Возможности применения клеточной терапии при лечении ишемического инсульта в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

I I I I I I

■ I I I

Оригинальные исследования

Возможности применения клеточной терапии при лечении ишемического инсульта в эксперименте

ИБ. Соколова1, Н.Н. Зинькова1, АА. Билибина1, П.В. Кругляков1, ЕГ. Гилерович 2 ДГ. Полынцев1, В А. Отеллин 23 10ОО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург

2 ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

3 Институт физиологии им. ИЛ. Павлова РАН Россия, Санкт-Петербург

Cellular therapy potential in the treatment of ischemic stroke in experiment

I.B. Sokolova1. N.N.Zin'kova1. A.A. Bilibina1, P.V. Kruglyakov1. E.G. Gielerovich 3, D.G. Polyntsev 1. V.A. Ottelin 23

1 «Trans-Technologies» JSC [joint-stock company), Saint-Petersburg

2 Institute of Experimental Medicine, RAMS, Saint-Petersburg 31.P. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Saint-Petersburg

Изучена возможность и эффективность внутривенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток после ишемического инсульта у крыс. Показано, что данный терапевтический метод активирует пролиферацию эндогенных нейрональных стволовых клеток в субэпендимной зоне боковых желудочков мозга и ангиогенез в пограничной с повреждением области, способствует сохранению жизнеспособности нейронов в этой же зоне, уменьшает объем повреждения тканей мозга и ускоряет восстановление когнитивных функций животных.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные ство ловые клетки, ишемический инсульт, ангиогенез, нейроны.

The possibility and efficacy of intravenous transplantation of mesenchymal stem cells after ischemic stroke in rats were studied. This therapeutic method has been shown to activate the proliferation of endogenous neuronal stem cells in the subependimal area of the brain lateral ventricles and angiogenesis in the nearby area, promote the neuron vitality within the same area, decrease the extent of brain tissue damaged and hasten recovery of the cognitive functions in animals.

Key words: multipotent mesenchymal stem cells, ischemic stroke/cerebral infarction, neurons.

Введение

Ишемический инсульт - результат тяжелейшего рас стройства мозгового кровообращения в большинстве слу чаев приводит к инвалидизации и социальной дезадаптации пациентов. Это связано с тем, что головной мозг очень чув ствителен к недостатку кислорода. Понижение скорости кровотока до 10 мл/100 г в мин и ниже вызывает каскад биохимических реакций, приводящий к формированию ин фаркта мозга. Так называемое «ядро» инсульта формируется через 3-6 ч после прекращения кровотока в мозговой арте рии. «Деформирование» зоны повреждения продолжается 48-72 ч, а иногда и дольше. Лечение должно быть начато в течение 6 ч после проявления первых признаков заболева ния - в период «терапевтического окна», пока возможно со хранение жизнеспособности нейронов в зоне ишемического повреждения пенумбре. Однако на практике этого, как пра вило, не происходит. Первые часы после ишемического ин сульта уходят на доставку больного в стационар, обследова ние, постановку диагноза и т. д. В связи с этим необходимо разрабатывать новые подходы к терапии ишемического инсульта, применение которых было бы отсрочено по време ни хотя бы на несколько суток.

Клеточная терапия с помощью мультипотентных мезен химальных стволовых клеток (ММСК) - один из перспектив ных методов лечения ишемического инсульта. ММСК мультипотентные клетки, способные дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном, адипоцитарном, миоцитарном, кардиомиоцитарном, а также в нейрональном и глиальном направлениях [1 4]. Разработаны и апробированы методи ки выделения ММСК из костного мозга (КМ) человека и животных, их дальнейшего культивирования и наращивания in vitro до необходимого количества с сохранением свойств. Это позволяет использовать для клеточной терапии аутоген ный материал и, тем самым, избежать проблем с иммунной совместимостью трансплантата и реципиента. Кроме того,

ММСК влияют на течение воспалительной реакции в зоне тканевого повреждения [5] и активируют ангиогенез в по граничной с повреждением зоне [6, 7].

Цель данной работы - охарактеризовать распределение эндогенных ММСК в мозге после ишемического инсульта, дать морфологическую и поведенческую оценку воздей ствия ММСК на животного и сравнить эффективность вве дения ММСК на разных сроках после инсульта.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 3 4х месячных крысах-самцах (п = 182) инбредной линии Вистар-Киото массой 150-170 г.

Выделение ММСК. Суспензию КМ выделяли из диафи зов бедренных костей животных сразу после декапитации, промывая их средой культивирования аМЕМ (Hyclone, Но вая Зеландия) с 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США)). КМ высевали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия) и, отмыв через 48 ч после экспланта ции от форменных элементов крови с помощью раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), культи вировали ММСК в монослое при 37°С и 5% С02 в течение 6 7 сут. Для пересева культуры ММСК использовали ра створ трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток.

