CC BY
27
УДК [616.98:579.842.23-06:616.94] -085.324:563.96
влияние экстракта из дальневосточных видов голотурий
НА ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНЫЙ БАЛАНС И АПОПТОЗ в МАКРОФАГАх МЫшЕЙ
при экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции
Л.С. Долматова1, О.А. Заика1, Н.Ф. Тимченко2
1 Тихоокеанский океанологический институт ДВО РАН (690041 г. Владивосток, ул. Балтийская, 43),
2 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1)
Ключевые слова: иерсинии, экстракт из голотурий, макрофаги, сепсис.
Исследовано влияние экстракта из дальневосточных видов голотурий на уровень продукции нитросинего тетразолия и активность антиоксидантных ферментов макрофагов мышей, зараженных Yersinia pseudotuberculosis. Установлено, что при 100 %-ной выживаемости у 67 % инфицированных животных происходила коагуляция перитонеальной жидкости. Трехсуточное введение инфицированным животным ЭГ в концентрациях 0,5-1 мг/кг подавляло функциональную активность макрофагов и оказывало защитный антисептический эффект, снижая число мышей с септическими проявлениями инфекции. В дозе 10 мг/кг экстракт стимулировал функциональную активность макрофагов, но и увеличивал количество мышей с коагуляцией перитонеальной жидкости. Авторы предлагают использование экстракта из голотурий в низких дозах для комплексного лечения септических проявлений при иерсиниозе.
Псевдотуберкулез, вызываемый Yersinia pseudotuberculosis (дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка), постоянно регистрируется в России и за рубежом. Заболевание характеризуется клиническим полиморфизмом и нередкой генерализацией инфекции [6]. Лечение псевдотуберкулеза часто осложняется формированием лекарственно-резистентных штаммов возбудителя. Все это обусловливает необходимость совершенствования фармакотерапии заболевания, разработок и исследований новых препаратов, в том числе иммуномодулирующей направленности, поскольку возбудитель псевдотуберкулеза вызывает значительные повреждения иммунитета [14].
Из тканей ряда дальневосточных голотурий (Cucu-maria japonica, Eupentacta fraudatrix) получен экстракт, содержащий комплекс биологически активных веществ и получивший коммерческое название «Пентакан» (ТУ 9154-001-77418193). Первоначально обнаружена его эффективность в ингибировании роста микробов in vitro и в клинике при наружном применении [1]. Дальнейшие опыты на животных показали выраженный иммуномодулирующий эффект препарата, в том числе при профилактическом использовании в опытах по заражению неинбредных мышей Y. pseudotuberculosis [3].
Функциональная активность фагоцитов во многом определяется уровнем продукции в них активных метаболитов кислорода. При этом увеличение активности может быть опасно и для самой клетки, в связи с чем рост продукции активных метаболитов кислорода ограничивает система антиоксидантной защиты. Модуляция
Долматова Людмила Степановна - канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биофизики ТОИ ДВО РАН; тел.: +7 (423) 231-25-80, e-mail: [email protected]
оксидантно-антиоксидантного баланса препаратами также может влиять на уровень иммунного ответа. Экстракт из голотурий (ЭГ) проявляет высокую анти-оксидантную активность, по-видимому обусловленную входящими в его состав каротиноидами и тритерпе-новыми гликозидами, и это свойство может лежать в основе его иммуномодулирующего действия [1].
Целью настоящей работы явился анализ влияния ЭГ на уровень продукции активных метаболитов кислорода и активность антиоксидантных ферментов макрофагов мышей, зараженных Y. pseudotuberculosis, по лечебной схеме применения - после заражения животных бактериями.
