Термостабильный токсин Yersinia pseudotuberculosis вызывает разнонаправленные изменения уровней маркеров функциональной активности двух типов фагоцитов у голотурии Eupentacta fraudatrix

Долматова Людмила Степановна; Уланова Ольга Анатольевна; Бынина Марина Павловна; Тимченко Нэлли Федоровна

15. Солматова А.А., Ильин И.В., Шахов Ф.М., Ки-далов С.В., Вуль А.Я., Явкин Б.В., Мамин Г.В., Орлин-ский С.Б., Баранов П.Г. Обнаружение методом электронного парамагнитного резонанса гигантской концентрации азотно-вакантных дефектов в детонационных наноалмазах // Письма вЖЭТФ. 2010; 92: 106-109.

16. Инжеваткин Е.В., Барон А.В., Максимов Н.Г., Волкова М.Б., Пузырь А.П., Бондарь В.С. Использование ЭПР-спектроскопии для детекции наноалма-зов в биологических образцах / Сборник материалов

VI Всероссийская конференция по наноматериалам с элементами научной школы для молодежи «НАНО 2016». - М.: ИМЕТ РАН, 2016. С.524-525.

17. Барон А.В., Максимов Н.Г., Инжеваткин Е.В., Волкова М.Б., Пузырь А.П., Бондарь В.С. Применение метода ЭПР для определения наноалмазов в биологических материалах / Тезисы докладов XVIII Всероссийского симпозиума c международным участием «Сложные системы в экстремальных условиях». - Красноярск: Изд-во СФУ, 2016. С.13.

Сведения об авторах

Инжеваткин Е.В., международный научный центр исследований экстремальных состояний организма ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск; е-mail: inscience@mail.ru;

Барон А.В., институт биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск;

Максимов Н.Г., институт биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск;

Волкова М.Б., Институт химии и химической технологии СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск;

Пузырь А.П., институт биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск;

Бондарь В.С., институт биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск.

Удк 593.96+576.53

Л.С. Долматова1, О.А. Уланова1, М.П. Бынина2, Н.Ф. Тимченко2

термостабильный токсин yersinia pseudotuberculosis вызывает разнонаправленные изменения уровней маркеров функциональной активности двух типов фагоцитов У голотурии eupentacta fraudatrix

1 Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева, Владивосток

2 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

В двух типах фагоцитов (Ф1 и Ф2) голотурии Eupentacta fraudatrix, полученных методом градиентного центрифугирования, были исследованы уровень оксида азота и активность аргиназы при воздействии летального для голотурий термостабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis (TcTY.p) in vitro. Впервые показано, что два типа фагоцитов голотурии E. fraudatrix отличаются по уровню этих маркеров, используемых для фенотипирования М1 и М2 макрофагов позвоночных. Это позволяет провести аналогию между исследуемыми типами фагоцитов голотурии и двумя типами макрофагов. Показано, что ТсТУр способен менять исходный фенотип фагоцитов, тем самым, по-видимому, снижая их бактерицидный эффект.

Ключевые слова: псевдотуберкулезный микроб, Yersinia pseudotuberculosis, бактериальный токсин, аргиназа, оксид азота, функциональный фенотип фагоцитов.

L.S. Dolmatova1, О.А. Ulanova1, МР. Bynina2, N.F. Timchenko2

thermostable toxin yersinia pseudotuberculosis induces opposite variations in the levels of markers of functional activities of the two types of phagocytes in the holothurian eupentacta fraudatrix

1 Il'ichev Pacific Oceanological Institute, Vladivostok, Russia

2 Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia

The levels of nitric oxide and arginase activity were measured in the two types of phagocytes (P1 and P2) of the holothurian Eupentacta fraudatrix treated with a thermostable toxin (lethal for holothurians) of Yersinia pseudotuberculosis (TsTYp) in vitro. For the first time, the two types of phagocytes were shown to have different levels of these markers known to be used for phenotyping Ml and M2 macrophages of vertebrates. These data indicate that the phagocyte types under study may be analogous to the Ml and M2 macrophages. It was shown also that TsTYp is able to change the phenotypes of phagocytes and possbly in that way to decrease their bactericidal activity.