Фенотипирование ММСК крыс проводили методом про точной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре FACSscan (Beckton Dickinson, США). ММСК окрашивали ан тителами против негативного маркера CD45 (Beckton Dickinson, США) и антителами против позитивных маркеров CD90, CD 106, CD44 (Beckton Dickinson, США). Для этого клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, дваж ды промывали раствором PBS), на 1 ч переносили в раствор моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромом,

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 4, 2007

■ И I II II

■ I I I

Оригинальные исследования

в разведении 1:20. Затем клетки дважды промывали ра створом PBS и оценивали интенсивность свечения. Фено типирование проводили после первого, второго и третьего пересева культуры.

Для более полной характеристики полученных клеток их подвергали направленной дифференцировке in vitro в так называемых ортодоксальных (остеогенном, хондрогенном и адипоцитарном) и в нейрональном направлениях по описан ным ранее протоколам (5, 6].

Окрашивание ММСК флуорохромом РКН 26 проводи ли после третьего пересева культуры. Для этого клетки сни мали с чашек раствором трипсина и ЭДТА, дважды промы вали раствором PBS, на 4 мин помещали в раствор РКН 26 (из расчета 33 мкл на 10 млн клеток), блокировали даль нейшее окрашивание сывороткой крови эмбрионов коров (Gibco, США). Окрашенные клетки суспендировали в пита

а

циллина/стрептомицина) с финальной концентрацией 5x106 клеток в 100 мкл. Эффективность окрашивания ММСК оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия).

Экспериментальный ишемический инсульт у подопытных животных был смоделирован посредством окклюзии сред ней мозговой артерии (СМАо) (8). Крыс наркотизировали кетамином (125 мг/кг) интраперитонеально. Во время one рации и до выхода из наркоза температуру тела животных поддерживали на уровне 37°С. С левой стороны черепа от ла терального края глазницы до ушной раковины разрезали кожу, обнажая овальное отверстие (foramen ovale) тройнич ного нерва. С помощью бормашины под контролем опера ционного микроскопа это отверстие расширяли до размеров x

С помощью микроманипулятора выделяли среднюю мозговую артерию и производили ее электрокоагуляцию на протяже нии 2 3 мм. Операционную рану послойно ушивали.

Группы экспериментальных животных и проведенные на них исследования представлены в табл. 1.

В течение 6 недель после СМАо по 15 животных из групп № 1, 2 и 4 проходили поведенческое тестирование в водном лабиринте Морриса. Оценивали время, за которое живот ное было способно находить скрытую под водой платформу, основываясь на внешних ориентирах. Для водного теста использовали бассейн с жесткими пластиковыми стенками диаметром 145 см и глубиной 50 см. Тестирование начи нали через 2 и 5 нед после СМАо, каждая сессия длилась одну неделю.

Декапитация в группах № 2 и 3 была проведена через

1, 2, 3, 5 суток и через 1, 2,4 и 6 нед. после СМАо; в группе № 4 - через 1, 2, 4 и 6 нед; в группе № 1 - только через 6 нед. На всех сроках декапитации, кроме 6 нед, по 6 живот ных из каждой группы подвергали прижизненной фиксации -перфузии через левый желудочек сердца 4% раствором па раформальдегида в РВБ. Затем у них непосредственно после декапитации извлекали головной мозг и вырезали сегмент, включающий видимую зону повреждения и интактные кра евые зоны. Вырезанный блок разрезали пополам по зоне повреждения: половину блока фиксировали по стандартной методике в параформальдегиде, другую половину крио фиксировали. Перед криофиксацией образцы мозга поме щали в раствор криопротектора - сахарозы на 1 сут. Затем кусочки ткани охлаждали в парах азота в течение 10 с, по гружали в жидкий азот на 1 ч и помещали в холодильную камеру с температурой -70°С.

В связи с проведением морфометрического анализа через 6 недель фиксировали по 10 животных из каждой группы. Непосредственно после декапитации извлекали го ловной мозг и вырезали сегмент, включающий видимую зону повреждения и интактные краевые зоны. В данном случае выделенный сегмент головного мозга не делили на 2 части, а поступали следующим образом: у 6 животных его фикси ровали по стандартной методике в параформальдегиде, а у 4 криофиксировали.

Структуры мозга идентифицировали по атласу [9].

Детекцию флуоресцентно меченных ММСК в головном мозге проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (І_еіса, Германия) на гистологических срезах толщиной 7 мкм (криофиксация), изготовленных на криостатном микротоме І_еіса (І_еіса, Германия).

Объем повреждения головного мозга определяли следу ющим образом. Из блоков ткани мозга после парафиновой фиксации 6 животных из каждой группы, декапитированных через 6 нед. после СМАо, изготавливали серийные срезы толщиной 7 мкм. Площади ипсилатерального (8ИПС) и контра латерального (Бконтр) полушарий с помощью программы РИоШМ определяли на каждом 15м срезе. Объем повреж дения ткани мозга (V ) расчитывали по формуле:

V

■■ъ (S S )xL

п ь контр и пег

где £п сумма площадей повреждения мозговой ткани на п срезах; L - толщина 15 срезов, которая равна 105 мкм.

