
Так, выявлено, что в ответ на повышение концентрации №С1 увеличивается уровень экспрессии генов, контролирующих работу белков семейства NHX-антипортеров [3, 8, 9].
Нами было использовано три специфических прай-мера к генам N^4 и N^5 из семейства указанных антипортеров: N^4, N^5, N^5.1. В результате молекулярно-генетических исследований с данными праймерами у всех изученных генотипов получен ожидаемый ПЦР-продукт длиной 140, 250 и 700 п. н. соответственно (рис. 1).
То, что результаты молекулярно-генетических исследований позволили установить наличие генов устойчивости к засолению во всех изученных образцах свёклы, не случайно, так как данный ген относится к генам «домашнего хозяйства», т. е. присутствует у всех растений, в частности у сахарной свёклы как вида, относящегося к умеренно солеустойчивым. Относительный уровень экспрессии генов N^1, N^4, N^5, ответственных за устойчивость растений к засолению, был оценён методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе BioRad CFX96 (рис. 2—4). Провокационный фон создавался путём обработки проростков растений сахарной свёклы раствором №С1 в концентрации 210 мМ.
Анализируя графики, можно предположить, что в формирование устойчивости к засолению особый вклад вносят гены BvNHX1 и BvNHX5, т. е. они могут работать как самостоятельные единицы, а вот BvNHX4 предположительно только совместно с ними, и при ингибировании BvNHX1 и BvNHX5 он не может обеспечить относительную устойчивость.
У иностранных гибридов Хамбер и Портланд проявились достаточно высокие показатели при анализе относительного уровня транскриптов генов BvNHX1 и BvNHX5. К устойчивым генотипам можно также от-
Рис. 1. Электрофоретическоеразделение ПЦР-ампликонов, полученных с праймерами NHX4, NHX5, NHX5.1.Обозначения образцов: 1 — Портланд; 2 — 0п18094; 3 — Хамбер; 4 — F118092; 5 — МС17070; КГ (ПЦР-смесь без ДНК); М — маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (ThermoScientific, США)
нести и отечественные образцы МС17070 и 0п18094, а вот гибрид F118092 не проявил никакой активности.
Кроме того, в процессе исследований нами была изучена активность аскорбатпероксидазы (АПО; КФ 1.11.1.11) — ключевого фермента антиоксидант-ной системы растений, которая использует аскорбат в качестве донора электронов при восстановлении до воды. Аскорбатпероксидаза локализуется
HA
Relative Normalized Expression
BvNHXI Target
EH 4 Di EHF, 18092 ЕЛМС17070 ПЛОП 18094
Рис. 2. Относительный уровень транскриптов гена BvNHXI. Обозначения образцов: 1 - F:18092; 2 - МС17070; 3 - 0п18094; 4 - Хамбер; 5 - Портланд
Relative Normalized Expression
BvNHX4 Target
I 4 I 5 1 F1 18092 I МС17070 I ОП 18094
Рис. 3. Относительный уровень транскриптов гена BvNHX4. Обозначения образцов: 1 — F118092; 2 — МС17070; 3 - 0п18094; 4 - Хамбер; 5 — Портланд
Relative Normalized Expression
BvNHXS Target
LH4 Di ПЛF, 18092 ЕЛМС17070 IZ10/7 18094
Рис. 4. Относительный уровень транскриптов гена BvNHX5. Обозначения образцов: 1 - Fj18092; 2 - МС17070; 3 - Оп18094; 4 - Хамбер; 5 - Портланд
в различных клеточных компартментах, таких как хлоропласты, цитозоль, митохондрии, пероксисомы. Активность и экспрессия генов АПО в разных видах растений изменяется в ответ на воздействие различных стрессоров, в частности засухи и засоления. Активность аскорбатпероксидазы в листьях сахарной свёклы изучали при действии 3мМ раствора NaCl в качестве контроля, а также при действии 70мМ и 210мМ раствором NaCl в качестве индуктора солевого стресса по модифицированной методике Nakano, Asada (1981) [7] (рис. 5).
Так, при действии стресса в виде 3мМ раствора NaCl выявлено повышение удельной активности данного фермента у растений гибрида иностранной селекции Хамбер и МС-формы № 17070 Рамонской селекции до 48Е/г.с.м. При воздействии на растения сахарной свёклы раствором NaCl в концентрации 70мМ также у данных генотипов установлена более высокая активность аскорбатпероксидазы, у гибрида Хамбер
NaCl ЗтМ
£ В
I
I
140 120 100 80
14 е0
40
о
Хамбер Портланд F1
NaC! 70 тМ
МС ОП
115,01
' 68,628 И
Я 34.58 ........ Ш 42^36
■ ill
■о-§
0
1 I
5 . о ¿
|ч
тэГ4
Хамбер Портланд F1
NaC/ 210 тМ
МС
ОП
48,832
25,5 29
_ Ш 22>9
I I ■
Хамбер Портланд F1
(68Е/г.с.м.) и МС-формы (115Е/г.с.м.). При использовании раствора NaCl в концентрации 210мМ наивысшая активность фермента обнаружена у растений МС-формы, она составила 48Е/г.с.м. Полученные результаты свидетельствуют о повышенной устойчивости растений данных генотипов к солевому стрессу и о лучшей их адаптации к нему.
