CC BY
39
DOI: 10.23868/201912031
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ КОНДИЦИОНИРОВАННЫХ СРЕД, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НЕЙРОНАЛЬНЫХ И ГЛИАЛЬНЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, НА МОЗЖЕЧКОВЫЕ НЕЙРОНЫ ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ
Д.И. Салихова1 2, Г.Е. Леонов1, Т.Б. Бухарова1, З.В. Корниенко1, Н.В. Булатенко1, А.С. Ефремова1, О.В. Махнач1, А.В. Макаров2, А.В. Ельчанинов2, Т.Х. Фатхудинов2, 3, Д.В. Гольдштейн1, 3
1 Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова, Москва, Россия
2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия
3 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
COMPARATiVE iMPACT ANALYSIS OF NEURONAL AND GLiAL PROGENITORS CONDITIONED MEDiUM ON CEREBELLAR NEURONS UNDER GLUTAMATE EXiTOTOXiCiTY
D.I. Salikhova1, 2, G.E. Leonov1, T.B. Bukharova1, Z.V. Kornienko1, N.V. Bulatenko1, A.S. Efremova1, O.V. Makhnach1, A.V. Makarov2, A.V. Elchaninov2, T.H. Fathudinov22 3, D.V. Goldshtein1, 3
1 N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center, Moscow, Russia
2 Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia
3 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russia
e-mail: diana_salikhova@bk.ru
Одной из основных причин гибели клеток при нейродегене-ративных заболеваниях является эксайтотоксичность. На сегодняшний день к потенциальным направлениям лечения ней-родегенеративных заболеваний относят клеточную терапию. Трансплантированные клетки наряду с замещением утраченных тканей оказывают паракринное действие, которое требует тщательного изучения.
Целью данного исследования стала оценка секреторной активности нейрональных и глиальных предшественников и влияния кондиционированных сред, полученных при их культивировании, на мозжечковые нейроны крыс на модели глутаматной эксайтотоксичности in vitro. В культуре мозжечковых нейронов определяли жизнеспособность клеток, экспрессию генов-маркеров апоптоза и нейритогенеза, а также количество некротических и апоптотических клеток. Был проанализирован состав изучаемых кондиционированных сред на содержание в них нейротрофинов.
В результате сравнительного анализа были выявлены различия в секреции нейротрофинов между полученными культурами: количество нейротрофического фактора мозга, фактора роста нервов, цилиарного нейротрофического фактора и гли-ального нейротрофического фактора было выше в секретоме глиальных предшественников. Было показано, что добавление кондиционированной среды от нейрональных клеток значимо не влияет на жизнеспособность нейронов мозжечка, тогда как прединкубация с кондиционированной средой от глиальных предшественников оказывает нейропротективное действие, повышая жизнеспособность мозжечковых нейронов, а при длительном культивировании способствует росту нейритов, увеличивая уровень экспрессии генов MAP2 и GAP43.
Ключевые слова: нейрональные предшественники, гли-альные предшественники, мозжечковые нейроны, глутаматная эксайтотоксичность, нейротрофины.
Введение
Многочисленные исследования в области регенеративной медицины показали, что трансплантация различных типов клеток приводит к регенерации и восстановлению функций поврежденных тканей, в том числе при поражениях головного мозга [1]. Первоначально гипотезы о механизмах клеточной терапии основывались на прямом замещении поврежденных участков трансплантированными клетками [2]. Однако, в последнее время, все большую значимость приобретает пара-кринная гипотеза: синтезируемые клетками сигнальные молекулы могут быть столь же важными компонентами регенерации, как и непосредственная интеграция самих клеток [3]. Тем не менее, в настоящее время нет достаточно полного описания секреторной активности
One of the main causes of cell death in neurodegenerative diseases is excitotoxicity. Today the potential directions of treatment neurodegenerative diseases are including cell therapy, the purpose of which is to replace lost nerve tissue with donor cells. Transplanted cells along with replaced lost tissues have a paracrine effect, which requires careful study.
The aim of this work was to study the effect of conditioned media, obtaining from neuronal and glial progenitor cells, on a primary culture of cerebellar neurons in a model of glutamate excitotoxic-ity. The cell viability, expression of marker genes for apoptosis and neuritogenesis, and the number of necrotic and apoptotic cells were determined in the culture of cerebellar neurons. The composition of the studied conditioned media was analyzed for the content of neurotrophins.