Полученные количественные данные были обработаны с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc).

Таблица 1. Группы экспериментальных животных

№ Группа Экспериментальное воздействие Морфо- логический анализ Иммуногисто- химическое исследование Морфо- метрический анализ Динамика постинсультных процессов в мозге на сроках Поведенческое тестирование

I, P, З, S дней I, P, R, б недель

I ЛО Все операционные процедуры, кроме СМАо C - - C

2 Контроль СМАо C C C C C C

З Клеточная терапия Трансплантация ММСК в день СМАо C C C C C

4 Клеточная терапия Трансплантация ММСК через 3 суток после СМАо C C C C C

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 4, 2007

I I I I I I

■ I I I

Оригинальные исследования

Иммуногистохимический анализ проводили для изучения процесса пролиферации клеток в субэпендимной зоне боко вых желудочков головного мозга; развития глиоза в зоне по вреждения мозговой ткани; жизнеспособности нейронов в пограничной с повреждением области; активации ангиоге неза в ткани мозга. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных антител к Ki67 (ядерный маркер пролиферации), ГФКБ (глиальный фибрил лярный кислый белок маркерный белок астроцитов клеток), NeuN (маркерный белок ядер нейронов), vWF (фактор фон Виллебрандта, выявляющийся в эндотелиальных клетках).

Для проведения реакции срезы головного мозга депа рафинизировали в трех порциях орто ксилола, затем регид ратировали в спиртах понижающейся концентрации по стан дартной методике. Промывали в дистиллированной воде и переносили в 3% перекись водорода для блокировки эндо генной пероксидазы. Срезы промывали в PBS и наносили на них первичные антитела. После инкубации во влажных камерах двукратно промывали в PBS. Дальнейшую обработ ку производили при помощи наборов LSAB2/HRP rat (Dako, Дания) или Envision+ System HRP (Dako, Дания). При исполь зовании набора LSAB2/HRP rat после инкубации с вторич ными антителами из набора и двукратной промывки PBS наносили конъюгат стрептавидина и пероксидазы из того же набора. Инкубировали во влажных камерах при комнатной температуре. При использовании Envision+ после инкубации с первичными антителами и двукратной промывки PBS на носили раствор из набора. Инкубировали во влажных каме рах при комнатной температуре.

Затем (при использовании любого набора) после дву кратной промывки наносили рабочий раствор хромогена DAB (из набора DAB+, Dako, Дания). Образование окрашен ного продукта реакции контролировали под микроскопом. Препараты докрашивали астровым синим, толуидиновым синим или гематоксилином, дегидратацию и заключение в пермаунт проводили по стандартной методике.

При проведении реакции с антителами к Ki67 и vWF пе ред нанесением первичных антител проводили процедуру теплового демаскирования антигена. Для этого срезы по мещали в раствор для демаскирования антигенов (Dako, Дания) и инкубировали на водяной бане при температуре +95°С в течение 20 мин. Затем срезы промывали PBS и про водили все вышеописанные процедуры. При проведении реакции с антителами к ГФКБ перед инкубацией с первич ными антителами дополнительно проводили блокировку неспе цифического окрашивания в 12% сыворотке крови свиней (Dako, Дания) в течение 20 мин при комнатной температу ре. Затем проводили все вышеописанные процедуры. Для каждого антитела проводили положительный и отрицатель ный контроль окрашивания (табл. 2).

Количество сосудов подсчитывали на препаратах, окра шенных по методу vWF, в левом полушарии в неокортексе (первичная соматосенсорная кора) и головке хвостатого ядра по границе повреждения ткани в пределах 30 мкм под микроскопом Leica (Leica, Германия) через 6 нед. после СМАо. В правом полушарии сосуды были подсчитаны в сим метричной области. Полученные количественные данные были обработаны с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc).

Результаты

Анализ культуры ММСК методом проточной цитофлуори метрии показал, что она состояла из CD 45^ клеток (клеток гемопоэтического ряда) - 3% и CD90^ клеток (собственно ММСК) - 97%, среди которых было 15% CD 106^ клеток (рис. 1). Полученные клетки были способны дифференци роваться в остеогенном, адипоцитарном, хондрогенном на правлениях и в направлении нейронального ряда. В наших экспериментах в нейрональном направлении дифференци ровалось около 70% ММСК (6).

Трансплантация ММСК животным после СМАо повыси ла уровень выживаемости (табл. 3) примерно в 1,7 раза.

Таблица 2. Условия проведения иммуногистохимических реакций

о

ф

I-

S

I-

X

С

.о

£

I-

S

4

о

со

п

5

о

а

ф

S

X

ф

ч

ф

ей

п

га

о_

о

ей

о

= Si

* га ф ей s о х а % s Ф о ей га

2 2 ^ ф

с ч

к

S

X

га

ей

її ей tr

* S g s

£ а і і 1 £ * Ч з-

ей ^ ^ ф С X

S

5

га

ц

ф

Н

ю s

І? 1

X _п

5 X

і *

І * I С

> О

S

2

ГО

ф

I-

S

S I-

S3

и

И

зі

8 Ё

£ 8

га

х

S

4

5

ей

га

I-

s

S

ф

= Э-

а;

И

* I!

