CC BY
19
001: 10.23868/202011013
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВНУТРИАРТЕРИАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ, ПОЛУЧЕННОЙ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ, ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ У КРЫС
Поступила: 29.05.2020 Принята к печати: 30.08.2020 Опубликована on-line: 15.12.2020
Э.А. Черкашова1, Д.И. Салихова2, 6, Д.Д. Наместникова3, Г.Е. Леонов2 И.Л. Губский1, А.А. Соловьева1, Г.Б. Акопян1, В.В. Курило3, М.П. Никитина6, Т.Х. Фатхудинов6' 7, В.П. Чехонин3, Л.В. Губский1' 3, К.Н. Ярыгин4, 5, Т.Б. Бухарова2, Д.В. Гольдштейн2, 7
1 Федеральный центр мозга и нейротехнологий Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия
2 Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова, Москва, Россия
3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, Москва, Россия
4 Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Москва, Россия
5 Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования, Москва, Россия
6 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия
7 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
THERAPEUTIC EFFECTS OF INTRA-ARTERIAL ADMINISTRATION OF GLIAL PROGENITOR CELLS-CONDITIONED MEDIUM IN ACUTE EXPERIMENTAL ISHEMIC STROKE IN RATS
E.A. Cherkashova1, D.I. Salikhova2, 6, D.D. Namestnikova3, G.E. Leonov2, I.L. Gubskiy1, A.A. Solovieva1,
G.B. Akopyan1, V.V. Kurilo3, M.P. Nikitina6, T.Kh. Fatkhudinov66 7, V.P. Chekhonin3, L.V. Gubskiy1, 3, K.N. Yarygin4, 5,
T.B. Bukharova2, D.V. Goldshtein2, 7
1 Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency, Moscow
2 Research Centre for Medical Genetics, Moscow, Russian Federation
3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russian Federation
4 V.N. Orehovich Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russian Federation
5 Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow, Russian Federation
6 Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russian Federation
7 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russian Federation
e-mail: [email protected]
На сегодняшний день перспективным подходом к терапии ишемического инсульта является трансплантация различных типов стволовых клеток, результаты которой продемонстрировали свою эффективность. В последнее время большинство исследователей склоняются к предположению, что терапевтический эффект клеточной терапии в большей степени основан на механизме паракринного действия, связанного с секрецией клетками широкого набора регуляторных белков. Недавние исследования показали, что введение кондиционированных сред, полученных при культивировании стволовых клеток, может быть эффективным при терапии заболеваний центральной нервной системы. Целью настоящей работы является оценка терапевтических эффектов кондиционированной среды, содержащей продукты секреции глиальных клеток-предшественниц, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, на модели экспериментального ишемиче-ского инсульта у крыс. Было обнаружено, что внутриартери-альное введение кондиционированной среды, полученной при культивировании глиальных клеток-предшественниц, способствовало более быстрому снижению степени неврологического дефицита по сравнению с контрольной группой. Кроме того, были выявлены изменения в экспрессии генов дар43, Ьах и Ь^а. Однако значимого уменьшения объема очага инфаркта зарегистрировано не было. Наши результаты показали, что введение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции глиальных клеток-предшественниц, индуцирует функциональное восстановление и может повлиять на пластичность мозга после экспериментального инсульта.
Ключевые слова: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, глиальные клетки-предшественницы, кондиционированная среда, ишемический инсульт, окклюзия средней мозговой артерии.
Transplantation of various types of stem cells as a possible therapy for stroke has been tested for years and the results are promising. Recently, most researchers are inclined to assume that the therapeutic effect of stem cell therapy is based on the mechanism of paracrine action associated with the secretion wide set of regulatory proteins. The aim of this study was to evaluate therapeutic effects of iPSC-derived glial progenitor cells conditioned medium in the rat middle cerebral artery occlusion model of the ischemic stroke. We showed that intra-arterial administration of glial progenitor cells conditioned medium promoted faster decrease of neurological deficit compared to the control group. Moreover, expression of gap43, bax, and tnfa genes involved in neuritogenesis, apoptosis and neuroinflammation was altered. However, no significant enhanced reduction of the infarct volume was registered. Our results demonstrated that administration of glial progenitor cells conditioned medium induced functional recovery after experimental stroke and may affect brain plasticity.