Материал и методы. Использовали самок неинбредных мышей массой 14-15 г, находившихся на стандартной диете. В работе руководствовались правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Контрольным животным (1-я группа) вводили физиологический раствор. Для экспериментального инфицирования животным 2-5-й групп внутрибрюшинно однократно вводили Y. pseudotuberculosis в дозе 105 микробных клеток (штамм 3D, III серотип, выделенный от больного человека). Животным 3-5-й групп дополнительно в течение трех последующих суток вводили ЭГ per os один раз в день в дозах 0,5, 1,0 и 10,0 мг/кг соответственно. Животных 1-й и 2-й групп поили физиологическим раствором (pH 7, 4) в течение трех суток по той же схеме. Отдельно три группы животных (6-8-я) получали только ЭГ в дозах 0,5, 1,0 и 10,0 мг/кг per os один раз в день в течение трех дней. Каждая экспериментальная группа состояла из трех-четырех мышей. По окончании эксперимента (через 45 мин после последнего введения физраствора или ЭГ) животных забивали дислокацией шейных позвонков и отбирали перитонеальный экссудат. В полученных из него макрофагах определяли содержание нитросинего тетразолия (НСТ), по которому судили о продукции активных метаболитов кислорода [5]. Часть клеток отбирали для последующего анализа уровня апоптоза, часть замораживали в жидком азоте и хранили при -20 °С до определения активности антиоксидантных ферментов. Перед определением активности антиоксидантных ферментов клетки разрушали ультразвуком (УЗДН-1, 22 кГц, 25x6 с при 0 °С). Ядра осаждали центрифугированием. В полученных супернатантах спектрофотометрическими методами определяли активность супероксиддисмутазы
(СОД, НФ 1.15.1.1), каталазы (НФ 1.11.1.6) и глутати-онредуктазы (ГР, НФ 1.6.4.2) [4]. Все измерения проводили в трипликатах. Количество белка в пробах определяли окраской по Кумасси бриллиантовым голубым G-250.
Для анализа апоптоза суспензии перитонеальных макрофагов (0,3-0,5 млн клеток) центрифугировали (1000gx5 мин при 4 °С), к осадку добавляли 40 мкл 4 % раствора формалина и делали мазки, которые окрашивали Hoechst 33342 [12]. Об уровне апоптоза судили по процентному содержанию ярко-голубых флюоресцирующих клеток.
Результаты обрабатывали статистически, используя для определения достоверности различий между группами t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования. В течение эксперимента все животные были живы. Однако уже через сутки после введения бактерий у части инфицированных мышей (2-5-я группы) появились визуальные признаки сепсиса, в частности - коагуляция перитонеальной жидкости. На 4-й день у животных, не получавших экстракта (2-я группа), этот феномен зарегистрирован в 67 % случаев. ЭГ в дозе 0,5 и 1 мг/кг проявлял защитное действие, снижая число животных с коагулированной перитонеальной жидкостью в 3-й и 4-й группах до 25 и 33 % соответственно. В то же время экстракт в концентрации 10 мг/кг стимулировал коагуляцию, которая на четвертые сутки была зарегистрирована у всех мышей 5-й группы.
Для понимания механизмов такой про- и антивоспалительной активности ЭГ было проведено исследование состояния оксидантно-антиоксидантного баланса макрофагов. У мышей 2-й группы не было отмечено изменений в продукции НСТ по сравнению с контролем. Однако у инфицированных мышей, получавших дополнительно ЭГ в дозе 1 мг/кг (4-я группа), уровень НСТ был значительно снижен по сравнению с контролем, а доза 10 мг/кг, напротив, стимулировала продукцию НСТ (рис. 1). Введение только экстракта 1 и 10 мг/кг в сутки (7-я и 8-я группы) значительно снижало уровень НСТ в клетках по сравнению с контролем (максимально при дозе 1 мг/кг - на 77 %).
При этом как инфицирование бактериями (2-я группа), так и скармливание экстракта (6-8-я группы) не оказывали влияния на активность СОД в макрофагах мышей по сравнению с контролем (1-я группа). Введение препарата в дозе 0,5 мг/кг инфицированным животным (3-я группа) также не оказывало влияния на активность фермента. Однако экстракт в дозе 1 мг/ кг (4-я группа) значительно стимулировал активность СОД (на 64 % по сранению с контролем), а в дозе 10 мг/ кг (5-я группа) снижал активность фермента на 36 % по сравнению с контролем (рис. 2, а).
Активность каталазы в эксперименте изменялась более значительно. Так, во 2-й группе она снижалась на 37 % по сравнению с контролем. В 7-й и 8-й группах зарегистрировано прямое дозозависимое подавление активности фермента: на 39 и 53 % соответственно. Введение
0,006 -|
U к 0,005 " ^ §
§ S 0,004 -
^ 5
<1 ж 0,003 -I
£ 0,002 -
jf ^
¡s * 0,001 -
fcj * & §
и
1-я 2-я 4-я 5-я 7-я 8-я группы Рис. 1. Влияние ЭГ на уровень НСТ в макрофагах:
* - разница с контролем статистически значима.
60 ■
40 -
ж i
;з А £ §
й ^
Ж а
i § и
20
0,10 -0,080,060,040,02500 -400 -300 -200 -100 -
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я 8-я группы
1-я
2-я 3-я
4-я
5-я 7-я
8-я группы
в 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 6-я 7-я 8-я группы
Рис. 2. Изменения активности антиоксидантных ферментов в макрофагах:
а - СОД, б - каталаза, в - ГР; * - разница с контролем статистически
значима.