A comparative analysis was revealed differences in the secretion of neurotrophins between the obtained cultures: the amount of brain-derived neurotrophic factor, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor and glial neurotrophic factor was higher in the secretion of glial progenitors. It was shown that the addition of conditioned media from neuronal cells does not significantly affect the viability of cerebellar neurons, whereas preincubation with media from glial progenitors has a neuroprotective effect by increasing the viability of cerebellar neurons, and during long-term cultivation promotes the growth of neurites by increasing the expression level of MAP2 and GAP43 genes.
Keywords: neuronal progenitors, glial progenitors, cerebellar neurons, glutamate excitotoxicity, neurotrophins.
биологически активных молекул и механизмов их действия для большинства типов клеток.
Нейродегенеративным заболеваниям сопутствует прогрессирующая гибель нервных клеток, ведущая к различным неврологическим симптомам. В отсутствии этиологического лечения важно замедлить течение заболевания путем обеспечения протекции нервной ткани. Одной из основных причин гибели клеток при ишемическом инсульте, а также нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, является эксайтотоксичность — в результате гиперстимуляции NMDA-рецепторов усиливается ток ионов Ca2+ в клетку, что приводит к окислительному стрессу, повреждению митохондрий и в конечном итоге к клеточной гибели [4, 5]. Модель глутаматной эксайтотоксичности воспроизводит
этот процесс in vitro. Существует множество данных об эффективности применения кондиционированной среды, полученной при культивировании нейральных стволовых клеток, для терапии неврологических заболеваний, таких как ишемический инсульт [6] и спинальная травма мозга [7]. Было показано, что добавление в культуральную среду нейротрофического фактора мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и глиального ней-ротрофического фактора (GDNF) или их комбинации перед воздействием токсического агента способствует наибольшему нейропротекторному эффекту [8-11].
Целью данного исследования было изучение секреторной активности нейрональных и глиальных предшественников (НП и ГП) и влияния кондиционированных сред, полученных при их культивировании, на мозжечковые нейроны крыс в условиях глутаматной эксайтоток-сичности in vitro.
Материал и методы
Выделение мозжечковых нейронов
У 6-8-сут. крысят линии Wistar производили декапитацию в соответствии с этическими требованиями по работе с животными. Извлеченный мозжечок 2-3 раза промывали в растворе Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением 10% раствора HEPES (ПанЭко, РФ), измельчали и переносили в предварительно нагретый до 37°C 0,05% раствор трипсина с 0,02% ЭДТА (ПанЭко, РФ). После 15 мин. инкубации клеточную суспензию дважды промывали раствором Хенкса, клетки дезагрегировали до получения однородной суспензии и центрифугировали 2,5 мин. при 3000 об/ мин. Клеточный осадок ресуспендировали в соответствующем объеме культуральной среды Neurobasal Medium (Gibco, США), содержащей 2% добавки B27 (Gibco, США), 20 мМ KCl (Sigma-Aldrich, США), и переносили в лунки 12-луночных планшетов (Corning, США), предварительно покрытые поли^1_-лизином (ПанЭко, РФ) в концентрации 10 мкг/мл. В каждую лунку вносили по 2 мл клеточной суспензии, плотность посева составляла 2,5х105 кл./см2. Культуру мозжечковых нейронов инкубировали в течение 6-7 сут. (37°C, 5% СО2, относительная влажность 98%) для достижения необходимой экспрессии глутаматных рецепторов. На 2 сут. культивирования в среду добавляли 10 мкМ арабино-зинмоноцитозида (Sigma-Aldrich, США) для подавления пролиферации митотически активных клеток [12].