Keywords: induced pluripotent stem cells, glial progenitor cells, conditioned medium, stroke, middle cerebral artery occlusion.
Введение
Ишемический инсульт — значимая медицинская и социальная проблема во всем мире. Необходимо констатировать, что единственными результативными методами лечения в острый период заболевания являются тромбо-лизис и тромбоэкстракция [1]. Тем не менее, данные подходы к терапии не показаны для восстановления утраченных функций головного мозга. В связи с этим поиск новых методов реабилитации больных с ишемическим инсультом остается актуальной медицинской задачей [2]. За последнее десятилетие в ряде исследований были продемонстрированы преимущественно положительные эффекты трансплантации нескольких типов стволовых клеток на моделях экспериментального инсульта in vivo и в клинических испытаниях [3]. Технология получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открывает перспективы в области персонализированной терапии, включая возможность получения нейрональных и глиальных клеток-предшественниц человека в неограниченных количествах и минуя этические проблемы [4-6]. Терапия на основе кондиционированных сред (Кс) — новый перспективный подход, способный обойти ряд технических, клинических и этических ограничений при прямой трансплантации стволовых клеток [7]. В настоящее время большинство исследователей изучают свойства Кс, полученных при культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Однако уже есть работы по применению КС, содержащих продукты секреции и других типов клеток. В частности, перспективным вариантом может быть Кс, полученная при культивировании глиальных клеток, поскольку именно данный тип клеток защищает и поддерживает нейроны, секретируя широкий спектр биологически активных факторов [8]. Эксперименты in vitro показали нейропро-тективное действие КС глиальных клеток на нейроны [9]. Нами не было найдено исследований, посвященных изучению влияния КС глиальных клеток на течение экспериментального ишемического инсульта.
Целью данной работы является изучение терапевтической эффективности внутриартериального введения КС, полученной при культивировании глиальных клеток-предшественниц (КС-ГКП), на модели окклюзии средней мозговой артерии у крыс (ОСМА).
Материал и методы
Дизайн исследования
Эксперимент выполнен на половозрелых самцах крыс линии Вистар массой 250-300 г (n=31) (AlCondi Ltd., Россия). Все манипуляции с животными были одобрены этическим комитетом Научно-исследовательского института морфологии человека (протокол № 20 от 12.02.20l9) и проведены в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза. Через 24 ч. после ОСМА крысы были случайным образом разделены на 2 экспериментальные группы: группа 1 — контрольная группа с внутриартериальным (ВА) введением 1 мл DMEM/ F12 (Панэко, Россия) (n=19), группа 2 — опытная группа с ВА введением 1 мл КС-ГКП (n=12). Оценку массы тела, неврологического дефицита, объема очага инфаркта мозга производили на следующий день после ОСМА, а также через 7, 14 и 30 сут. после введения сред. Через 30 сут. после инъекций животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения летальной дозы хлоралгидрата (Sigma-Aldrich, США). На фронтальных срезах участков ишемически поврежденной
ткани мозга анализировали экспрессию генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Получение кондиционированных сред на основе
глиальных клеток-предшественников
ИПСК, полученные из дермальных фибробластов человека с применением набора для репрограммирования CTS CytoTune-IPS 2.1 Sendai (Invitrogen, США), были дифференцированы в глиальные клетки-предшественницы (ГКП), согласно ранее опубликованному протоколу [10]. На первом этапе дифференцировки ИПСК культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия), в которую добавляли малые молекулы-ингибиторы TGFb и BMP сигнальных путей — SB431542 (Stemcell Technologies, США), дорсоморфин (Stemcell Technologies, США) и LDN193189 (Sigma-Aldrich, США), до образования нейральных стволовых клеток (НСК). На следующем этапе НСК инкубировали в среде с факторами роста EGF, FGF-2 (ProSpec, Великобритания) и CNTF (PeproTech, США) для формирования глиального фенотипа. Для получения КС-ГКП клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором и культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия) в течение 12 ч. Далее КС-ГКП центрифугировали при 3000 об/ мин. в течение 5 мин., супернатант собирали и пропускали через 0,22-мм фильтр, затем немедленно замораживали и хранили при температуре -20 °С в течение 1 недели. Для внутриартериального введения КС-ГПК готовили раствор, содержащий 50 мкг общего белка в 1 мл среды.