же ЭГ инфицированным мышам возвращало активность каталазы к контрольным значениям только в 3-й группе. В 4-й и 5-й группах активность фермента оставалась практически на том же уровне, что во 2-й (рис. 2, б).
В макрофагах мышей 2-й группы отмечена тенденция к возрастанию активности ГР (на 40 %). Это свидетельствовало об определенной напряженности ан-тиоксидантной ферментной защиты, связанной со снижением уровня восстановленного глутатиона. В группах 6-8, напротив, отмечено дозозависимое подавление активности фермента (максимальное подавление - на 64 % - при концентрации 10 мг/кг). При введении ЭГ в дозе 0,5 мг/кг инфицированным мышам (3-я группа) активность фермента была практически такой же, как во 2-й группе, превышая контрольное значение в 1,6 раза. Однако в 4-й группе ЭГ (10 мг/кг) уже возвращал активность фермента к контрольному уровню (рис. 2, в).
Хг
х-
х-
а
х-
Хт
Хт
х-
б
Хг
12 -1
10 -8 -
6 -
4 -2 -
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я 7-я 8-я группы Рис. 3. Уровень апоптоза в макрофагах:
* - разница с контролем статистически значима.
Уровень апоптоза в макрофагах инфицированных мышей снижался на 32 % по сравнению с контролем. У животных 7-й и 8-й групп также происходило снижение уровня апоптоза (статистически значимое в 7-й группе). У инфицированных животных, принимавших ЭГ (3-5-я группы), уровень апоптоза достоверно возрастал в обратной концентрационной зависимости (рис. 3).
Обсуждение полученных данных. Ранее нами было показано, что один из важных факторов патогеннос-ти Y. pseudotuberculosis - термостабильный токсин ТсТУр - обладает способностью модулировать апоптоз в нейтрофилах крови крыс in vitro [2]. Стратегия бактерий, в том числе Y. pseudotuberculosis, направленная на подавление иммунитета макроорганизма, может реализовываться и через другие факторы, например эффекторные белки Yop, которые индуцируют апоп-тоз и подавляют фагоцитоз в макрофагах путем блокировки респираторного взрыва [14, 15]. Ранее было показано, что заражение мышей бактериями псевдотуберкулеза уже через 45 мин приводит к значительному снижению уровня НСТ в перитонеальных макрофагах [3], что соответствует представлениям, изложенным выше. Однако в настоящих опытах через четверо суток после заражения мышей не отмечено изменений в продукции НСТ макрофагами. При этом не зарегистрировано и существенных изменений активности антиоксидантных ферментов за исключением каталазы, активность которой достоверно снижалась. Уменьшался также уровень апоптоза в макрофагах. Очевидно, к четвертым суткам после заражения происходило восстановление функциональной активности макрофагов, по-видимому, за счет увеличения синтеза ими провоспалительных веществ, что способствовало появлению у части инфицированных животных признаков сепсиса.
Такая динамика изменений клеточного ответа на бактерии, вероятно, обусловлена тем, что реализация иммунного ответа макрофага на патоген может вести и к выживанию, и к смерти клетки, в зависимости от изменений в контролирующих апоптоз системах [14]. Возможно, в более поздние сроки включаются апоптозконтролирующие механизмы, направленные на выживание макрофагов. В частности, известно, что в регуляции апоптоза, помимо каспаз, могут участвовать митогенактивируемые и циклоаденозинмонофос-фатзависимые протеинкиназы [14]. В свою очередь
показано участие циклического аденозинмонофосфата в регуляции продукции активных форм кислорода, причем аденозинмонофосфат не только стимулирует активность антиоксидантных ферментов в культуре клеток и снижает концентрацию перекиси водорода, но и может снижать активность каталазы в отсутствие изменений других антиоксидантных ферментов (что указывает на важную роль перекиси водорода в проведении сигнала) [7, 9, 10].
По-видимому, снижение активности антиокси-дантных ферментов при первоначальном снижении уровня НСТ в макрофагах при введении бактерий в последующие сроки сопровождается его ростом с соответствующим повышением активности антиоксидантных систем (СОД и ГР) практически до уровня контроля. При этом концентрация перекиси водорода поднимается до значений, превышающих контрольные, на фоне значительно сниженной активности каталазы. Избирательное действие на продукцию перекиси водорода показано и при действии некоторых других бактерий [8, 13]. Повышение же продукции этого соединения может стимулировать синтез циклического аденозинмонофосфата [9]. Наряду с имеющимися данными о вовлеченности циклического аденозинмонофосфата в регуляцию апоптоза, индуцированного Y. pseudotuberculosis [2], это свидетельствуют о возможности снижения уровня апоптоза в макрофагах через четверо суток после инфицирования в связи с ростом его уровня.
