CC BY
40
УДК 593. 961+577. 15061
Л.С.Долматова, Ю.И.Добряков, А.Л.Ковалева, О.А.Шиткова
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ХАУРАНТИНА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ЦЕЛОМОЦИТАХ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ГОЛОТУРИЙ
Тихоокеанский океанологический институт им. В. И. Ильичева ДВО РАН, лаб. фармакологии отдела биохимических технологий г.Владивосток
РЕЗЮМЕ
Исследовано влияние антистрессового препарата из асцидий Halocynthia aurantium хаурантина на активность супероксиддисмутазы (СОД) и ка-талазы фагоцитов (амебоцитов) голотурий
Eupentacta fraudatrix. Инкубацию клеток с хауран-тином проводили при 20оС в течение трех суток. Жизнеспособность клеток в контроле и при действии препарата в концентрации 1 мкг/мл снижалась (на 20%) только к концу третьих суток. Концентрации хаурантина 10 и 100 мкг/мл вызывали значительное снижение жизнеспособности (в 2 раза) и ингибирование активности СОД (в 9,6-7,4 раза) и каталазы (в 2 раза) уже в первые 1 и 18 часов, и значительное подавление указанных параметров сохранялось до конца инкубации. Достоверной разницы между эффектами хаурантина в концентрациях 10 и 100 мкг/мл не обнаружено. Это указывает на значительную токсичность препарата в больших концентрациях. Значительное снижение активности антиоксидантных ферментов, совпадающее по времени со снижением жизнеспособности клеток, свидетельствует о наличии некоторых общих механизмов ответа фагоцитов голотурий и лейкоцитов позвоночных животных.
SUMMARY L.S .Dolmatova, Yu.I.Dobryakov, A.L.Kovaleva, O.A.Shitkova
KHAURATINE INFLUENCE ON ANTIOXIDANT ENZYME ACTIVITY IN COELOMOCYTES OF THE FAR-EASTERN HOLOTHURIANS
We studied the effect of anti-stress preparation from ascidia Halocynthia aurantium kharan-tin on the superoxide dismutase (SOD) and phagocyte catalase (ameobocytes) of holothurian Eupentacta fraudatrix. The cells were incubated at 20 C during 3 days.
Viability of control cells and khuratine-treated cells (1 mkg/ml) decreased 20% only at the end of incubation period. Khuratine at the concentration of 10 and 100 mkg/ml decreased a viability (2 times) and inhibited SOD activity (9,6-7,4 times) and catalase activity (2 times) during the first 18 hours, with values remaining at this low level until incubation was completed. There was no significant difference between effects of khurantine at concentrations 10 and 100 mkg/ml, which suggests toxicity of preparation at
high concentration. Significant decrease in antioxidant enzyme activity occurring simultaneously with decrease in cell viability suggests that common cell response mechanisms operate in holothurian phagocytes and vertebrate leukocytes.
Создание новых биологически активных добавок к пище (нутрицевтиков) и лекарственных препаратов на основе биологически активных веществ природного происхождения - одно из основных направлений биотехнологии. Богатейшим источником получения биологически активных веществ являются морские организмы. Однако разработка препаратов на их основе часто затруднена сложностью предварительных опытов по определению направленности действия того или иного вещества, и важное значение имеет выбор модели для скрининга, облегчающей эту задачу. Поскольку практически любая патология включает в себя элементы стресса, сопровождающегося усилением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), ведущих к нарушению структурного гомеостаза организма, важнейшим параметром проверки действия биологически активных веществ должно быть испытание их на анти- или про-стрессовую активность.