Keywords: pseudotuberculosis microbe, bacterial toxin, arginase, nitric oxide, functional phenotype of phagocytes.

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

Возбудитель сапронозов Yersinia pseudotuberculosis широко распространен в окружающей среде, почве, воде [1]. Он способен длительно выживать в морской воде и формировать биопленки, заражая морских обитателей, в частности, голотурий, которые являются ценным пищевым и фармакологическим сырьем [2, 3, 4, 5]. Вследствие этого изучение механизмов влияния Y pseudotuberculosis, их факторов патогенности с инвазивной, антифагоцитарной и токсической функциями на иммунитет голотурий представляется важной задачей для обеспечения здоровья животных, особенно, выращиваемых в марикультуре.

Одним из факторов патогенности Y. pseudotu-berculosis является термостабильный токсин (ТсТУр), белок молекулярной массой 45 кДа. Он снижает фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов у позвоночных, а у беспозвоночных, голотурий Eupentacta fraudatrix, вызывает смерть животных [2].

Иммунитет иглокожих представлен только врожденным иммунитетом, при этом он обеспечивает высокий уровень защиты от бактериальных агентов [6]. Фагоциты голотурий считаются аналогами макрофагов позвоночных [7]. Известно, что макрофаги являются гетерогенной популяцией, включающей как минимум два основных типа, играющих противоположную роль при иммунном ответе. Так, Ml макрофаги являются продуцентами таких эф-фекторных молекул, как активные формы кислорода (АФК) и оксид азота (NO) и другие метаболиты азота, в связи с чем обладают выраженной бактерицидной активностью. Макрофаги же М2 фенотипа характеризуются высокой активностью аргиназы и участвуют в развитии иммунных реакций Th2 типа, способствуют регенерации тканей и ангиогенезу [8].

Фагоциты голотурий и ряда других иглокожих методами градиентного центрифугирования также разделяются на две фракции [7]. Ф1 и Ф2 фагоциты, выделенные у голотурии Eupentacta fraudatrix, имеют различный уровень фонового апоптоза [9] и различный уровень синтеза цитокиноподобных веществ [10]. Это заставляет сделать предположение

0 том, что эти две фракции могут играть различную роль в иммунном ответе у голотурий.

Цель исследования: выявление особенностей динамики экспрессии маркеров функциональных фенотипов макрофагов позвоночных (NO и аргиназы) в Ф1 и Ф2 типах фагоцитов голотурии E. fraudatrix при воздействии ТсТУр in vitro.

Материалы и методы. В работе использовали голотурий с длиной тела от 4 до 6 см. Отбор цело-мической жидкости и выделение двух фракций фагоцитов методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина проводили, как описано ранее [11]. Инкубацию клеток (1х106 клеток в

1 мл) проводили в круглодонных планшетах, в двух

независимых экспериментах. Каждое воздействие производилось в двух повторностях.

ТСТ использовали в концентрациях 0,2, 0,5 и 2 мкг/мл. В контрольные лунки вводили фосфатно-со-левой буфер (рН 7,8) с добавлением 31 г/л хлорида натрия. Инкубацию проводили в течение 1 или 24 ч. Определение N0 проводили в супернатантах клеток по методу, описанному Топка et а1. [12]. Активность аргиназы измеряли в лизатах клеток [13].

Концентрацию белка в пробах измеряли с красителем Кумасси G-250 (методом Брэдфорда)

Результаты и обсуждение. Активность аргиназы через 1 ч в контрольных Ф1 составила 0,53±0,02 мкмоль/мин/мг белка, а в Ф2 - 2,00±0,23 мкмоль/ мин/мг белка. Таким образом, через 1 ч инкубации в контрольных Ф2 она была почти в 4 раза выше, чем в Ф1. По соотношению активностей аргиназы в Ф1 и Ф2 фагоцитах эти клетки могут быть сопоставимы с М1 и М2 макрофагами позвоночных.