Количественное определение белка
Определение концентрации белка проводили по методу Бредфорда [11]: к 160 мкл раствора белка добавляли 40 мкл 0,03% раствора кумасси G-250 (BioRad, США), инкубировали 5-10 мин. при 20 С и измеряли оптическую плотность при 595 нм на планшетном ридере (PerkinElmer, США). Концентрацию белка определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали растворы 0-250 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (Панэко, Россия).
Иммуноцитохимический анализ
Для подтверждения фенотипа полученной культуры ГКП было проведено иммуноцитохимическое окрашивание на глиальные маркеры. Клетки фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck, Германия) в течение 10 мин., пермеабилизовали 0,25% раствором Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. и обрабатывали первичными антителами к глиальному маркеру S100b и фиброзному астроцитарному маркеру CD44 в течение ночи при +4 °C: анти^100Ь (1:300; Abcam ab52642, США) и анти^44 (1:400; Abcam ab6124, США). Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с вторичными антителами, меченными флуорохромом Alexa Fluor 555 goat anti-mouse (1:600; Invitrogen, США) и Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (1:600; Invitrogen, США) в темноте в течение 60 мин. Ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндолдигидрохлорида) (Sigma-Aldrich, США).
Моделирование экспериментального
инфаркта мозга
транзиторную окклюзию правой средней мозговой артерии выполняли по методу Коидзуми [1 1 ]
в модификации Лонга [12] и с дополнительным интра-операционным МРТ-контролем, как было описано нами ранее [13]. Операцию проводили под ингаляционной анестезией 2,5-3% изофлураном (Minrad, США] со смесью атмосферного воздуха (97-97,5%]. Окклюзию правой средней мозговой артерии производили монофиламен-том 4-0, покрытым силиконовым наконечником (диаметр 0,19 мм, длина 30 мм; диаметр покрытия 0,37±0,02 мм; длина покрытия 3-4 мм; корпорация Doccol, США] в течение 90 мин., после чего филамент извлекали с целью реперфузии. Во время операции и до полного выхода из наркоза температуру животных поддерживали на уровне 37 °С с помощью грелки.
Внутриартериальное введение КС-ГКП
Под ингаляционной анестезией изофлураном операционную рану вскрывали, через культю наружной сонной артерии вводили полиуретановый микрокатетер (наружный диаметр 0,635 мм, внутренний диаметр 0,305 мм; корпорация Doccol, США] во внутреннюю сонную артерию с поддержанием кровотока, катетер подсоединяли к шприцу объемом 1 мл, помещенному в микроинъектор, и вводили 1 мл КС-ГКП или DMEM/F12 со скоростью 100 мкл/мин.
Магнитно-резонансная томография
Магнитно-резонансную томографию (МРТ) выполняли с использованием экспериментального МРТ томографа для малых лабораторных животных с индукцией магнитного поля 7 Тл ClinScan (Bruker BioSpin, США]. МРТ-диагностику ОСМА для контроля положения филамента, кровотока в интракраниальных сосудах и геморрагического осложнения проводили, как описано ранее [1 3]. Объем инфаркта мозга оценивали с помощью программного пакета ImageJ (Национальный институт психического здоровья, США] по данным Т2-взвешенных изображений (Т2-ВИ] путем суммирования объемов, измеренных в соседних поперечных сечениях по следующей формуле: V=(S1+...+Sn]x(h+d], где
S1.....Sn — площадь, измеренная на срезе n, h — толщина
среза, d — интервал между срезами.
Оценка терапевтических эффектов
Терапевтические эффекты определяли по показателям выживаемости, массы тела и баллу по модифицированной шкале оценки тяжести инсульта для грызунов (mNSS] до введения и далее через 7, 14 и 30 сут. после инфузии КС-ГКП. Степень выраженности неврологического дефицита оценивали по двигательной и сенсорной функциям, рефлексам и способности держать равновесие [14].