В антистрессовой защите организма большую роль играют ферменты антиоксидантной системы, и изменения их активности под действием стрессовых факторов происходят даже раньше, чем регистрируется интенсификация ПОЛ [11]. В связи с этим, к важнейшим начальным этапам скрининга могут быть отнесены измерения активности антиоксидант-ных ферментов под действием того или иного препарата. Объектом проведения скрининга часто служат культуры клеток млекопитающих, получение которых является методически сложным и дорогостоящим процессом, который может быть облегчен использованием короткоживущих культур, в том числе, лейкоцитов крови [1]. Еще более перспективным направлением тестирования может оказаться использование клеток морских беспозвоночных, в частности, клеток целомической жидкости беспозвоночных (це-ломоциты голотурий, гемоциты моллюсков и т.д.), по объему составляющей большую часть их тела, так как эти клетки функционально сходны с клетками иммунной системы позвоночных [13]. Иглокожие (Echinodermata) занимают особое место среди беспозвоночных. Они являются одними из наиболее низкоорганизованных животных с соответствующим уровнем развития иммунной системы. В то же время
они, будучи вторичноротыми, имеют общего предка с позвоночными, в связи с чем использование их им-муноцитов представляет интерес для создания возможных моделей скрининга биологически активных веществ. Для некоторых типов целомоцитов морских беспозвоночных установлено наличие на поверхности рецепторов к ряду биологически активных веществ, таких, как опиоидные нейропептиды, ИЛ-1 [12, 14].
Нами ранее показана высокая активность антиок-сидантных ферментов в целомоцитах двух видов дальневосточных голотурий - представителей типа иглокожих [10]. Однако исследований влияния комплексов биологически активных веществ на антиоксидантную систему клеток беспозвоночных практически нет. Разработанный в нашем отделе препарат «хаурантин» с высокой стресс-протекторной активностью, получаемый из асцидии Halocynthia aurantium, был ранее протестирован нами в модельных опытах на нейтрофилах крови [1] и показал хорошее защитное действие на антиоксидантную ферментную систему. Задачей настоящей работы явилось изучение влияния хаурантина на антиоксидант-ные ферменты супероксиддисмутазу (СОД) и катала-зу в фагоцитах дальневосточной голотурии Eupentacta fraudatrix. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 00-04-48949).
Материалы и методы
Голотурии Eupentacta fraudatrix были собраны в заливе Петра Великого в феврале 2001 г. До начала экспериментов они находились в аквариуме с проточной аэрируемой морской водой в течение двух недель. Животных разрезали и целомическую жидкость от трех особей сливали в пенициллиновый флакон с равным объемом антикоагулирующего раствора (30 мМ ЭДТА, 3,1% раствор №С1, 50 мМ трис-НС1, рН 7,6) [8]. Всего использовали 15 животных.
Получение фагоцитов проводили по модифицированному методу [5]. Образцы целомической жидкости, разведенной антикоагулирующим раствором, наносили на ступенчатый градиент гистопака (Histopaque-1077, “Sigma”) на антикоагулирующем растворе, при следующем соотношении гистопака и указанного раствора: 1:0; 1:0,4; 1:1 и 1:2 (v:v). Центрифугировали при 300 g в течение 15 мин при 5оС. Полученную в интерфазе между растворами (1:2) и образца фракцию отбирали, полученные клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) с глюкозой (0,1%) и NaCl (36 г/л) и ресуспендировали в среде 199, содержащей на 1 л 16,41 г NaCl, 0,264 г KC1,
0,87 г CaC12, 4,98 г MgC12-6H2O, 3,87 г MgSO4-7H2O,
22,74 г глицина, 0,1 г глюкозы, 2,5 г бычьего сывороточного альбумина, 50 мг оксациллина натрия [3]. Для определения чистоты полученных фракций делали мазки с окраской 1% раствором метиленовой сини на 1% растворе буры. Жизнеспособность клеток в полученных фракциях определяли тестом исключения трипанового синего, чистоту фракции определяли микроскопическим исследованием окрашенных метиленовой синью мазков. Клетки (0,5-1 млн клеток /лунку) инкубировали в круглодонных планшетах при 20оС в течение 66 часов с добавлением фосфатно-солевого буфера (контроль) или различных концентраций хаурантина, предварительно дезалкоголизированного выпариванием (1, 10, 100 мкг/мл, из расчета массы сухого остатка). Отбор проб производили в разные временные сроки, клетки замораживали в жидком азоте и хранили при -18оС до последующих анализов ферментативной активности.