При этом в Ф1 Тс^р в концентрации 0,2 мкг/мл ингибировал, а в концентрации 2 мкг/мл уже стимулировал активность фермента, в 3 и 2 раза, соответственно (Р<0,05). В Ф2 ТсТYp, напротив, стимулировал аргиназу в концентрации 0,2 мкг/мл (в 2 раза), а концентрации 0,5 и 2 мкг/мл практически полностью ингибировали фермент.

Через 24 ч инкубации активность аргиназы в контрольных Ф1 не менялась по сравнению с таковой через 1 ч (0,58±0,02 мкмоль/мин/мг), а в Ф2 снижалась по сравнению с уровнем через 1 ч (1,10±0,06 мкмоль/мин/мг белка), но оставалась выше, чем в Ф1 (в 2 раза). ТсТYp в Ф1 стимулировал ее рост при всех концентрациях в прямой концентрационной зависимости, максимально - в 2 раза (Р<0,01). В Ф2, напротив, активность фермента значительно снижалась в прямой концентрационной зависимости, максимально - в 20 раз -при концентрации 0,5 мкг/мл.

Таким образом, в исследованные сроки инкубации ТсТYp влиял на активность аргиназы в Ф1 и Ф2 противоположным образом. При этом действие ТсТYp было направлено на сдвиг уровня данного маркера в каждом из типов фагоцитов в сторону, характеризующую противоположный фенотип клеток.

Уровень же N0 имел сходные значения в контрольных фагоцитах через 1 ч инкубации: 4,91±0,65 и 4,99±0,32 мкмоль/мг белка в Ф1 и Ф2, соответственно. Однако ТсТYp значительно снижал его уровень в обоих типах фагоцитов - в Ф1 почти в 2 раза при концентрациях 0,2-0,5 и в 3 раза при концентрации 2 мкг/мл, а в Ф2 максимально в 4,5 раза при концентрации 0,2 мкг/мл. То есть если ингиби-рование в Ф1 происходило в прямой концентрационной зависимости, то в Ф2 - в обратной, и было более значительным.

Через 24 ч инкубации уровень N0 в Ф1 уже в 10 раз превышал его значение в Ф2 (8,67±0,66 и 0,9±0,6

мкмоль/мг белка для Ф1 и Ф2, соответственно). Таким образом, в Ф1 в процессе инкубации он возрос, а в Ф2, напротив, значительно снизился. Это свидетельствует о том, что в процессе инкубации в норме активация продукции NO происходит преимущественно в Ф1.

При этом в Ф1 ТсТУр ингибировал его в диапазоне 0,2-0,5 мкг/мл в прямой концентрационной зависимости - максимально в 6 раз при концентрации 0,5 мкг/мл, после чего ингибирование снижалось. В Ф2 уровень NO, наоборот, возрастал почти в 3,5 раза, и зависимость от концентрации ТсТУр не отмечена. Таким образом, ТсТУр переводит синтез NO, как и активность аргиназы, в каждом типе фагоцитов на уровень, характерный для другого типа клеток.

Учитывая прооксидантную роль NO и связанное с ней его противомикробное действие [14] при инфекциях, полученные результаты о влиянии ТсТУр на сдвиг уровней NO в двух типах фагоцитов голотурий свидетельствует о том, что уже в первый час инкубации ТсТУр может ингибировать оксидантный взрыв в Ф1, в которых в контроле наиболее высок уровень NO, а через 24 ч к ингибирующему действию на Ф1 фагоциты добавляется стимуляция Ф2 фагоцитов.