ПЦР-анализ
При исследовании экспрессии генов в тканях головного мозга крыс через 30 сут. эксперимента готовили фронтальные срезы из области повреждения и обрабатывали их реагентом RNAlater (Invitrogen, США] для стабилизации РНК в тканях. Из полученных образцов ткани выделяли мРНК с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США] в соответствии с прилагаемыми инструкциями. кДНК синтезировали по стандартному протоколу Fermentas kit (Thermo Fisher Scientific, США]. Для ПЦР в режиме реального времени использовали готовую реакционную смесь с интеркали-рующим красителем qPCRmix-HS SYBR (Evrogen, Россия],
амплификацию проводили с помощью термоциклера BioRad iQ cycler (BioRad, США]. Параметры реакции: первичная денатурация 95 °C, 5 мин.; денатурация 95 °C, 20 сек.; отжиг праймера 55-63 °C, 20 сек.; удлинение 72 °C, 20 сек. (40 циклов]. Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации гена домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа]. Праймеры для ПЦР: GAP43, forward AAGGATGATGCTCCCGTTGC, reverse CGGCCTTTTCCTCTGAAGGG; BAX forward TTGTG-GCTGGAGTCCTCACT; reverse TTTCCCCCCCCCCATTCATC; BCL-2 forward GGGGCTACGAGTGGGATACT, reverse GACGGTAGCGACGAGAGAAG; TNFa forward CCACCAC-GCTCTTCTGTCTA, reverse GCTACGGGCTTGTCACTCG; GAPDH forward GCGAGATCCCGCTAACATCA, reverse GCTACGGGCTTGTCACTCG. Относительное количество мРНК было рассчитано методом 2-AAC(T].
Статистический анализ
статистическую обработку данных выполняли в программе SigmaPlot 12.5 (Национальный институт психического здоровья, сША]. сравнение данных при нормальном распределении проводили с помощью t-теста, при распределении, отличном от нормального — с помощью U-критерия Манна-Уитни. Для оценки кривой выживаемости использовали метод Каплана-Мейера с сопоставлением двух групп. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты
Характеристика ГКП, полученных из ИПСК
После дифференцировки ГКП имели веретенообразную или уплощенную морфологию с тонкими, умеренно разветвленными отростками (рис. 1А]. ГКП были имму-нопозитивны к глиальному маркеру S100b и маркеру фиброзных астроцитов CD44 (рис. 1Б, В] [15]. Доля S100b+-клеток в культуре составила 97±3%.
Выживаемость животных
Кривые выживаемости Каплана-Мейера для сравниваемых групп представлены на рис. 2А. Животные обеих групп погибали в основном в течение первых 3 сут. после ОСМА из-за вазогенного отека вещества мозга, характерного для острейшего периода ишемического инсульта, достоверных различий между двумя группами выявлено не было. Таким образом, введение КС-ГКП не оказывало значимого влияния на выживаемость животных.
Масса тела
терапия КС-ГКП не оказывала значимого влияния на динамику изменения массы тела: в обеих группах масса тела животных снижалась в течение первых 7 сут. после ОСМА, достоверных различий между двумя экспериментальными группами не было (рис. 2Б].
Неврологический дефицит
Животных обеих групп тестировали по шкале mNSS для оценки степени неврологического дефицита перед введением КС-ГКП и далее через 7, 14, 30 сут. Было обнаружено, что терапия КС-ГКП значимо улучшала функциональное восстановление животных в остром периоде экспериментального ишемического инсульта:
Рис. 1. Глиальные клетки-предшественницы, полученные из ИПСК: А — морфология клеток в культуре; Б, В — экспрессия культурой глиального маркера Б100Ь (Б, зеленый цвет) и фиброзного астроцитарного маркера С044 (В, красный цвет). А — фазово-контрастная микроскопия, Б, В — иммуноцитохимическая реакция с антителами к соответствующим маркерам, ядра клеток докрашены йДР!, флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок: А — 1000 мкм, Б, В — 100 мкм.
