CC BY
19УДК: 636.082.232
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО БЛАГОПОЛУЧИЯ В ПТИЦЕВОДСТВЕ И СВИНОВОДСТВЕ ПУТЕМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДНК
'В.Н.Афонюшкин - кандидат биологических наук, зав. сектором молекулярной биологии;
1Н.А.Донченко - доктор ветеринарных наук, директор; 1П.В.Бушмелева - кандидат ветеринарных наук; ст.н.с.; 2М.А.Барсукова - кандидат биологических наук, доцент;
3О.А.Фролова - мл.н.с.
1Сибирский Федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук, р.п.Краснообск (630501, Новосибирская область, р.п. Краснообск, e-mail: lisocim@mail.ru).
2ФГБОУ ВО«Новосибирский государственный аграрный университет», г.Новосибирск (630039, г.Новосибирск, Добролюбова, 160, e-mail: rector@nsau.edu.ru).
3Красноярский научно-исследовательский институт животноводства - обособленное подразделение Федерального исследовательского центра Красноярского научного центра Сибирского отделения РАН
(660049, г. Красноярск, пр. Мира, 66, а/я 25524, e-mail: kristal_o@bk.ru).
Высокая интенсивность производства, большая концентрация животных и птицы на единицу площади, большие размеры сельскохозяйственных предприятий в Российской Федерации оказывают значительное влияние не только на рост инфицированности животных, но и создают предпосылки для появления новых инфекций, в т.ч. потенциально опасных для человека. Необходимы ассоциативные генетические исследования по поиску маркеров устойчивости к заражению вертикально-передающимися инфекционными агентами или более тщательный отбор племенных животных, не зараженных актуальными инфекционными агентами (возбудителями микоплазмозов и сальмонеллезов у птиц, возбудителями репродуктивно-респираторного синдрома, КЧС у свиней). Современные методы оценки генетического разнообразия следует шире использовать, в том числе при осуществлении контроля перемещения животноводческой продукции из эпизоотически неблагополучных хозяйств и вакцинных препаратов (на предмет источника происхождения соответствующей партии вакцины). Важное значение имеет молекулярно-генетический контроль, поставляемых из-за рубежа и отечественных племенных центров птиц и свиней. Выявление генетической неоднородности партии родительских форм заставляет усомниться в том, что эти животные действительно поступили из соответствующего племенного центра, а не являются выбракованными особями из эпизоотически не благополучного предприятия. Молекулярно-генетиче-ские методы оценки генетического разнообразия сельскохозяйственных животных представляют также интерес более утилитарный. Например, выявление контрафактных вакцин путем идентификации линий культур клеток или партий, развивающихся куриных эмбрионов, на которых производили культивирование вакцинных штаммов вирусов, играет важную роль в обеспечении инфекционной безопасности страны. Представляется перспективным адаптация анализа SNP к минимальному парку оборудования, доступного в ветеринарных и генетических лабораториях и учреждениях, а также разработка тестирования в формате point-of-care для наиболее востребованных тестов. Последнее направление развивается сегодня особенно быстро и тесно связано с информатизацией и применением различного рода бытовых мобильных устройств.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: селекция, цыплята-бройлеры, свиньи, продуктивность, устойчивость к болезням, ПЦР, ДНК.
Современная селекционная работа подразумевает отбор животных и птиц, характеризующихся не только высокой продуктивностью [1], но и низким потреблением корма в расчете на единицу продукции [2]. Сочетание высокой продуктивности и высокоэффективной конверсии корма неизбежно сказывается либо на качестве продукции, либо на здоровье животных и птицы [3]. Высокая интенсивность производства, большая концентрация животных и птицы на единицу площади, большие размеры сельскохозяйственных предприятий - отличительные черты сельскохозяйственных предприятий РФ. Перечисленные
факторы оказывают значительное влияние не только на рост инфицированности животных, но и создают предпосылки для появления новых инфекций, в т.ч. потенциально опасных для человека [4]. Глобализация сельского хозяйства привела к снижению количества селекционных центров, сужению генетического разнообразия сельскохозяйственных животных и птицы, поэтому требования к селекционерам только возросли. Так, например, в ситуации, когда 1 петух из селекционного центра, в конечном итоге, влияет на свойства потомства численностью в 48 млн. бройлеров, следует признать, что выведение линии кур, устойчивой к за-
SELECTION AND GENETICS
ражению сальмонеллезом, дешевле, чем внедрение программы вакцинаций и антибиотикопрофилактики на финальном гибриде. Аналогичная тенденция наблюдается в скотоводстве и свиноводстве.
Таким образом, существует настоятельная необходимость в решении ветеринарных и санитарных проблем в животноводстве, свиноводстве и птицеводстве на уровне селекции, а не путем разработки новых лекарств и биопрепаратов. Использование ДНК-маркеров, обуславливающих устойчивость или наоборот чувствительность к заболеваниям, является одним из приемов селекции животных, нацеленной на получение особей, обладающих повышенной резистентностью к заболеваниям [5].