Известно, что различные грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также ЛПС могут стимулировать поляризацию макрофагов по М1 типу, который осуществляет бактерицидное действие. Вместе с тем, в ряде случаев описано влияние бактериальных токсинов на поляризацию по М2-типу [15], приводящему к снижению бактерицидного действия, или смешанному М1/М2 типу [16]. По-видимому, ТсТУр, вызывая сдвиги в функциональной активности обоих типов фагоцитов, о чем свидетельствуют изменения в уровне маркеров, также способен снижать иммунный ответ и тем самым способствовать выживанию бактерии.

Необходимо отметить, что Ф1 и Ф2 фагоциты, в условиях контрольной инкубации проявляющие фенотип, аналогичный М1 и М2 макрофагам позвоночных, при воздействии ТсТУр меняют свой фенотип на противоположный. Для макрофагов позвоночных показана возможность изменения фенотипа при изменении микроокружения [8]. Подобная пластичность, показанная для двух типов фагоцитов голотурий в настоящей работе, показывает, что иммунитет голотурий представляет более сложную систему, чем предполагалось ранее, а фагоциты, по-видимому, могут быть использованы для моделирования механизмов регуляции поляризации макрофагов позвоночных.

Выводы. Впервые, используя термостабильный летальный токсин Y. pseudotuberculosis возбудителя псевдотуберкулеза, показано его влияние на уровень маркеров функциональной активности двух типов фагоцитов у голотурии Eupentacta fraudatrix.

Установлено, что эти типы фагоцитов голотурии E. fraudatrix отличаются по уровню продукции NO и активности аргиназы известных маркеров функциональных фенотипов макрофагов позвоночных. Полученные данные позволяют провести аналогию между Ф1 и Ф2 фагоцитами и М1 и М2 типами макрофагов, соответственно. Эти новые сведения вносят вклад в обоснования учения о возбудителях сапроно-зов [17, 18]. Они свидетельствуют о том, что белок MM 45 кДа - термостабильный летальный токсин Y pseudotuberculosis, продуцируемый бактериями псевдотуберкулеза, как фактор патогенности этих бактерий, способен менять исходный фенотип фагоцитов, тем самым, снижая их бактерицидный эффект.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатинопо-добная лихорадка. Москва. Медицина.,1979. 184 с.

2. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток: ОАО «Примполи-графкомбинат». 2004. 219 с.

3. Terentieva N.A., Timchenko N.F., Balabanova L.A., Rasskazov V.A. Characteristics of formation, inhibition and destruction of Yersinia pseudotuberculosis biofilms forming on abiotic surfaces. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 2015; 3: 72-78.

4. Елисейкина М.Г., Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П. и соавт. Взаимодействие Yersinia pseudotuberculosis и ее токсинов с компонентами иммунной системы морских беспозвоночных животных // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002; 1: 28-32.

5. Долматова Л.С., Тимченко Н.Ф., Стасенко Н.Я.. Характеристика состава и медико-биологические исследования комплекса биологически активных веществ из дальневосточных видов голотурий // Дальневосточные моря России. Книга 2. Исследование морской экологии и биоресурсов. М.: Наука, 2007. С. 684-694.

6. Гусев Е.Ю., Черешнев В.А. Эволюция воспаления // Цитокины и воспаление. 2012; 11(4): 5-13.

7. Chia F., Xing J. Echinoderm coelomocytes // Zoological Studies. 1996; 35: 231-254.

8. Fraternale A., Brundu S., Magnani M. Polarization and repolarization of macrophages. J. Clin. Cell Immunol. 2015; 6: 2. doi: 10.4172/2155-9899.1000319.

9. Андрюков Б.Г., Тимченко Н.Ф. Апоптоз-мо-дулирующие стратегии детерминант вирулентности иерсиний // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015; 59(1): 29-41.

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

10. Dolmatova L.S., Ulanova O.A. Dexamthasone treatment in vitro resulted in different responces of two fractions of phagocytes of the holothurian Eupentacta fraudatrix // Russian Journal of Marine Biology. 2015; 41(6): 503-506. doi: 10.1134/S1063074015060024.