А
Б
В
1,02 5 1,00 , | 0,98 Ё | 0,96 ^ | 0,94 0,92
р с
■ 1 0,90 0,88 0,86
Рис. 2. Динамика выживаемости, изменения массы тела и объема очага повреждения после ОСМА у животных с введением КС-ГКП или 0МЕМ/Р12 (контроль): А — кривые выживаемости Каплана-Мейера в группах контроля и КС-ГКП; Б — динамика изменения массы тела животных, нормированная по отношению к 1 сут.; В — динамика изменения степени неврологического дефицита, нормированная по отношению к 1 сут. *разница с контрольной группой статистически значима, р<0,05
1,2
1,0
0,8
■я О
? 5 0,6
XI 0,4
0,2
*
0
5
10
20
25
30
0
5
10
20
25
30
0
5
15
А
день 1
день 7 т2-ВИ день 14
день 30
0 5 10 15 20 25 30
Рис. 3. Объем очага инфаркта (А) и МРТ-изображения (Б) головного мозга крыс обеих групп. Динамика нормированного объема очага инфаркта по отношению к 1 сут.
Б
1,1
1,0
5 ? 0,9
0,8
0,7
0,6
балл по шкале тИББ был достоверно ниже в группе с введением КС-ГКП по сравнению с контрольной группой через 14 и 30 сут. (р<0,05) (рис. 2В).
Объем очага инфаркта
При сравнении объемов зон инфаркта мозга, посчитанных с использованием Т2-взвешенных МРТ-изображений в динамике, статистически значимых различий между двумя группами обнаружено не было (рис. 3).
Изменение профиля экспрессии генов
в тканях в области повреждения
После введения КС-ГКП уровень экспрессии гена позитивного регулятора апоптоза Ьах статистически
значимо снижался по сравнению с контрольной группой. Достоверных различий в экспрессии гена Ьс/2 между группами сравнения обнаружено не было (рис. 4). Введение КС-ГКП статистически достоверно снижало экспрессию гена Ша в паренхиме головного мозга и повышало экспрессию маркера нейритогенеза дар43 по сравнению с контрольной группой (рис. 4).
Обсуждение
Роль веществ, секретируемых глиальными клетками, в восстановлении функциональной активности крыс после ишемического инсульта изучена нами впервые. Проведенное исследование показало, что терапия КС-ГКП приводила к более выраженному регрессу неврологической симптоматики у животных после
14 и 12108 -6 -4 -2 -0-
I Контроль I КС-ГКП
У
Ш
gap43 bcl2
bax
tnfa
Рис. 4. Относительная экспрессия генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления. ПЦР в режиме реального времени.
*разница с контрольной группой статистически значима, р<0,05
инсульта по сравнению с контрольной группой. Однако мы не наблюдали значимого уменьшения объема очага инфаркта мозга или улучшения выживаемости животных в ответ на введение КС-ГКП.
Для поиска молекулярно-генетических механизмов терапевтического воздействия Кс-ГКП была изучена экспрессия генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления с помощью ПЦР-анализа. Известно, что сосудистый некроз головного мозга вызывает вторичное, зачастую отсроченное поражение тканей за счет продолжающегося воспаления. Данная реакция сопровождается выработкой провоспалительных цитокинов и факторов роста. Повышенная экспрессия гена tnfa
усиливает выраженность поражений при очаговой церебральной ишемии [16]. Нами было обнаружено, что уровни экспрессии генов позитивного регулятора апоптоза bax и провоспалительного цитокина tnfa снижались, в то время как уровень экспрессии маркера нейритогенеза gap43 повышался в веществе головного мозга после введения КС-ГКП. Полученные результаты частично согласуются с ранее опубликованными работами, в которых доказана эффективность КС в моделях in vivo: при введении КС нейральных стволовых клеток крысам с ишемическим инсультом показатели неврологического дефицита и объема очага инфаркта были ниже, чем в группе контроля [17]. Внутривенное введение КС мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в модели инсульта у крыс значительно улучшало функциональное восстановление и ослабляло инфильтрацию микроглии и макрофагов в головном мозге, уменьшая экспрессию гена tnfa [18]. Кроме того, была продемонстрирована способность ней-ральных стволовых клеток в модели ОСМА оказывать противовоспалительное действие посредством секреции цитокинов и хемокинов [19, 20].