М

Iі

> О

_0

п

га

Ч

s

£

о

ф

S

S

'

га

ю

£

к -2 s Ф

Я > 2 с |Ш

> о

.й

§

I-

х

о

*

>5

.о

х

.о

5

I-

S

S

§

.0

§

I-

X

S

>5

х

5

(5

'

S

5

КІ67 BD Pharmingen 1:1OO Да Нет 18 ч, +4"С 20 мин, комнатная t 30 мин, комнатная t - Тонкий кишечник крысы Миокард крысы

ГФКБ Dako, Дания Готовые к использованию, не разведенные Нет Да 18 ч, +4"С 30 мин, комнатная t 30 мин, комнатная t Мозжечок крысы Миокард крысы

NeuN Chemicon IxeOO Нет Нет 18 ч, +4"С 30 мин, комнатная t 30 мин, комнатная t Спинной мозг крысы Миокард крысы

vWF Dako, Дания 1:5O Да Нет 30 мин, комнатная t ЗO мин, комнатная t

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, N а 4, 2007

■■■ І І І І І І

■ І І І

Рис. 1. Распределение интенсивности свечения клеток, выделенных из костного мозга крыс, меченных антителами против негативного [СП45, а) и позитивных [0090, б; СОЮБ, в) маркеров ММСК, полученное методом проточной цитометрии на 2-м пассаже после выделения. По горизонтали - интенсивность свечения клеток, экспрессирующих С090 [а] или СП45 [б], окрашенных антителами, конъюгированными с РЕ и ЯТС соответственно; по вертикали - число клеток. Пик 1 - неокрашенные клетки [контроль], пик 2 -окрашенные клетки: а - 3 % клеток экспрессируют СП45 и относятся к гемопоэтическому ряду; б - 97 % клеток популяции экспрессируют С090 и являются ММСК; в - 15% клеток популяции экспрессируют С010Б; пунктирная линия - неокрашенные клетки

Таблица 3. Количество погибших в ходе исследования животных в разных группах

Г руппа Количество животных Погибло в течение 6 недель СМАо Общая смертность, % Количество животных, включенных в обработку

Ложнооперированные 10 0 0 10

Контроль 20 10 S0 10

Группа клеточной терапии S 30 10

Поведенческое тестирование. Результаты тестирования в водном лабиринте Морриса представлены на рис. 2 а, б. Видно, что когнитивная функция восстанавливалась прак тически до исходного уровня через 2 нед. после СМАо при условии, что была проведена трансплантация ММСК (груп па № 3). При этом у контрольных животных (группа № 2) в течение всего периода наблюдения (6 нед.) поведенческий статус не восстановился.

Распределение ММСК в головном мозге. Исследования криосрезов мозга животных из групп клеточной терапии с по мощью флуоресцентного микроскопа показало, что меченые ММСК, трансплантированные внутривенно в день СМАо (группа № 3), появлялись в мозге на 3 сут. Они распределя лись вокруг сосудов в обоих полушариях. В контралатераль ном полушарии были выявлены единичные меченые клетки, в ипсилатеральном - практически вокруг всех сосудов. Та кое распределение ММСК сохранялось в течение 6 нед. (рис. 3

а, б). При внутривенной трансплантации через 3 сут. (группа № 4) меченые ММСК были выявлены в мозге также через 3 сут после введения. Единичные ММСК находили в субэпен димной зоне боковых желудочков и только у нескольких жи вотных в хвостатом ядре. Через 6 нед. мы видели меченые клетки только вокруг желудочков мозга (рис. 3 в, г).

Морфологический анализ мозга. Динамику постинсуль тных процессов в мозге через 1, 2, 3, 5 сут после СМАо изучали только у контрольных животных (группа № 2) и жи вотных, которым ММСК были введены в день СМАо (группа № 3). На 1 е, 2 е и 3 и сут. после СМАо в головном мозге животных всех групп формировался некротический очаг. В пограничной с повреждением области вокруг сосудов по явились скопления клеточных элементов периваскуляр ные муфты, состоящие из лимфоцитов, плазматических клеток и иногда эозинофилов. В группе № 3, по сравнению с контролем, периваскулярные муфты были больше по объему, клетки в них расположены в несколько рядов.

ЕЛО

■к

г ММСК

Рис. 2. Результаты поведенческого тестирования животных в водном лабиринте Морриса через 2 [а] и 5 [б] недель после СМАо:

ПО - ложнооперированные животные; К - группа 2 [без введения ММСК);

ММСК - группа 3 [введение МСК в день СМАо).

