CC BY
159
УДК 547
Р. Р. Хабибуллин, А. В. Федосов
Теоретические и практические аспекты процесса люминол-зависимой хемилюминесценции в живых организмах
Уфимская государственная академия экономики и сервиса г. Уфа, ул. Чернышевского 145; тел.: 60-83-70
Рассматривается эффективность инициирования свободно-радикальных реакций путем добавления люминола и ионов двухвалентного железа, с последующим анализом индуцированной хемилюминесценции. Установлено, что величина пика хемилюминесценции зависит от фагоцитарной активности клеток. Опсонизиру-ющая способность крови определяется временем достижения максимума хемилюминесцен-ции и ее амплитудой.
Ключевые слова: свечение, хемилюминесцен-ция, свободно-радикальная реакция, люминол, ионы двухвалентного железа, свободные радикалы, экспресс-метод.
Сверхслабое свечение живых организмов, органов, тканей, клеток, субклеточных структур, биологических жидкостей и субстратов — это разновидность широко распространенного в природе явления — биохемилюминесценции 1 2. Обычно различают видимую глазом физиологическую биолюминесценцию, а также сверхслабые по своей интенсивности излучения, которые могут быть зарегистрированы только с помощью высокочувствительных детекторов 1-3. Поэтому наиболее успешно световые процессы в живых организмах стали изучаться после создания чувствительных детекторов излучения — фотоэлектронных умножителей.
Исследования, проведенные с их помощью, показали, что все клетки, внутриклеточные структуры, кровь, постоянно испускают слабые световые потоки в видимой области спектра (360—800 нм) 1 2' 4. Обнаруженное свечение отличалось от митогенетического не только спектральными характеристиками, но и биологическим действием: оно не оказывало влияние на клеточное деление. Интенсивность этого излучения зависела от уровня обменных процессов, увеличивалась с повышением температуры, парциального давления кислорода, поэтому явление получило название спонтанного метаболического свечения.
Начиная с открытия сверхслабого свечения клеток и тканей, данный процесс стал
Дата поступления 27.03.06
предметом многочисленных исследований, цель которых заключалась в изучении природы и выявления причин изменения интенсивности излучения при различных состояниях 5 6.
Совокупность имеющихся в настоящее время сведений позволяет считать, что сверхслабое свечение биологических структур, скорее всего, возникает в результате ферментативных и неферментативных окислительных реакций, протекающих с образованием свободных радикалов органического и неорганического происхождения. Образование и рекомбинация радикалов сопровождаются хемилюми-несценцией 5.
Интенсивность свечения обычно пропорциональна скорости рекомбинации свободных радикалов 7' 8. Однако, исследуя лишь показатель интенсивности спонтанного излучения, невозможно судить о причинах, вызвавших изменение скорости свободно-радикального окисления. Для решения этой задачи прибегают к искусственному инициированию свободно-радикальных реакций различными физическими или химическими воздействиями, в частности, путем добавления люминола и ионов двухвалентного железа, с последующим анализом индуцированной хемилюминесценции 6' 8' 9.
Люминол (5-амино-2,3-дегидро-4-фтала-зиндион) в присутствии активных форм кислорода окисляется и дает электронвозбужденные карбонильные хромофоры с высоким квантовым выходом. Они резко повышают интенсивность свечения, связанного с образованием активных форм кислорода. Это явление в последнее время начинает широко и успешно использоваться для изучения функционального состояния фагоцитарного звена иммунитета. Появление и взаимодействие чужеродного материала с фагоцитирующей клеткой запускает сложный каскад физиологических и метаболических процессов.Появление активных форм кислорода обычно начинается через 1—2 мин после воздействия чужеродного материала на мембраны фагоцитов, достигает своего максимума за 5—6 мин и длится в течение
106
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. №2
20—30 мин. Этот процесс сопровождается свечением, интенсивность которого резко увеличивается в присутствии люминола.