Получение кондиционированных сред
при культивировании нейрональных
и глиальных предшественников
В работе использовали индуцированные плюрипо-тентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из дер-мальных фибробластов человека с помощью набора для репрограммирования CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen, США). Для дифференци-ровки в нейральном направлении ИПСК культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco, США) с добавлением 1% добавки N2 (Gibco, США), 2мМ глутамина (Панэко, РФ), 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 мкМ SB431542 (Stemcell Technologies, США), 2 мкМ дорсоморфина (Stemcell Technologies, США) и 200 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich, США). Для диф-ференцировки в нейрональном направлении и получения культуры нейрональных предшественников нейральные стволовые клетки (НСК) культивировали в течение 2 недель в среде DMEM/F12 (Панэко, РФ), содержащей 2% добавки B27 (Gibco, США), 2мМ глутамина (Панэко,
РФ), 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 нг/мл FGF-2 (ProSpec, Великобритания) и 1 мкМ пурморфамина (Stemcell Technologies, США) [13, 14]. Для дифференцировки в глиальном направлении и получения культуры глиальных предшественников культивирование НСК проходило в 3 этапа, продолжительность каждого этапа 3 сут. На первом этапе к среде, содержащей стандартные компоненты: DMEM/F12, 1% добавки N2, 2мМ глутамина, 100 мг/л пенициллин-стрептомицина и 1% фетальной бычьей сыворотки (Панэко, РФ), добавляли 10 нг/мл FGF-2 и 20 нг/мл EGF (ProSpec, Великобритания). На втором этапе культивирования в среду к стандартным компонентам вносили 10 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл CNTF (PeproTech, США), на третьем этапе — 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл CNTF. [15, 16].
Для получения кондиционированных сред (КС) от нейрональных и глиальных предшественников — КС-НП и КС-ГП, клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером, инкубировали в среде DMEM/ F12 (1:1) 12 ч., полученную КС центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 5 мин., супернатант отбирали и концентрировали с помощью 3 кДа мембран Amicon Ultra (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации общего белка 500 мкг/мл.
Моделирование глутаматной эксайтотоксичности
Прединкубацию нейронов кондиционированными средами проводили, добавляя КС-НП или КС-ГП до конечной концентрации 5 мкг/мл общего белка за 1 сут. до моделирования глутаматной эксайтотоксичности. Для моделирования глутаматной эксайтотоксичности культуру мозжечковых нейронов промывали раствором DPBS без Ca2+ и Mg2+ (ПанЭко, РФ), клетки инкубировали 1 ч. в присутствии глутамата (200 мкМ) в буферном растворе следующего состава (мМ): NaCl — 140, KCl — 5, CaCl2 — 2, глицин — 10, HEPES — 20, глюкоза — 5, (рН 7,4) (Sigma-Aldrich, США), дважды промывали буфером, содержащим (мМ): NaCl — 140, KCl — 5, MgCl2 — 2, HEPES — 20, глюкоза — 5, (рН 7,4) (Sigma-Aldrich, США) и заливали исходной культуральной средой [17]. После инкубации с глутаматом получали культуры мозжечковых нейронов, обозначенные: КС-НП+Glu и КС-ГП+Glu. При длительном культивировании в течение 7 сут. КС-НП или КС-ГП добавляли каждые 48 ч. Результаты сравнивали с культурой мозжечковых нейронов, подвергшихся глутаматной эксайтотоксичности, но без внесения КС (культура Glu). Контролем являлась культура мозжечковых нейронов без добавления глутамата.
Оценка гибели нейронов
Гибель мозжечковых нейронов в культуре определяли через 24 ч. после добавления глутамата. Жизнеспособность оценивали с помощью мор-фометрического анализа и 2 колориметрических тестов: MTT ([4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолийбромид) и ЛДГ (лактатдегидрогеназа). МТТ вносили в культуральную среду до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. с последующим растворением кристаллов формазана в ДМСО (ПанЭко, РФ). Оптическую плотность измеряли при длине волны 570/620 нм на планшетном ридере (PerkinElmer, США). Результаты оценивали по отношению к контролю, который принимали за 100%. Активность фермента ЛДГ определяли с использованием коммерческого набора Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit (Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ основан на превращении лактата в пируват в присутствии ЛДГ с параллельным восстановлением
НАД до НАДН, что приводит к изменению оптической плотности при 450 нм. Уровень высвобождения ЛДГ из клеток определяли по формуле: активность ЛДГ в супернатанте/(активность ЛДГ в супернатанте + активность ЛДГ в клеточном лизате) [18].