Вместе с тем при трехсуточном введении ЭГ (1 и 10 мг/кг) отмечено обратное концентрационно-зависимое подавление продукции НСТ при сохраненной активности СОД, но не каталазы и ГР, активность которых препарат ингибировал в прямой концентрационной зависимости (достоверно - только при дозе 10 мг/кг).
Таким образом, ЭГ снижает уровень НСТ на фоне уменьшения активности как каталазы, так и ГР, что говорит в пользу антиоксидантного механизма действия: экстракт может эффективно снижать уровень свободных радикалов в клетке [1], тем самым отменяя необходимость поддержания высокой антиоксидант-ной ферментной защиты. При этом он снижает уровень апоптоза в обратной зависимости от дозы.
Введение инфицированным животным ЭГ в дозе 0,5 мг/кг вызывало рост активности каталазы до контрольного уровня при неизменной активности СОД и ГР, но уровень НСТ оставался сниженным. При дозе 1 мг/кг уровень НСТ у инфицированных животных не превышал таковой при введении ЭГ неинфицирован-ным мышам, не происходило изменений в активности ГР и каталазы, но значительно возрастала активность СОД. Обе дозы экстракта (0,5 и 1 мг/кг) значительно стимулировали уровень апоптоза.
Таким образом, увеличение уровня апоптоза в макрофагах инфицированных животных при введении указанных доз ЭГ связано с низким уровнем продукции НСТ. При этом снижалось и число животных с проявлениями сепсиса по сравнению с инфицированными
Хт
х-
X-
X-
мышами 2-й группы. По-видимому, снижение функциональной активности макрофагов и увеличение их гибели в этих условиях способствовало снижению их провоспалительных эффектов, как это было показано и при действии растительных флавоноидов [11].
Напротив, в 5-й группе наибольшая из использованных концентраций (10 мг/кг) при введении инфицированным животным значительно стимулировала продукцию НСТ, не вызывая достоверного изменения в активности СОД И ГР, а также в уровне апоптоза. Таким образом, при этой дозе происходил рост антибактериальной активности ЭГ при сохранении жизнеспособности самих макрофагов. Однако активность каталазы, но не других ферментов, оставалась сниженной. В этой группе число животных с коагуляцией крови составило 100 %, превысив даже частоту сепсиса во 2-й группе. Таким образом, в условиях бактериального инфицирования стимулирование ЭГ функциональной активности макрофагов сопровождалось, по-видимому, усилением их провоспалительной активности, способствовавшей развитию сепсиса.
В целом при введении ЭГ с лечебной целью в течение трех суток мышам, инфицированным Y. pseudotuberculosis, отмечено дозозависимое противодействие эффекту бактерий в макрофагах. Наиболее выраженное, стимулирующее функциональную активность макрофагов действие имело применение ЭГ в максимальной из исследованных концентраций - 10 мг/кг. Однако именно эта доза, повышая функциональную активность макрофагов и их выживаемость, по-видимому, приводила к усилению продукции этими клетками провоспалительльных веществ, приводящих к септическим проявлениям. В связи с этим дозы ЭГ 0,5-1 мг/кг, при которых сохранялась сниженная функциональная активность макрофагов, но при этом уменьшалась и частота септических проявлений, могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения при лечении сепсиса.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ-ДВО РАН № 08-04-99141. Литература References
1. Dolmatova L.S., Dolmatov I.U., Dobrjakov U.I. et al. Antioxidant and biological activity of sea cucumbers extracts Eupentacta fraudatrix and ascidian Halocynthia aurantium, Materialy VIII Mezhdunarodnogo sezda "Fitofarm-2004". Mikkeli, Finland. 21-23 june 2004. SPb.: Adaptogen, 2004. P. 85-88.
2. Dolmatova L.S., Zaika O.A., Nedashkovskaja E.N., Timchenko N.F. Researches of apoptosis modulating influence mechanisms of heat-stable toxin Yersinia pseudotuberculosis and correcting effect of extract from the Far Eastern species of sea cucumbers in the rat neutrophils in vitro, Pacific Medical Journal. 2010. No. 3. P. 76-80.