Перед определением ферментативной активности клетки разрушали ультразвуком (УЗДН-1, 22 кГц, 1,5 мин при 0оС). Ядра осаждали центрифугированием. В полученных супернатантах определяли активность СОД (КФ 1.15.1.1) спектрофотометрически по
методу C.Beachamp and I.Fridovich [4], (рН 8,3), ка-талазы (КФ 1.11.1.6) - по методу F.Rega1i et a1. [15], (рН 7,7). Для измерения активности использовали спектрофотометр Shimadzu (модель UV-2101, Япония). Концентрацию белка измеряли по методу М.М.Бредфорда [7]. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Целомоциты голотурий Eupentacta fraudatrix разделяют на пять типов: ювенильные клетки, по-видимому, являющиеся стволовыми клетками для других целомоцитов, амебоциты (фагоциты), мору-лярные клетки, жгутиковые клетки и гемоциты. Существуют указания, что фагоциты беспозвоночных функционально аналогичны макрофагам позвоночных, они могут осуществлять фагоцитоз или инкапсулирование чужеродного материала [8, 13]. Выделенная нами фракция фагоцитов имела чистоту 99% и жизнеспособность около 98%. Инкубация клеток в отсутствие хаурантина сама по себе, по-видимому, оказывала стрессогенное действие. Так, активность СОД возрастала уже в первый час, а каталазы - в первые 18 часов инкубации. К концу третьих суток активность СОД снижалась даже несколько ниже исходного уровня, но активность каталазы к этому времени превышала исходную в 4,1 раза. При этом жизнеспособность оставалась неизменной в течение первых 18 часов инкубации, и снижалась до 72% только к концу третьих суток (табл.). Полученные на
Таблица
Влияние инкубации при 20о С на активность ферментов (М ± м) и жизнеспособность фагоцитов голотурии ЕирвМа^а/гаийа1т1х в контроле
Показатели До инкубации 1 ч инкубации 18 ч инкубации 66 ч инкубации
Активность СОД, ед. /мг белка 742,8±146,1 2678±504 2677±348 622,2±68,1
Активность каталазы, мкмоль/мин/мг белка 80,75±38,20 98,30±12,10 202,3±46,9 333,5±62,5
Жизнеспособность, % 98 95 96 72
а б в
Рис. Влияние хаурантина на изменения активности СОД и каталазы фагоцитов голотурии ЕирвМа^а /гаыёаМх при температуре инкубации 20оС.
Примечание: по оси абсцисс - концентрация хаурантина: а- 1 мкг/мл, б - 10 мкг/мл, в - 100 мкг/мл.
1-каталаза, 1 час инкубации; 2 - СОД, 1 час инкубации; 3 - жизнеспособность, 1 час инкубации; 4 - каталаза, 18 часов инкубации; 5 - СОД, 18 часов инкубации; 6 - жизнеспособность, 18 часов инкубации; 7 - каталаза, 66 часов инкубации; 8 - СОД, 66 час инкубации; 9 - жизнеспособность, 66 час инкубации.
фагоцитах голотурий данные аналогичны результатам, полученным Т.С.Р.Сигі й а1. [9] при исследовании динамики жизнеспособности нейтрофилов при культивировании, которые свидетельствуют о том, что в нормальных условиях к 18 ч инкубации жизнеспособность клеток не менялась, и только после 24 ч инкубации она начинала снижаться и появлялись первые морфологические признаки апоптоза. Существует немало доказательств участия антиоксидант-ных ферментов позвоночных в развитии апоптоза [16], который, как нами показано ранее, имеет место и при инкубации фагоцитов голотурий [2]. В наших экспериментах снижение активности СОД при одновременном росте активности каталазы соответствовало по времени снижению жизнеспособности клеток, что также указывает на возможность участия антиоксидантных ферментов фагоцитов голотурий в механизмах гибели клеток. Все это свидетельствует в пользу сходства механизмов развития клеточного ответа позвоночных и голотурий.