Для морфометрической оценке гибели нейронов исследовали ядерную фрагментацию (апоптоз): прижизненное окрашивание в течение 30 мин. флуоресцентным красителем Hoechst33342 в концентрации 5 мкг/ мл и витальным красителем 0,5 мкМ Calcein-AM (процент живых клеток). Количество некротических клеток определяли с помощью 10 мин. окрашивания 1 мкг/ мл йодида пропидия (IP). С использованием люминесцентного инвертированного микроскопа Axio Observer. D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия) для каждого образца снимали по 8-10 случайным образом выбранных полей, которые подвергали морфометриче-скому анализу. Процент апоптотических и некротических клеток рассчитывали исходя из общего числа клеток в соответствующей лунке (образце). Средние значения получали из данных анализа 3-4 образцов.
ПЦРанализ
мРНК выделяли с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя, по стандартному протоколу RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, США) синтезировали кДНК. Для ПЦР в режиме реального времени использовали готовую реакционную смесь c интеркалирующим красителем Sybr Green, амплификация осуществлялась в термоциклере BioRad iQ cycler. Схема реакции: первичная денатурация 95°C, 5 мин.; денатурация 95°C, 20 сек.; отжиг праймеров 55-63°C, 20 сек.; элонгация 72°C, 20 сек. (40 циклов). Уровень мрНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации 2 генов домашнего хозяйства: GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидроге-наза) и ActB (ß-актин). Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью АС (Т) метода. С применением программы NCBI Primer-Blast были подобраны прай-меры, используемые в качестве затравок к исследуемым генам: BAX forward TTGTGGCTGGAGTCCTCACT, reverse TTTCCCCGTTCCCCATTCATC; BCL-2 forward GGGGCTAC-GAGTGGGTACT, reverse GACGGTAGCGACGAGAGAAG; MAP-2 forward AGTGTCTGCAAGGATAGTTCAAG, reverse AGGCTGATCCTTGTGTTGGG; GAP-43 forward AAGGAT-GATGCTCCCGTTGC, reverse CGGCCTTTTCCTCTGAAGGG; ActB forward GAGATTACTGCCCTGGCTCC, reverse GCT-CAGTAACAGTCCGCCTA; GAPDH forward GCGAGATCCC-GCTAACATCA, reverse CCCTTCCACGATGCCAAAGT.
Иммуноцитохимический анализ
Для иммуноцитохимического анализа культуры мозжечковых нейронов фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck KGaA, Германия) 10 мин. при комнатной температуре, пермеабилизовали 0,25% раствором Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. и обрабатывали первичными антителами к ß-III-тубулину TUBB3 (1:500); глиальному фибриллярному кислому белку GFAP (1:600); белку, ассоциированному с микротрубочками MAP2 (1 :400); кальций связывающему белку S100b (1:100); протеогликану TRA-1-81 (1:200); транскрипционному фактору Nanog (1:350); пан-цитокератину (1:600); десмину(1:900); а-фетопротеину (1:650) (Abcam, Великобритания) в течение ночи при +4°C. Далее клетки инкубировали в темноте 60 мин. с вторичными антителами, меченными флуорохром — anti-mouse Alexa Fluor 555 (1:600) или anti-rabbit Alexa
Fluor 488 (1:600) (Invitrogen, США). Ядра докрашивали 1 мкг/мл DAPI (4,6- диамино-2-фенилиндол дигидрохло-рид, Sigma-Aldrich, США) в фосфатно-солевом буфере. Изображения получали с помощью инвертированного люминесцентного микроскопа Axio Observer.D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Для исследования секреции нейротрофинов BDNF, СNTF, GDNF и NGF в кондиционированных средах от нейро-нальных и глиальных предшественников был проведен ИФА в соответствии с инструкцией производителя (Cloud-Clone corp., КНР). Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере (PerkinElmer, США) при длине волны 450 нм.