Представленные данные свидетельствуют о том, что внутриартериальное введение КС, полученной от дифференцированных в глиальном направлении ИПСК, улучшает функциональное восстановление животных после экспериментального инсульта и может влиять на пластичность мозга. Результаты исследования говорят о перспективности использования и необходимости дальнейшего изучения КС-ГКП для терапии заболеваний центральной нервной системы.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ».
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Powers W.J., Rabinstein A.A., Ackerson T. et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: 2019 update to the 2018 guidelines for the early management of acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke 2019; 50(12): 344-8.
2. Donkor E.S. Stroke in the Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke research and treatment 2018; 2018: 1-10.
3. Marei H.E., Hasan A., Rizzi R. et al. Potential of Stem Cell-Based Therapy for Ischemic Stroke. Front. Neurol. 2018; 9: 34.
4. Xu W., Zheng J., Gao L. et al. Neuroprotective Effects of Stem Cells in Ischemic Stroke. Stem cells international 2017; 2017: 1-7.
5. Abeliovich A., Doege C.A. Reprogramming therapeutics: iPS cell prospects for neurodegenerative disease. Neuron 2009; 61(3): 337-9.
6. Okano H., Yamanaka S. iPS cell technologies: significance and applications to CNS regeneration and disease. Molecular brain 2014; 7(1): 22-5
7. Poulos J. The limited application of stem cells in medicine: a review. Stem cell research & therapy 2018; 9(1): 1-6.
8. Jha M.K., Seo M., Kim J.H. et al. The secretome signature of reactive glial cells and its pathological implications. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics 2013; 1834(11): 2418-28.
9. Ruiz C., Casarejos M.J., Gomez A. et al. Protection by glia-conditioned medium in a cell model of Huntington disease. PLoS Currents 2012; 4: 20-8.
10. Салихова Д.И., Леонов Г.Е., Бухарова Т.Б. и др. Сравнительный анализ влияния кондиционированных сред, полученных от нейрональных и глиальных предшественников, на мозжечковые нейроны при глутаматной эксайтотоксичности. Гены и Клетки 2019; 14(4): 46-53. [Salikhova D.I., Leonov G.E., Bukharova T.B. et al. Comparative impact analysis of neuronal and glial progenitors conditioned medium on cerebellar neurons under glutamate excitotoxicity. Genes and Cells 2019; 14(4): 46-53].
11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54.
12. Koizumi J. Experimental studies of ischemic brain edema. 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke 1986; 8: 1-8.
13. Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S. et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20(1): 84-91.
14. Gubskiy I.L., Namestnikova D.D., Cherkashova E.A. et al. MRI Guiding of the middle cerebral artery occlusion in rats aimed to improve stroke modeling. Translational stroke research 2018; 9(4): 417-25.
15. Schaar K.L., Brenneman M.M., Savitz S.I. et al. Functional assessments in the rodent stroke model. Experimental & translational stroke medicine 2010; 2(1): 13.
16. Tuttolomondo A., Raimondo D., Sciacca R. et al. Inflammatory cytokines in acute ischemic stroke. Current pharmaceutical design 2008; 14(33): 3574-89.
17. Janssen K., Bahnassawy L., Kiefer C. et al. Generating human iPSC-derived astrocytes with chemically defined medium for in vitro disease modeling. Methods Mol. Biol. 2019; 1994: 31-9.
18. Yang H., Wang C., Chen H. et al. Neural stem cell-conditioned medium ameliorated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Stem cells international 2018; 2018: 1-7.
19. Tsai M.J., Tsai S.K., Hu B.R. et al. Recovery of neurological function of ischemic stroke by application of conditioned medium of bone marrow mesenchymal stem cells derived from normal and cerebral ischemia rats. Journal of biomedical science 2014; 21(1): 1-12.
20. Watanabe T., Nagai A., Sheikh A.M. et al. Human neural stem cell line provides neuroprotection and improves neurological performance by early intervention of neuroinflammatory system. Brain research 2016; 1631: 194-203.