Исследование влияния хаурантина в концентрации 1 мкг/мл показало отсутствие выраженных изменений активности каталазы фагоцитов как через 1 ч, так и 66 ч инкубации по сравнению с контролем. Эта же концентрация хаурантина не вызывала достоверных изменений жизнеспособности клеток (рис. 1а). Поэтому более подробно были исследованы эффекты хаурантина в концентрациях 10 и 100 мкг/мл. Было выяснено, что обе концентрации хаурантина вызывали значительное ингибирование активности СОД по сравнению с контролем уже через 1 час после введения (рис. 1б, 1в), в 9, 6 (10 мкг/мл) и 7,4 раза (100 мкг/мл), при этом активность фермента снижалась значительно ниже исходного (до начала инкубации) уровня. В последующий период (до 18 часов инкубации) активность СОД при действии хаурантина в указанных концентрациях сохранялась примерно на том же уровне, но к 66 часам несколько возрастала, оставаясь все же значительно ниже контрольного
уровня. Сходное действие хаурантин в этих концентрациях оказывал и на активность каталазы: значительное ее ингибирование, в 2 раза, отмечено уже через 1 час воздействия препарата в обеих концентрациях, к 18 часам отмечено некоторое повышение активности каталазы, но к 66 часам активность фермента падает до 15-18% от контрольного уровня. Хаурантин в обеих концентрациях значительно снижал, примерно в 2 раза, жизнеспособность фагоцитов, начиная с 1 часа и в течение всего дальнейшего времени инкубации. Таким образом, хаурантин в этих концентрациях оказывал токсическое действие на клетки, и этот эффект хаурантина в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл не был концентрационно-зависимым. По-видимому, это действие больших концентраций хаурантина осуществляется не через классические рецепторные механизмы, как это показано для больших концентраций некоторых других биологически активных веществ [7]. Необходимо отметить, что в ранее проведенных нами опытах по тестированию влияния хаурантина на антиоксидант-ные ферменты нейтрофилов крови человека, препарат использовали в концентрации 0,5 нг/мл, и уже эта концентрация оказывала хороший защитный эффект при моделировании стресса [1]. Учитывая сходство в механизмах реагирования клеток крови позвоночных и фагоцитов голотурий, отмеченное выше, можно ожидать, что защитное действие на фагоциты голотурий хаурантин может оказывать в концентрациях, не превышающих 1 мкг/мл.
Выводы
1. При инкубации фагоцитов голотурий Еиреп(ас(а /гаыёаМх при 20оС жизнеспособность клеток сохраняется до трех суток.
2. Снижение жизнеспособности фагоцитов голотурий соответствует по времени снижению активности СОД ниже исходного уровня, что свидетельствует о наличии сходных механизмов реактивности фа-
гоцитов голотурий и лейкоцитов крови позвоночных животных.
3. Хаурантин в концентрации 1 мкг/мл не оказывал достоверного влияния на активность каталазы и жизнеспособность клеток, а в концентрациях 10 и 100 мкг/мл вызывал значительное ингибирование активности СОД и каталазы и снижение жизнеспособности фагоцитов голотурий начиная с первого часа и в течение всего последующего периода инкубации. Это свидетельствует о высокой токсичности препарата в концентрациях, превышающих 1 мкг/мл, для фагоцитов голотурий.
4. Фагоциты голотурий Eupentacta fraudatrix, по-видимому, могут использоваться для изучения про-или антистрессовой направленности действия биологически активных веществ.