Статистический анализ
Обработку данных выполняли в программе SigmaPlot 12.5. Для анализа использовали данные 3-5 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты
Характеристика культуры мозжечковых нейронов
На 7 сут. после выделения первичной культуры мозжечковых нейронов получали смешанную нейроглиаль-ную культуру, состоящую, в основном, из нейрональных клеток. Морфологически нейроны были легко отличимы от глии (рис. 1А). Тела нейронов имели округлую форму с разветвленной сетью нейритов и окрашивались антителами к TUBB3. Глиальные клетки имели неровный контур с короткими отростками и синтезировали астро-цитарный маркер GFAP (рис. 1 Б)
Характеристика ИПСК, нейрональных
и глиальных предшественников
На протяжении двух недель после репрограмми-рования менялась морфология фибробластов, что свидетельствовало об инфицировании клеток вирусом Сендай. Через три недели после трансдукции начали образовываться колонии клеток, схожих по морфологии с колониями эмбриональных стволовых клеток человека (рис. 2А). Колонии имели ровные края и плотные контакты между клетками. Полученные линии ИПСК окрашивались на маркеры плюрипотентности Nanog и TRA-1-81 (рис. 2Б), формировали эмбриоидные тельца, при спонтанной дифференцировке образовывали три зародышевых листка — эктодерму, мезодерму, и энтодерму (рис. 2 В, Г, Д).
Нейрональные предшественники, дифференцированные из ИПСК, представляли собой клетки небольшого размера с отростком (отростками), по длине не превышающим трех диаметров тела (рис. 3А). Количество TUBB3+-клеток в культуре составляло 98±2% (рис. 3Б). Глиальные предшественники, дифференцированные из ИПСК, представляли собой отростчатые, веретенообразные или распластанные клетки размером около 20 мкм (рис. 3В). Глиальные предшественники преимущественно синтезировали астроцитарный маркер S100b: количество таких клеток в культуре составляло 97±3% (рис. 3Г).
Оценка жизнеспособности клеток
культуры мозжечковых нейронов
С помощью МТТ- и ЛДГ-тестов было установлено, что через 24 ч. после инкубации мозжечковых нейронов крысы в присутствии 200 мкМ глутамата число жизнеспособных нейронов снижалось на 51,4±4,075%, а количество некротических клеток увеличивалось на 23±2,36% по сравнению с контролем (рис. 4А, Б). Прединкубация нейронов в течение 1 сут. с КС-ГП приводила к увеличению
Рис. 1. Культуры мозжечковых нейронов: А — общий вид культуры клеток; Б — экспрессия клетками Т11ВВ3 (красный) и вРАР (зеленый). Ядра клеток докрашены йАР! (синий). А — световая микроскопия, Б — иммуноцитохимическая реакция с антителами к ТУВВ3 и вРАР. Масштабный отрезок — 100 мкм
Рис. 2. Культуры ИПСК: А — общий вид культуры ИПСК; Б — экспрессия культурой ИПСК маркеров плюрипотентности: ТЯА-1-81 (красный), №под (зеленый), ядра клеток докрашены йАР! (синий); В, Г, Д — спонтанная дифференцировка ИПСК в эмбриоидных тельцах: В — экспрессия эпителиального маркера панцитокератина (эктодерма), Г — экспрессия мезодермального маркера десмина, Д — экспрессия энтодермального маркера а-фетопротеина. Ядра клеток докрашены йАР! (синий). А — световая микроскопия, Б-Д — иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок — 100 мкм
количества жизнеспособных клеток на 26±5,01% и снижению высвобождения ЛДГ на 14,083±3,66%, что статистически достоверно отличалось от данных культуры Glu. Подобного эффекта не было обнаружено при добавлении КС-НП в той же концентрации.
Для подтверждения жизнеспособности мозжечковых нейронов исследовали экспрессию генов BAX и BCL2, являющихся негативными и позитивными регуляторами апоптоза. Спустя 1 сут. после моделирования глутаматной эксайтотоксичности уровень мРНК гена BCL2 понизился в 5 раз, а уровень мРНК гена BAX повысился в 3,5 раза
по сравнению с контролем. Прединкубация с КС-ГП снижала экспрессию гена BAX в 2,3 раза и увеличивала экспрессию гена BCL2 в 3,7 раза по сравнению с культурой Glu. Значимых различий в экспрессии генов BAX и BCL2 между культурами КС-НП+Glu и Glu обнаружено не было (рис. 5).
Количество некротических и апоптотических клеток
Воздействие глутамата приводило к увеличению количества апоптотических клеток в 3,3 раза, а некротических — в 11 раз по сравнению с контролем.