По горизонтальной оси отмечены дни тестирования, по вертикальной - время, затраченное на поиск скрытой платформы

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

■ И I II II

■тп

Оригинальные исследования

б

Рис. 3, Распределение флуоресцентно меченных ММСК [стрелки) в поврежденном головном мозге животных через Б недель после СМАо, криосрезы, окраска ДНК ОАРІ: а - флуоресцентно меченные ММСК вблизи сосуда в хвостатом ядре поврежденного полушария через 3 суток после СМАо; группа 3. Об. 40к,

б - флуоресцентно меченные ММСК в боковом желудочке поврежденного полушария через 6 недель после СМАо; к

в, г - флуоресцентно меченные ММСК вблизи сосуда в хвостатом ядре поврежденного полушария через

к

Через 5 сут. после СМАо у контрольных животных на грани це некротического очага был выявлен хорошо выраженный лейкоцитарный вал. Распада ткани в центре повреждения еще не наблюдали. В группе № 3 процесс распада и очищения ткани мозга от поврежденных фрагментов проходил заметно быстрее, чем в контроле. В неповрежденной области мозга наблюдали активацию астроцитов (рис. 4 б).

На сроке 1 нед после СМАо мы включили в исследование животных, которым ММСК были введены через 3 сут. после СМАо (группа № 4). Через 1 нед. у животных из группы № 2 в очаге некроза выявили большое количество макрофагов и распадающиеся клетки. Активированных астроцитов в пенумбре еще нет (рис. 4 а). Особого рассмотрения требует состояние клеток субэпендимной зоны бокового желудоч ка ипсилатерального полушария. С помощью иммуногисто химической реакции с антителами к белку Ю67, выявляю щей пролиферирующие клетки, в субэпендимной зоне желудочков были обнаружены редкие иммунопозитивные клетки (рис. 5 а).

Морфологическая картина постинсультных процессов в ткани мозга в группах клеточной терапии № 3 и № 4 че рез 1, 2, 4 и 6 нед. после СМАо практически одинакова. Через 1 нед. в субэпендимной зоне наблюдали митотически делящиеся клетки. Иммуногистохимическое окрашивание тканей мозга антителами к К67 показало, что при инсуль тах в данной области появлялась группа пролиферирующих клеток (рис. 5 б, в). Через 2 нед. в контрольной группе выявле на четкая демаркационная линия между тканевым дефектом и неповрежденной тканью. В пенумбре наблюдали клеточ ную инфильтрацию и гибнущие нейроны. Очищение ткани мозга от поврежденных фрагментов еще продолжается. У животных из групп № 3 и № 4 между поврежденной и не поврежденной тканью наблюдали рубец, состоящий из 1 -3 рядов глиальных клеток, расположенный между тканевым дефектом и пограничной зоной. Процесс очищения тканей мозга от погибших клеток уже полностью завершен. Через

4 нед. в ипсилатеральном полушарии контрольных животных наблюдали расширение желудочка. Большая часть неокор текса отсутствовала - на данном участке сформировалась ликворная киста.

Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга крысы через 5 суток после СМАо антителами против маркерного белка реактивной астроглии ГФКБ: а - группа 2 [контроль); б - группа 3 [введение ММСК в день СМАо)

к

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

І І І І І

■ І І І

Глиальный рубец между поврежденной и неповрежден ной тканью имеет четко выраженную структуру. У животных из групп № 3 и № 4 в пределах неокортекса граница между поврежденной и неповрежденной тканью выражена четко, рубец структурирован. Большая часть нейронов в сохранив шейся коре мозга не повреждена. При обширных дефектах ткани мозга (большая часть коры полушария, хвостатого ядра и наружная капсула) у животных, как и в контрольной группе, развивалось постинсультное осложнение расши рение желудочков. Через 6 нед. у животных с первоначально обширным инсультом выявлены значительные поврежде ния ткани мозга, коснувшиеся первичной и вторичной со матосенсорной, пириформной и инсулярной коры. На месте дефекта сформировалась ликворная киста с эпендимной вы стилкой, полость которой очень обширна (рис. 6 а). Большин ство нейронов в пограничной зоне повреждено: при окраске тионином по Нисслю ядро и цитоплазма не определялись,

иммуногистохимическая реакция на №Ы не давала харак терного для ядер нейронов продукта окрашивания (рис. 7 а). Иммуногистохимическая реакция на ГФКБ выявила мощ ный глиоз в пенумбре, неокортексе и, частично, в хвостатом ядре (рис. 8 а). В мозге опытных животных из группы № 3 не наблюдали единой большой полости на месте дефекта ткани. Вместо нее были выявлены мелкие полости разной величи ны, перемежавшиеся с клеточными островками, состоящи ми из капилляров (рис. 6 б). В группе № 4 была выявлена киста в виде единой полости (рис. 6 в). Большинство нейро нов в пограничной с зоне не повреждены (рис. 7 б, в). Имму ногистохимическое окрашивание ткани мозга антителами к ГФКБ показало, что астроциты в наружной капсуле ак тивизировались и формировали капсулу, которая, по всей видимости, препятствовала расширению желудочков и распространению гибели нервной ткани и не деформиро вала мозг (рис. 8 б, в).