На рис. представлена такая запись хемилюминесценции крови при различных состояниях. Она характеризуется латентным периодом, крутизной нарастания и временем достижения максимума свечения, величиной максимальной интенсивности и светосуммой хемилюминесценции, которую измеряют в течение условленного времени. Перечисленные показатели зависят от количества фагоцитирующих клеток, их активности, характера чужеродного материала, механизма его взаимодействия с фагоцитом, наличия в среде инкубации опсонизирующего фактора, состава среды, ее температуры и т. д. Установлено, что величина пика хемилюминесценции зависит от фагоцитарной активности клеток. Опсонизи-рующая способность крови определяется временем достижения максимума хемилюминес-ценции и ее амплитудой.
Рис. Запись хемилюминесценции гепаринизирован-ной крови: А — здорового человека, Б — при сенсибилизации, В — при иммунодефицитных состояниях. Условия измерения: кровь 0.1 мл, разведенная в 2 мл физиологического раствора (рН 7.2 ед.), люминол 0.1 мл 10-5 М. Температура среды 37 оС. Н — максимальная амплитуда свечения; а — крутизна нарастания свечения; t — время достижения максимума; 8 — светосумма свечения. Стрелками обозначены начало и конец измерения.
Светосумма свечения за время измерения является интегральным показателен генерации активных форм кислорода, а крутизна нарастания свечения отражает скорость активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов. Интенсивность хемилюминесценции коррели-
рует с потреблением клетками кислорода и степенью завершенности фагоцитоза. Объектом исследования фагоцитарного звена иммунитета хемилюминесцентныни методами может служить гепаринизированная кровь из расчета 50 ЕД гепарина на 1 мл крови (на анализ требуется всего 0.1-0.01 мл, а также любая другая биологическая жидкость или суспензия выделенных клеток, содержащая 105 фагоцитов в исследуемом образце.
Весь процесс исследования хемилюминес-ценции крови и клеток в присутствии люмино-ла занимает 10-15 мин, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, относится к экспресс-способам оценки функционального состояния фагоцитарного звена иммунитета. При этом удается также регистрировать кинетику процесса фагоцитоза.
Другие существующие методы (НСТтест, определение фагоцитарной и микробицидной активности) недостаточно объективны, занимают много времени, их чувствительность низка 5 9, что обуславливает перспективность широкого внедрения исследования люминол-за-висимой ХЛ.
Литература
1. Журавлев А. И. Низкая интенсивность спонтанной биохемилюминесценции - свойство жизни // Теоретические и методические основы биохемилюминесценции.- Ташкент, 1986.-С. 3.
2. Mамедов Т. Г. Биохемилюминесценция клеток и тканей.- Баку: 1982.- 191 с.
3. Cadenas E., Boveris A., Chance B. // Biochem. J.- 1980.- Vol. 188, № 3.- Р. 577.
4. Henry T. D. et al.// Circ. Res.- 1990.- Vol. 67, № 6.- P. 1453.
5. Фархутдинов Р. Р., Кантюков С. А., Ахмадеев Р. Р. Применение метода регистрации сверхслабого свечения мочи в нефрологической практике // Санаторно-курортное лечение больных воспалительными заболеваниями почек.-Ашхабад: 1982.- С. 52.
6. Slavinska D., Slawinski J.//Photochem. Photobiol.- 1983.- Vol. 37, № 6.- P. 709.
7. Владимиров Ю. А. Сверхслабые свечения при биохимических реакциях.- M.: Наука, 1966.126 с.
8. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.- M.: Наука, 1972.- 252 с.
9. Фархутдинов Р.Р., Владимиров Ю.А. Хемилю-минесценция плазмы крови и ее фракций, инициированная ионами двухвалентного железа // Сверхслабое свечение плазмы крови в клинической диагностике: Тр. 2-ой M0ЛГMИ.— M., 1974.- Т.9, №8.- С. 34.
Башкирский химический журнал. 2GG6. Том 13. № 2
107