Б
Рис. 3. Культуры нейрональных и глиальных предшественников, полученных из ИПСК: А — общий вид клеток ГП; Б — экспрессия маркера глиальных предшественников Б100Ь (красный); В — общий вид клеток НП; Г — экспрессия маркера нейрональных предшественников Т11ВВ3 (красный). Ядра клеток докрашены ОАР!. А, В — световая микроскопия, Б, Г — иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок — 100 мкм
1»
А
£
Б
/
f
Рис. 4. Жизнеспособность клеток культуры мозжечковых нейронов: А — МТТ-тест; Б — ЛДГ-тест. ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; ###p<0,001 по сравнению с культурой КС-НП+Glu
Прединкубация культивируемых мозжечковых нейронов крыс с КС-ГП способствовала снижению количества апоптотических клеток в 1,5 раза и некротических — в 3,6 раза. Значимых различий в количестве некротических и апоптотических клеток между культурами КС-НП+Glu и Glu обнаружено не было (рис. 6).
Нейротрофический эффект
Степень повреждения нейритов и способность нейронов к репаративным процессам оценивали по экспрессии маркеров нейритогенеза МАР2 и 6АР43, участвующих в росте аксонов и дендритов, пластичности и регенерации. При глутаматной эксайтотоксичности
Рис. 5. Экспрессия генов ВАХ и ВС1-2. ПЦР-анализ в режиме реального времени: ***р<0,001 по сравнению
с культурой Glu; ' КС-НП+Glu
#p<0,001 по сравнению с культурой
Рис. 6. Количество апоптотических и некротических
клеток в культуре мозжечковых нейронов ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; ## ###p<0,001 по сравнению с культурой КС-НП+Glu
**p<0,01, p<0,01,
на протяжении всего эксперимента наблюдали дегенеративные процессы в нейритах. Морфологически в мозжечковых нейронах аксоны и дендриты не были выявлены (рис. 7А). В контроле, без воздействия глута-мата, наблюдали клетки с длинными отростками, которые хорошо окрашивались антителами к TUBB3 и МАР2. Уровень экспрессии генов MAP2 и GAP43 снижался в течение всего эксперимента более чем в 2 раза, различия были статистически достоверны по сравнению с контролем. Прединкубация и дальнейшее культивирование в течение 7 сут. с добавлением КС-ГП приводили к восстановлению нейритов: уровень экспрессии гена MAP2 увеличился в 2,3 раза, гена GAP43 — в 2 раза по сравнению с культурой Glu. При этом, морфологический анализ показал наличие аксонов и дендритов, положительно окрашенных антителами к TUBB3 и МАР2. Значимых различий в строении нейронов и экспрессией генов MAP2 и GAP43 между культурами КС-НП+Glu и Glu не было обнаружено (рис. 7Б, В).
Секреция нейротрофинов
По данным ИФА, наибольшая секреция нейротрофинов была обнаружена у глиальных предшественников (табл.): уровень секреции BDNF в 19 раз, NGF в 12 раз, CNTF в 18 раз и GDNF в 3 раза был выше в КС-ГП, чем в КС-НП.
Таблица. Секреция нейротрофинов
Нейротрофины НП ГП
BDNF, пг/мл 6,433±1,151 123,228±7,922
CNTF, пг/мл 10,595±3,185 185,885±14,446
GDNF, пг/мл 27,705±4,628 80,029±5,150
NGF, пг/мл 4,289±0,907 52,260±9,004
Обсуждение
В настоящей работе впервые было проведено сравнение паракринного влияния КС-ГП и КС-НП, полученных из ИПСК, в условиях глутаматной эксайтотоксичности, а также секреции ими нейротрофинов. Как оказалось, наиболее выраженным паракринным действием обладают
глиальные предшественники. КС-ГП оказывала нейропро-тективное и нейротрофическое действие на мозжечковые нейроны крыс. Внесение КС-ГП в культуральную среду увеличивало жизнеспособность нейронов, обеспечивая антинекротическое и антиапоптотическое действие, в том числе за счет активации сигнальных путей, приводящих к повышению экспрессии гена BCL2 и подавлению экспрессии гена BAX. Культивирование с КС-ГП в течение 7 сут. способствовало регенерации аксонов и дендритов, увеличению уровня экспрессии генов — маркеров нейритогенеза MAP2 и GAP43. Напротив, добавление КС-НП не влияло на жизнеспособность нейронов в культуре и не способствовало регенерации и росту нейритов при длительном культивировании. Различия могут быть обусловлены более высокой секрецией глиальными предшественниками биомолекул, обладающих нейропро-тективными и нейротрофическими свойствами. Известно, что при взаимодействии нейротрофинов BDNF, NGF, GDNF со своими рецепторами trkB, trkA, NGFR, GFRal происходит активация сигнальных путей Ras/MAPK(ERK) и PI3K/ Akt, которые запускают экспрессию генов, отвечающих за выживание нейрональных клеток [19-22].