5. Тестирование действия препаратов по антиок-сидантной ферментной активности фагоцитов голотурий можно ограничивать 1-часовым периодом инкубации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долматова Л.С., Долматов И.Ю., Добряков Ю.И.
Сравнительное исследование биологического действия экстрактов из морских животных в модельных экспериментах на нейтрофилах челове-ка//Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья.- Владивосток: Дальнаука,
2000.-Вып.4.-С.155-162.
2. Долматова Л. С., Ромашина В. В., Дзуцев А. Х. Дозозависимое влияние морфина in vitro на апоптоз фагоцитов дальневосточной голотурии Stichopus ]аротси8//Нейроиммунология: Х научно-практическая конференция неврологов, Санкт-Петербург, 28-31 мая 2001 г.- СПб, 2001.-С.69-70.
3. Одинцова Н. А. Репродукция и дифференциров-ка клеток двустворчатых моллюсков и иглокожих in
vitro: Автореф.дис.... д-ра. биол.наук-Владивосток,
1999.-45 с.
4. Beachamp C. O., Fridovich I. Superoxide dismu-tase: improved assays and an assay applicable to acrila-mide gels//Anal. Biochem.-1971.-Vol.44.-P.276-287.
5. Bertheussen K., Seljelid R. Echinoid phagocytes in vitro//Experimental Cell Research.-1978.-Vol.111.-Р.401-412.
6. Bian T. H., Wang X F, Li X. Y. Effects of morphine and naloxone on proliferation of lymphocytes in vi-tro//Acta Pharmacol. Sinica.-1995.-Vol.16, №4.-P.315-318.
7. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Analyt. Biochem.-1976.- Vol.72.-P.248-254.
8. Chia Fu-Sh., Xing J. Echinoderm coelomocytes// Zoological Studies.-1996.-Vol.35, №4.-P.231-254.
9. Curi T. C. P., Demelo M. P., Palanch A. C. et al. Percentage of phagocytosis, production of O2-, H2O2 and NO, and antioxidant enzyme activities of rat neutrophils in culture//Cell Biochem. Funct.-1998.-Vol. 16.-P.43-49.
10. Dolmatova L.S., Romashina V.V., Kovaleva A.L. Comparative studies on the antioxidant enzyme activities in coelomocytes of far eastern holothurians A. japonicus and E. fraudatrix, and sea star A. аmurensis//PICES Tenth Annual Meeting Program abstracts. Victoria. October , 5-13, 2001.-P.187.
11. Halliwell B., Chirico S. Lipid peroxidation -its mechanism, measurement, and significance//Am. J. Clin. Nutrition.-1993.-Vol.57.-P. S715-S725.
12. Hughes T. K., Smith E. M., Barnett J. A. et al. LPS stimulated invertebrate hemocytes: a role for immu-noreactive TNF and IL-1//Developmental and Comparative Immunology.-1991.-Vol.15.-P.117-122.
13. Pipe R. K. Generation of reactive oxygen metabolites by the haemocytes of the mussel Mytilus edu-lis//Developmental and Comparative Immunology.-1992.-Vol.16, №2/3.-P.111-122.
14. Stefano G. B., Cadet P., Scharrer B. Stimulatory effects of opioid neuropeptides on locomotory and conformational changes in invertebrate and human immuno-cytes: evidence for a new subtype of delta receptor//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-Vol.86.-P.6307-6311.
15.Regoli F., Principato G. B., Bertoli E. et al. Biochemical characterization of the antioxidant system in the scallop Adamussium colbecki, a sentinel organism for monitoring the antarctic environment//Polar. Biol. 1997.-Vol.17.-P.251-258.
16. Welsh D, Marx S, Kabelitz D. Monocyte-dependent death of freshly isolated T-lymphocytes: induction by phorbolester and mitogens and differential of catalase//J. Immunol.-1998.-Vol.161.-P.1248-1256.
□ □□