11. Долматова Л.С., Уланова О.А., Долматов И.Ю. Сравнительное исследование действия дексамета-зона и нового экстракта из голотурий на уровень цитокиноподобных веществ в отдельных типах им-муноцитов голотурии Eupentacta fraudatrix // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 1. С. 34-38.

12. Долматова Л.С., Заика О.А. Апоптозмодули-рующее действие простагландина Е2 в целомоцитах голотурии Eupentacta fraudatrix зависит от антиокси-дантного ферментного статуса клеток // Известия Российской академии наук. Сер.биол. 2007; 3: 273-282.

13. Torika N., Asraf K., Abraham Danon A. et al. Telmisartan Modulates Glial Activation: In Vitro and In Vivo Studies. PLoS ONE 2013; 11(5): e0155823. doi: 10.1371/journal.

14. Elnekave K., Siman-Tov R., Ankri S. Consumption of L-arginine mediated by Entamoeba histolytica L-arginase (EhArg) inhibits amoebicidal activity and nitric oxide production by activated macrophages. Parasite Immunol. 2003; 25(11-12): 597-608. doi: 10.1111/j.0141-9838.2004.

15. Соловьева А.Г., Кузнецова В.Л., Перетягин С.П. и соавт. Роль оксида азота в процессах свободнора-дикального окисления // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2016; 1(53): 228-233.

16. Benoit M., Desnues B., Mege J.L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 2008; 181(6): 3733-3739.

17. Goldmann O., von Kockritz-Blickwede М., Holtje C. et al. Transcriptome analysis of murine macrophages in response to infection with Streptococcus pyogenes reveals an unusual activation program. Infection and Immunity. 2007; 85(5): 4148-4157.

18. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. Психрофильность патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, Сиб. отдел., 1991. 203 с

Сведения об авторах

Долматова Людмила Степановна, к.б.н., в.н.с. Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН; 690041, Владивосток, ул. Балтийская, 43; e-mail: dolmatova@poi.dvo.ru;

Уланова Ольга Анатольевна, н.с. Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН; 690041, Владивосток, ул. Балтийская, 43; e-mail: shitkova@poi.dvo.ru;

Бынина Марина Павловна, м.н.с. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; e-mail: marina. bynina@mail.ru;

Тимченко Нэлли Федоровна, д.м.н., в.н.с. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова; e-mail: ntimch@mail.ru.

УДК 616.6-006 (571.61)

Г.Н. Алексеева12, В.Г. Морева2, СВ. Юдин1

состояние онкоурологической помощи населению приморского края

1 ГОУ ВПО Тихоокеанский государственный медицинский университет, г. Владивосток

2 ФГАОУ ВПО Дальневосточный федеральный университет, Школа биомедицины, г. Владивосток

Онкоурологические заболевания являются одними из наиболее сложных медико-социальных проблем, как в урологии, так и в онкологии. В статье приведены данные о заболеваемости и смертности раком предстательной железы, мочевого пузыря и почки в Приморском крае за период с 2011 по 2015 годы, проведен сравнительный анализ с ключевыми показателями по Российской Федерации. Выявлены некоторые тенденции дальнейшего развития исследуемых заболеваний.

Ключевые слова: злокачественные новообразования, онкоурология.

G.N. Alekseeva12, V.G. Moreva2, S.V. Yudin1

the state of oncurological assistance to the population of the primorye territory

1 Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia

2 FGAOU VPO Far Eastern Federal University, School of Biomedicine, Vladivostok, Russia

Oncological diseases are one of the most complex medical and social problems, both in urology and in oncology. The article presents data on the morbidity and mortality of prostate gland, bladder and kidney cancer in Primorsky

THERMOSTABLE TOXIN YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS INDUCES OPPOSITE VARIATIONS IN THE LEVELS OF MARKERS OF FUNCTIONAL ACTIVITIES OF THE TWO TYPES OF PHAGOCYTES IN THE HOLOTHURIAN EUPENTACTA FRAUDATRIX