ранее было обнаружено положительное влияние секретома (кондиционированной среды) мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (КС-ММСК) жировой ткани на нейропротекцию клеточной линии PC12 при глутаматной эксайтотоксичности. [23]. В другом исследовании на той же клеточной линии была продемонстрирована способность КС-ММСК индуцировать нейритогенез [24]. Также было выявлено нейропротек-торное действие КС-ММСК жировой ткани на мозжечковые нейроны путем регулирования энергетического обмена [25, 26]. A. Wilkins с соавт. (2009) доказали, что инкубация кортикальных нейронов с секретомом ММСК костного мозга значительно увеличивает их выживаемость путем ингибирования апоптоза. [27].
В связи с вышесказанным, возникает вопрос о выборе типа клеток как для непосредственно клеточной терапии, так и для получения КС. Способность глиальных и нейрональных предшественников к дифференцировке в зрелые нейроны и астроглию и секреции нейротрофи-ческих факторов, характерных для ранних этапов формирования ЦНС, делают эти культуры более подходящим объектом для клеточной терапии по сравнению с ММСК.
А
с
L.
й
с
I
■t о s
I 5
£ <
û.
!э
2 4J< *
К
■
jHC-m-at I ИС+П - GL )K
d
ill
1 с
Зс
I
Тс
рис. 7. Экспрессия маркеров, регулирующих процессы нейритогенеза: А -экспрессия MAP2 (зеленый) и TUBB3 (красный), 7 сут. культивирования; ядра клеток докрашены DAPI (синий). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок — 100 мкм. Б, В — экспрессия генов MAP2 и GAP43. ПЦР-анализ в режиме реального времени: *p<0,05, **p<O,0l, ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; #p<0,05 по сравнению с культурой КС-НП+Glu
Б
Добавление потенциального протектора до моделирования повреждения соответствует профилактическому лечению in vivo, которое не применимо при острых состояниях, но может быть использовано для реабилитации или терапии прогрессирующих нейро-дегенеративных заболеваний. Полученные результаты о нейропротективных и нейротрофических свойствах
ЛИТЕРАТУРА:
1. Kim S.U., Lee H.J. Human Neural Stem Cell-Based Cell-and Gene-Therapy for Neurological Diseases. Stem Cells and Cell Therapy 2014; 8: 21-48.
2. Kim S.U., De Vellis J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. Journal of neuroscience research 2009; 87(10): 2183-200.
3. Baraniak P.R., McDevitt T.C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regenerative medicine 2010; 5(1): 121-43.
4. Breton R.R., Rodriguez J.C. Excitotoxicity and oxidative stress in acute ischemic stroke. Acute ischemic stroke 2012; 200: 29-58.
5. Hynd M.R., Scott H.L., Dodd P.R. Glutamate-mediated excitotoxicity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Neurochemistry international 2004; 45(5): 583-95.
6. Yang H., Wang C., Chen H. et al. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Ameliorated Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats. Stem cells international 2018; 2018: 1-7.
7. Liang P., Liu J., Xiong J. et al. Neural stem cell-conditioned medium protects neurons and promotes propriospinal neurons relay neural circuit reconnection after spinal cord injury. Cell transplantation 2014; 23(1): 45-56.
8. Kume T., Nishikawa H., Tomioka H. et al. p75-mediated neuroprotection by NGF against glutamate cytotoxicity in cortical cultures. Brain research 2000; 852(2): 279-89.
9. Vedunova M.V., Sakharnova Т.А., Mitroshina E.V. et al. Antihypoxic and neuroprotective properties of BDNF and GDNF in vitro and in vivo under hypoxic conditions. Modern technologies in medicine 2014; 6(4): 38-44.