Относительный уровень экспрессии гена APX1, ответственного за работу фермента аскорбатперок-сидазы, изменяется при действии различных стресс-факторов, вызывающих ОС (оксидативный стресс), чему способствует наличие cis-элемента в промотор-ной части гена. Работа данного гена тоже была оценена методом ПЦР в реальном времени (рис. 6).
ПЦР в режиме реального времени подтвердила результаты, полученные при оценке активности аскорбатпероксидазы на спектрофотометре. Отечественные селекционные материалы сохраняли относительно высокий уровень экспрессии гена APX1 и при стрессе, вызванном критической концентрацией NaCl (210мМ) по сравнению с зарубежными гибридами Хамбер и Портланд.
Заключение
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что для изучения проявления генов NHX4 и NHX5 из семейства антипортеров NHXи отбора генотипов с генами устойчивости к засолению могут быть использованы созданные нами специфические праймеры NHX4, NHX5.1, NHX5. Установлено, что отечественные селекционные материалы МС17070 и Оп18094 можно рекомендовать как источник устойчивости к данному стресс-фактору. Высокий уровень относительной экспрессии показал и иностранный гибрид Хамбер. По удельной активности аскорбатпероксидазы также наиболее высокие показатели отмечены у отечественных генотипов.
Relative Normalized Expression
АРХ Target
I 14 I 15 nf, 18092 ГШ MCI7070 ПЛОП18094
Рис. 5. Удельная активность аскорбатпероксидазы при концентрациях раствора ^ С13мМ, 70мМ и 210мМ соответственно
Рис. 6. Относительный уровень транскриптов гена АРХ1. Обозначения образцов: 1 — F¡18092; 2 — МС17070; 3 - 0п18094; 4 - Хамбер; 5 - Портланд
Мы знаем о сахаре всё!
А вы?
г
Список литературы
1. Корниенко, А.В. Генетика и селекция сахарной свёклы В. vulgaris L./А.В. Корниенко, А.К. Буторина//Воронеж : Воронежский ЦНТИ, 2012. — 391 с.
2. Буренин, В.И. Генетические ресурсы рода Beta L. (свёкла) / В.И. Буренин. - СПб., 2007. - 274 с.
3. Adler, G. The sugar beet gene encoding the sodium/proton exchanger 1 (BvNHXI) is regulated by a MYB transcription factor / G. Adler, E. Blumwald, D. Bar-Zvi // Planta. -2010. - V. 232. - P. 187-195.
4. Broccanello, Ch. Comparison of three PCR-based assays for SNP genotyping in plants ^t al.] // Plant Methods. -2018. - V. 14:28.
5. Hussein, A.S. Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein, A.A. Nalbandyan, T.P. Fedulova, N.N. Bogacheva // Russian Agricultural Sciences. - 2014. - V. 40. - Is. 3. - Р. 177-178.
6. Izzatullayeva, V. Efficiency of using RAPD and ISSR markers in evaluation of genetic diversity in sugar beet / V. Izzatullayeva ^t al.] // Turkish Journal of Biologiy. -2014. - V. 38. - P. 429-438.
7. Nakano, Y. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts / Y. Nakano, K. Asada // Plant Cell Physiol. - 1981. - V. 22. - P. 867880.
8. Rodriguez-Rosales, M. Plant NHX cation/proton antiporters ^t al.] // Plant Signaling & Behavior. - 2009. -V. 4 (4). - P. 265-276.
9. Shafaqat, A. Biochar soil amendment on alleviation of drought and salt stress in plants: a critical review / A. Shafaqat ^t al.] // Environmental Science and Pollution Research. -2017. - V. 24. - P. 12700-12712.
Аннотация. В статье рассматриваются вопросы молекулярно-генетической оценки селекционных образцов сахарной свёклы на устойчивость к солевому стрессу. Установлено, что повышение концентрации NaCl при обработке растений увеличивало уровень экспрессии генов, контролирующих белки семейства NHX-антипортеров. У иностранных гибридов Хамбер и Портланд также отмечена повышенная экспрессия транскриптов генов BvNHXI и BvNHX5. К устойчивым генотипам относятся и отечественные образцы МС17070 и Оп18094. Отечественные селекционные материалы сохраняли относительно высокий уровень экспрессии гена APX1 и при стрессе, вызванном критической концентрацией NaCl (210мМ) по сравнению с зарубежными гибридами Хамбер и Портланд.
Ключевые слова: сахарная свёкла, солевой стресс, NaCl,
белки семейства NHX-антипортеров, уровень экспрессии
гена APX1, аскорбатпероксидаза.
Summary. In the article, questions of molecular-genetic
evaluation of sugar breeding samples beet for resistance
to salt stress are considered. It has been that increase of NaCl
concentration, when treating plants, has led to increase of
expression level of the genes controlling proteins
of the NHX-antiporter family. In the foreign hybrids Humber and
Portland, higher expression of the genes BvNHXI and BvNHX5
transcripts also has been noted. The domestic samples of
МС17070 and Op18094 are among resistant genotypes as well.
Domestic breeding materials have retained a relatively high
expression level of the APX1 gene even under stress conditions
caused by critical concentration of NaCl (210mM) as compared
to the foreign hybrids, Humber and Portland.
Keywords: sugar beet, salt stress, NaCl, proteins
of the NHX-antiporter family, the APX1 gene expression level,
ascorbat-peroxidase.