Рис. 5. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга крысы через 1 неделю после СМАо антителами против маркерного белка делящихся клеток КІБ7: а - группа 2 [контроль); б - группа 3 [введение МСК в день СМАо) в - группа 4 [введение МСК через трое суток после СМАо).

Продукт реакции - коричневого цвета, отмечен стрелками; звездочкой отмечена полость бокового желудочка.

к

Рис. 6. Структура области ишемического повреждения головного мозга крысы через 6 недель после СМАо: ликворно-глиальные кисты [обозначены стрелками): а - группа 2 [контроль); б - группа 3 [введение МСК в день СМАо); в - группа 4 [введение МСК через трое суток после СМАо).

к

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 4, 2007

I I I I I

■ I I I

’! ЩШ 'Ш; * Й ф & -Д , * -о,» и .

'7' '' і' *** ї* ■ * ■*-. 1 v еШШ ЩЖтШ V К А ■ ■ *т. і ■ r-J 'V ...■ Йіі ■ МЙЯ' ■

Рис. 7. Структура области ишемического повреждения головного мозга крысы через 6 недель после СМАо: пенумбра в группе 2 [а, г), группе 3 [б, д] и группе 4 [в, е): а, б, в - окраска по Нисслю. Об. 100х;

г, д, е - иммуногистохимическое окрашивание антителами против маркерного белка нейронов ЫеиЫ.

Коричневый цвет - продукт реакции. Стрелками отмечены поврежденные нейроны. Докраска по Нисслю. Об. 20х

щ ■Щ ТіцДірі "‘'W ъ . > fV\. ‘ • 1 -і --■■■' -1 > ■ ■ ЖЖт “і- ь

Рис. 8. Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга крысы через 6 недель после СМАо антителами против маркерного белка реактивной астроглии ГФКБ. Продукт реакции - коричневого цвета, отмечен стрелками.

Докраска астровым синим. Об. 20х

Морфометрический анализ. Количество сосудов у жи вотных из групп № 2, 3 и 4 представлено на рис. 9. Объем повреждения ткани мозга у животных из групп № 2, 3, 4 представлен на рис. 10.

Обсуждение

В качестве материала для клеточной терапии ММСК очень перспективны, т. к. для каждого пациента могут быть выделены аутогенные клетки с заданной чистотой популя ции, имеющие четко охарактеризованные жизнеспособ ность, фенотип и дифференцировочный потенциал.

Так, именно по фенотипу: CD 45, CD 90, CD 106^ и по способности дифференцироваться in vitro в остеогенном,

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

хондрогенном, адипоцитарном и нейрональном направле ниях мы делаем вывод, что работаем именно с ММСК. При этом чистота клеточного материала не менее 97% МСК, а жизнеспособность самих клеток (определенная посред ством окраски in vitro трипановым синим) не ниже 95%.

Внутривенное введение выбрано как наиболее щадящий способ трансплантации ММСК. К настоящему времени по казано, что ММСК, как клетки с высоким уровнем экспрес сии CXCR4 - рецептора к SDF 1 (stromal cell derived factor), обладают тропностью к зонам тканевого повреждения, где повышается содержание SDF 1 (10). В настоящей работе ММСК, введенные в хвостовую вену в день СМАо или через

3 сут. после СМАо, были выявлены в мозге на 3 сут. после

А

■ И I II II

■тп

Оригинальные исследования

трансплантации. Как известно СМАо нарушает целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Казалось бы, с то ком крови ММСК, трансплантированные в день СМАо, дол жны попасть в мозг непосредственно после введения. Но этого не происходит ни в 1 е, ни во 2 е сут. после транс плантации. В своих предыдущих работах (5) мы показали, что и при инфаркте миокарда ММСК, введенные в вену в день опе рации, появлялись в тканях сердца в единичном количестве на 2 е сут., а массово - на 3 и. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что ММСК не просто пассивно разносятся по организму током крови, а осуществляют направленную миграцию в области тканевого воспаления. К сожалению, в настоящее время этот вопрос до конца не изучен. Разницу в количестве меченых клеток и их распределении в ткани моз га у животных группы № 3 и группы № 4 мы объясняем тем, что ММСК, введенные в день СМАо, успевают пройти в го ловной мозг до восстановления целостности ГЭБ, а через 4-6 сут. после СМАо (когда в организме происходит мигра ция ММСК, трансплантированных внутривенно через 3 сут. после СМАо) его целостность практически восстановлена (11). Мы не располагаем данными о том, что ММСК могут проходить ГЭБ.

зо

25

20

15

10

1 о

£Q <sj-

О X

5 s

о ро с о ск о 5

“ і

О п

О

1

в ЛКонтроль

, 1 JMMCK3

Рис. 9. Количество сосудов в пограничной с повреждением зоне через Б недель после СМАо: контроль - группа 2 [без введения ММСК);

ММСК1 - группа 3 [введение ММСК в день СМАо); ММСКЗ- группа 4 [введение ММСК через трое суток после СМАо)

Рис. 10. Объем дефекта головного мозга через 6 недель после СМАо.