глиальных предшественников являются обоснованием для их дальнейшего изучения.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект № 14604210184 RFMEFI60417X0184).
10. Almeida R.D., Manadas B.J., Melo C.V. et al. Neuroprotection by BDNF against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathways. Cell death and differentiation 2005; 12(10): 1329-43.
11. Fumagalli F., Racagni G., Riva M.A. The expanding role of BDNF: a therapeutic target for Alzheimer's disease. The pharmacogenomics journal 2006; 6(1): 8-15.
12. Bilimoria P.M., Bonni A. Cultures of cerebellar granule neurons. Cold Spring Harbor Protocols 2008; 2008(12): 5107.
13. Chambers S.M., Fasano C.A., Papapetrou E.P. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 2009; 27(3): 275-80.
14. Shutova M.V., Chestkov I.V., Bogomazov A.N. et al. Generation of iPS cells from human umbilical vein endothelial cells by lentiviral transduction and their differentiation to neuronal lineage. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells 2011: 133-49.
15. Krencik R., Zhang S.C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature protocols 2011; 6(11): 1710-7.
16. Emdad L., D'Souza S.L., Kothari H.P. et al. Efficient differentiation of human embryonic and induced pluripotent stem cells into functional astrocytes. Stem cells and development 2011; 21(3): 404-10.
17. Савинкова И.Г., Горбачева Л.Р., Струкова C.M. и др. Нейропротек-торное действие при глутаматной эксайтотоксичности пептидов-аналогов
привязанного лиганда, освобождаемого активированным протеином С. Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии 2013; 30(5-6): 468. (Savinkova I.G., Gorbacheva L.R., Strukova S.M. et al. Neuroprotective effect in the case of glutamate excitotoxicity of ligand-binding analog peptides, release of protein C activated. Biological membranes: Journal of Membrane and Cell Biology 2013; 30(5-6): 468).
18. Nishihara T., Okahashi N., Ueda N. Activin A induces apoptotic cell death. Biochemical and biophysical research communications 1993; 197(2): 985-91.
19. Liu Y., Tao L., Fu X. et al. BDNF protects retinal neurons from hyperglycemia through the TrkB/ERK/MAPK pathway. Molecular medicine reports 2013; 7(6): 1773-8.
20. Anitha M., Gondha C., Sutliff R. et al. GDNF rescues hyperglycemia-induced diabetic enteric neuropathy through activation of the PI3K/Akt pathway. The Journal of clinical investigation 2006; 116(2): 344-56.
21. Kim M.S., Shutov L.P., Gnanasekaran A. et al. Nerve growth factor (NGF) regulates activity of nuclear factor of activated T-cells (NFAT) in neurons via the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-Akt-glycogen synthase kinase 3ß (GSK3ß) pathway. Journal of Biological Chemistry 2014; 289(45): 31349-60.
22. Pierchala B.A., Ahrens R.C., Paden A.J. et al. Nerve growth factor promotes the survival of sympathetic neurons through the cooperative function of the protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase pathways. Journal of Biological Chemistry 2004; 279(27): 27986-93.
23. Lu S., Lu C., Han Q. et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells protect PC12 cells from glutamate excitotoxicity induced apoptosis by upregulation of XIAP through PI3-K/Akt activation. Toxicology 2011; 279(1-3): 189-95.
24. Tan B., Luan Z., Wei X. et al. AMP-activated kinase mediates adipose stem cell-stimulated neuritogenesis of PC12 cells. Neuroscience 2011; 181: 40-7.
25. Hao P., Liang Z., Piao H. et al. Conditioned medium of human adipose-derived mesenchymal stem cells mediates protection in neurons following glutamate excitotoxicity by regulating energy metabolism and GAP-43 expression. Metabolic brain disease 2014; 29(1): 193-205.
26. Wei X., Du Z., Zhao L. et al. IFATS collection: The conditioned media of adipose stromal cells protect against hypoxia-ischemia-induced brain damage in neonatal rats. Stem cells 2009; 27(2): 478-88.
27. Wilkins A., Kemp K., Ginty M. et al. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells secrete brain-derived neurotrophic factor which promotes neuronal survival in vitro. Stem cell research 2009; 3(1): 63-70.
Поступила: 12.092019