3. Dolmatova L.S., Zaika O.A., Timchenko N.F. Immunomodulatory effect of the sea cucumbers extract Eupentacta fraudatrix in experimental pseudotuberculosis infection, Kamchatka - zdravnica severo-vostochnyh regionov Rossii: mat. mezhregionalnoj nauch.-prak. konf. Petropavlovsk-Kamchatskii, 22-24 oktober 2009. Petropavlovsk-Kamchatskii: Kamchatpress, 2009. P. 85-91.
4. Dolmatova L.S., Romashina VV. Especially changes in the activity of antioxidant enzymes in different types of white blood cells in patients with chronic alcoholism, Pat. fiziol. jeksperim. terapija. 2003. no. 2. P. 17-19.
5. Melnikov V.P. The test of the nitroblue tetrazolium reduction by phagocytes, Lab. delo. 1991. no. 8. P. 51-53.
6. Pomogaeva A.P., Urazova O.I., Kovshirina Ju.V. et.al. Clinical and immunological features of children pseudotuberculosis, Bjulleten sibirskoj mediciny. 2006. V 5, no. 4. P. 103-110.
7. Bellomo F., Piccoli C., Cocco T. et al. Regulation by the cAMP cascade of oxygen free radical balance in mammalian cells, Antioxid. Redox Signal. 2006. Vol. 8, No. 3-4. P. 495-502.
8. Chakraborty P., Ghosh D., Basu M.K. Modulation of macrophage mannose receptor affects the uptake of virulent and avirulent Leishmania donovani promastigotes, J. Parasitol. 2001.Vol. 87, No. 5. P. 1023-1027.
9. Cochrane R., Clark R.B., Maulik N. et al. cAMP-mediated suppression of a Th1 clone associated with an alteration of the intracellular redox environment, Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2003. Vol. 49, No. 2. P. 301-306.
10. Ezeamuzie C.I., Taslim N. Reactive oxygen species mediate phor-bol ester-stimulated cAMP response in human eosinophils, Eur. J. Pharmacol. 2006. Vol. 543, No. 1-3. P. 174-180.
11. Fang S.H., Hou Y.C., Chang WC. et al. Morin sulfates/glucuronides exert anti-inflammatory activity on activated macrophages and decreased the incidence of septic shock, Life Sci. 2003. Vol. 74, No. 6. P. 743-756.
12. Komatsu N., Oda T., Muramatsu T. Involvement of both caspase-like proteases and serine proteases in apoptotic cell death induced by ricin, modeccin, diphtheria toxin, and Pseudomonas toxin, J. Biochem. 1998. Vol. 124. P. 1038-1044.
13. Morganti R.P., Marcondes S., Baldasso P.A. et al. Inhibitory effects of staphylococcal enterotoxin type B on human platelet adhesion in vitro, Platelets. 2008. Vol. 19, No. 6. P. 432-439.
14. Ruckdeschel K. Immunomodulation of macrophages by pathogenic Yersinia species, Arch. Immunol. Ther. Exp.-Warsz. 2002. Vol. 50, No. 2. P. 131-137.
15. Viboud G.I., Bliska J.B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis, Ann. Rev. Microbiol. 2005. Vol. 59. P. 69-89.
Поступила в редакцию 01.04.2011.
effects from far eastern holothurians extract on oxidant-antioxidant balance and apoptosis IN MICE macrophages IN CAsE OF ExPERIMENTAL pseudotuberculosis infection
L.S. Dolmatova1, O.A. Zaika1, N.F. Timchenko2 1 Pacific Oceanological Institute (43 Baltiyskaya St. Vladivostok 690041 Russian Federation), 2 Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Siberian Brach of Russian Academy of Medical Sciences (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russian Federation)
Summary - The paper describes effects from the Far Eastern Ho-lothurians extract on nitroblue te-trazolium production level and action of antioxidant ferments of mice macrophages infected with Yersinia pseudotuberculosis. As reported, given the 100 % survival rate, 67 % of infected animals had the peritoneal fluid coagulated. The three day introduction of HE into infected animals at the concentration of 0.5-1 mg/kg allowed to suppress functional activity of macrophages and have protective antiseptic effect, thereby decreasing a number of mice with septic manifestations. Given the 10 mg/kg dose, the Holothurians extract appeared to stimulate functional activity of macrophages and increase number of mice with coagulated peritoneal fluid. The authors suggest applying the Holothurians-derived extract in low doses to treat septic manifestations in case of Yersiniosis. Key words: Yesinia, Holothurians extract, macrophages, sepsis.
Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 53-56.