контроль - группа 2 [без введения ММСК);

ММСК1 - группа 3 [введение ММСК в день СМАо); ММСКЗ- группа 4 [введение ММСК через трое суток после СМАо)

Однако, несмотря на такую значительную разницу в рас пределении ММСК, результаты морфологического анализа ткани мозга после СМАо у животных из групп № 3 и 4 практи чески одинаковы. Трансплантация ММСК в день СМАо при вела к более раннему формированию глиального рубца меж ду поврежденной и неповрежденной тканью мозга (на 5 е сут. в группе клеточной терапии и 7 е сут. - в группе конт роля). Известно, что глиальный рубец препятствует прорас танию аксонов. Кроме того, его формирование способствует стабилизации ткани мозга после инсульта: митотически де лящиеся астроциты окружают поврежденную зону и ново образованные сосуды, способствуя восстановлению ГЭБ, предупреждая сильную воспалительную реакцию, начало аутоиммунной реакции и ограничивая клеточную дегенера цию [12]. Через 6 нед. после СМАо в группах клеточной те рапии сформировался глиальный рубец, площадь которого была существенно меньше, чем в контроле. В контрольной группе мощный глиоз затрагивал пенумбру, неокортекс и хвостатое ядро. В группах клеточной терапии глиоз не де формировал ткань и локализовался преимущественно в пограничной с повреждением зоне.

Через 1 нед. у животных из групп № 2, 3, и 4 была выяв лена пролиферация клеток в субэпендимной зоне желудоч ков головного мозга. Однако после трансплантации ММСК мы обнаружили значительное количество делящихся клеток, особенно в группе № 4, а у животных контрольной группы единичные пролиферирующие клетки. Ранее было показано, что СМАо вызывает деление клеток субэпендимной зоны желудочков мозга у крыс (13-15). Более того, была пока зана возможность миграции вновь образованных клеток из эпендимной зоны к области повреждения. Эти клетки окра шивались антителами против нейрональных маркеров, что свидетельствовало об их дифференцировке в нейрональном направлении. Вероятно, данный процесс можно расценивать как ограниченную репарацию нервной ткани.

Трансплантация ММСК как в день СМАо, так и через 3 сут. после инсульта значительно ускорила течение воспали тельной реакции: в группах клеточной терапии воспаление закончилось через 2 нед, в контрольной через 4 нед. Как показано ранее, ММСК in vitro способны секретировать на бор факторов, стимулирующих (IL 1, TNF - tumor necrosis factor), регулирующих (IL 11) и ингибирующих (bTGF -transforming growth factor) воспалительные процессы (16, 17). Мы предполагаем, что и in vivo ММСК принимают учас тие в регуляции процессов воспаления посредством выде ления вышеназванных агентов (паракринная функция).

В обеих группах клеточной терапии зафиксирована ак тивация ангиогенеза в пенумбре. Количество сосудов в ана лизируемой области головного мозга в группе № 3 было больше в 1,4 раза, а в группе № 4 в 1,8 раза по сравнению с контролем. Активация ангиогенеза способствует восста новлению микроциркуляции, а, следовательно, и метаболиз ма в ишемизированной ткани мозга до физиологического уровня. Вероятно, это одна из причин сохранения жизнеспо собности нейронов в пограничной с повреждением зоне.

Кроме того, мы предполагаем, что трансплантированные ММСК (независимо от времени трансплантации) оказыва ли нейропротекторное действие на нервную ткань. Мы пола гаем, что и в этом случае реализуется паракринная функция ММСК. Показано, что после добавления в клеточную куль туру экстракта тканей поврежденного мозга ММСК проду цировали такие факторы, как VEGF (vascular endothelial growth factor), BDNF (brain - derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor) и bFGF (basic fibroblast growth factor) (18, 19), которые предотвращают апоптоз клеток в ткани, пограничной с областью некроза и активируют ангиогенез [7, 20). Действительно, в группах клеточной терапии практически

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

■ ИМИ!

Оригинальные исследования

все нейроны в пограничной с повреждением зоне не име ли морфологических изменений, тогда как в контрольной группе мы выявляли только поврежденные или погибшие не рвные клетки. Окраска ядер этих клеток антителами №иЫ показала, что в группах клеточной терапии жизнеспособ ные нейроны находились непосредственно рядом с границей повреждения.

Мы предполагаем, что вследствие активации ангиогене за и сохранения жизнеспособности нейронов в пограничной с повреждением зоне внутривенная трансплантация ММСК независимо от сроков введения способствовала уменьше нию объема повреждения мозга: в группе № 3 в 1,6 раза, а в группе № 4 в 1,3 раза по сравнению с контролем (р < 0,05).

Положительный эффект клеточной терапии был выяв лен не только на морфологическом уровне в мозге, но и при проведении поведенческого тестирования животных в вод ном лабиринте Морриса. Животные контрольной группы затрачивали в несколько раз больше времени на поиск платформы как во время первого испытания, начатого че рез 2 нед после СМАо, так и во время второго испытания, на чатого через 5 нед после СМАо по сравнению с ложноопери рованными животными и крысами из группы клеточной терапии № 4. Животные из группы клеточной терапии уже к

5 му дню первой сессии обучения вырабатывали оптималь ную стратегию поиска платформы - время выходит на плато -и успешно использовали ее после двухнедельного перерыва. Эти животные затрачивали столько же времени на поиск платформы, сколько и ложнооперированные. Животные же контрольной группы практически не достигали критерия обу ченности за 6 нед. Тест в водном лабиринте Морриса свиде тельствует о том, что ишемический инсульт у крыс приводит к существенному нарушению когнитивных функций у живот ных: они не утрачивают способность к обучению, но за 6 нед. не могут выработать оптимальную тактику поведения во

время тестирования. Применение клеточной терапии позво лило восстановить обучаемость, краткосрочную и долговре менную память животных до уровеня ложнооперированных крыс уже к концу 3 нед. после СМАо.

Все изложенные данные свидетельствуют, что в наших экспериментах клеточная терапия ишемического инсульта у крыс с помощью ММСК дает положительные результаты.

1. На 17% повышается постоперационная выживаемость животных.

2. Трансплантация ММСК значительно стимулировала ангиогенез в ткани, пограничной с повреждением, тем са мым, способствуя восстановлению метаболизма в ишеми зированной области мозга.

3. Введение ММСК имело ярко выраженное нейропро текторное воздействие - сохранение жизнеспособности нейронов по всему объему пограничной зоны. На достиже ние подобного терапевтического эффекта направлены все нейропротекторные лекарственные препараты, применяю щиеся в настоящее время при лечении инсульта.

4. Уменьшается объем тканевого дефекта мозговой тка ни и целые мозговые структуры, например хвостатое ядро, сохраняют свое морфологическое строение.

5. Внутривенная трансплантация ММСК привела к со хранению когнитивных функций животных на нормальном физиологическом уровне.

6. На наш взгляд, очень важный момент, имеющий от ношение к практической медицине: внутривенная транс плантация ММСК инсультным животным может быть отсро чена на несколько дней. При этом полученный результат бывает не хуже, чем при трансплантации ММСК во время «терапевтического окна». Мы полагаем, что представлен ную работу можно расценивать как доклиническое иссле дование. На ее основе можно разработать рекомендации для проведения ограниченного клинического исследования.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ferrari G., Cusella De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow derived myogenic progenitors. Science 1998; 279: 1528 30.

2. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143 7.

3. Fukuda K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchumal stem cells for cardiovascular tissue engineering. Artif. Organs 2001; 25: 187 93.

4. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J.et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J. Neurosci. Res. 2000; 61: 364 70.

5. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева Х.К. и др. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток. Цитология 2004; 46: 1043 54.

6. Зинькова Н. НГилерович Е. Г., Соколова И.Б. и др. Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток. Цитология 2007; 7: 566 75.

7. Chen J., Zhang G. Z., Li Y. et al. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ. Res. 2003; 92: 692 9.

8. Brint S., Jacewicz М., Kiessling M. et al. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1988; 8: 474 85.

9. Paxinos G., Watson Ch. The rat brain in stereotaxic coordinates. New York: Academic Press; 1998.

10. Bhakta S., Hong P., Кос 0. The surface adhesion molecule CXCR4 stimulates mesenchymal stem cell migration to stromal cellderived factor 1 in

vitro but does not decrease apoptosis under serum deprivation. Cardiovasc. Revasc. Med. 2006; 7: 19 24.

11. Гилерович Е.Г., Отеллин B.A. Tрансплантация эмбриональной нервной ткани как модель изучения ранних этапов становления центральной нервной системы. Успехи физиологич. наук 2001; 1: 38 47.

12. Silver J., Miller J. Regeneration beyond the glial scar. Nature reviews neuroscience 2004; 5: 146 56.

13. Arvidsson A., Collin T., Kirik D. et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nature medicine 2002; 8: 963 70.

14. Darsalia V., Heldmann U., Lindvall 0. et al. Stroke induced neurogenesis in aged brain. Stroke 2005; 36: 1790 5.

15. Thored P., Arvidsson A., Cacci E. et al. Persistent production of neurons from adult brain stem cells during recovery after stroke. Stem cells 2006; 24: 739 47.

16. Majumdar М., Thiede М., Mosca J. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J. Cell Physiol. 1998; 176: 57 66.

17. Deans R., Moseley A. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp. Hematol. 2000; 28: 875 84.

1 8. ChenX., Li Yi, Wang L., etal. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology 2002; 22: 275 9.

19. Li Yi., Chen J., Chen X.J. et al. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat. Neurology 2002; 59: 514 23.

20. Chen J., Li Yi, Wang L., et al. Combination therapy of stroke in rats with a nitric oxide donor and human bon marrow stromal cells enhances angiogenesis and neurogenesis. Brain Res. 2004; 1005: 21 28.

Поступила 06AO,2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007