Птицеводство и свиноводство в Российской Федерации характеризуются рядом особенностей. Во-первых, в России аномально высока плотность поголовья (в среднем в 2-3 раза выше, чем в странах Евросоюза). Во-вторых, как в свиноводстве, так и в птицеводстве многие предприятия характеризуются крупными размерами, причем, помимо огромного поголовья (сотни тысяч свиней на одном комплексе или миллионы голов бройлеров, несушки на одной промышленной площадке). Расстояние между птичниками часто не превышает 100-150 м, количество птичников на территории птицефабрики часто превышает 50. В такой ситуации наиболее естественный и эффективный путь снижения концентрации вирусных и бактериальных агентов в воздухе - перемешивание воздуха помещений с чистым воздухом из окружающих птицефабрику пространств, становится малоэффективным, так как над территорией птицефабрики формируется единое микробиально-вирусное облако. Нередко, приточная вентиляция одного помещения закачивает воздух, который только что был выведен вытяжной вентиляцией соседнего помещения. Системы разрыва эпизоотической цепи в такой ситуации просто не могут быть эффективными. Концентрация инфекционных агентов может достигать значений не достижимых на большинстве аналогичных предприятий в любой другой стране мира. Анализируя эти особенности можно сделать два вывода: во-первых, многие вирусные и бактериальные инфекции могут проявляться с большей смертностью ввиду большей дозы заражения. Например, в птицеводстве это метапневмовирусная инфекция, болезнь Гамборо. В свиноводстве - актинобациллезная пневмония, репродуктивно-респираторный синдром свиней; во-вторых, отсутствие разрыва эпизоотической цепи, эффективная передача инфекционных агентов между турами, в сочетании со снижением их количества при санобработках после убоя птицы или свиней может ускорять эволюцию инфекционных агентов. Например, в России раньше, чем за рубежом, появились эпизоотии метапневмовирусной инфекции, флавиви-русной инфекции птиц, бактериального эндокардита кур ассоциирующихся с ЬБаНуапиБ, сопровождающиеся большим экономическим ущербом. Высокопатоген-
ные формы вируса РРСС также являются характерной чертой ряда свинокомплексов Российской Федерации. Развитие антибиотикорезистентности происходит очень бурными темпами по этим же причинам.
Тот факт, что селекция свиней и птицы проводится преимущественно за рубежом, означает, что зарубежные селекционеры просто не могут выводить кроссы птиц и свиней, обладающих устойчивостью к инфекционным заболеваниям, характерным для крупных свинокомплексов и птицефабрик РФ.
Совершенно очевидно, что селекция, нацеленная на различные аспекты продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, подразумевает снижение устойчивости к инфекционным заболеваниям.
Повышение чувствительности к инфекционным заболеваниям слагается из четырех факторов.
1. Высокая метаболическая активность, ассоциирующаяся с продуктивностью, очень часто приводит к дефициту ресурсов для обеспечения функционирования иммунной системы.
2. Активная реакция иммунной системы требует дополнительных ресурсов, что чревато снижением продуктивности или конверсии корма. Очевидно, что селекционеры ведут отбор птицы и свиней с меньшей иммунореактивностью организма.
3. Современные высокопродуктивные кроссы птицы и свиней, породы коров обладают столь высокой продуктивностью, что мы уже не можем рассматривать продуктивность как комплексный признак по типу наследования. Продуктивность цыплят-бройлеров, например, это скорее патологический процесс, сопровождающийся избыточным, патологическим ростом мышечной массы и комплексной, адаптивно-компенсаторной реакцией большинства органов и систем организма. Ввиду того, что невозможно вести селекцию на продуктивность и одновременно вести отбор в направлении большей эффективности адаптивных реакций сразу всех органов и систем организма, мы можем наблюдать резкий рост числа патологий, ассоциирующихся с истощением генетического потенциала многих органов и систем, в части адаптации к такому патологическому процессу, как высокая продуктивность в сочетании с хорошей конверсией корма. Применительно к бройлерному птицеводству и свиноводству можно наблюдать значительный рост встречаемости патологий, ассоциирующихся с сердечно-сосудистой недостаточностью. Высокие темпы роста массы тела, значительный убойный вес, как у цыплят-бройлеров, индейки, так и у свиней, приводят к тому, что миокардит любой этиологии, резко повышает смертность от сердечно-сосудистой недостаточности и вторичных респираторных инфекций, провоцируемых одышкой. В случае с цыплятами-бройлерами можно говорить об аденовирусных инфекциях, МПВИ, парвовирусном энтерите, бактериальных эндокардитах, которые вызывают значительно более тяжелые поражения сердечно-сосудистой системы у бройлеров, чем у несушки.
4. Косвенный отбор в направлении повышения уровня бессимптомного носительства инфекционных агентов, поражающих репродуктивную систему, и/или повышенную смертность потомства.
Рассмотрим четвертую причину снижения устойчивости к вертикально передающимся инфекциям.
Повышение устойчивости к инфекционному агенту, снижающему репродуктивную активность самок (например, у кур это ИБК, микоплазмозы, сальмонел-лез, а у свиней репродуктивно-респираторный синдром, лептоспироз и т.д.), вовсе не обязательно будет сопровождаться снижением риска инфицирования. В таком случае самка, устойчивая к заболеванию, будет размножаться эффективнее, но останется источником заражения. Такая положительная мутация будет способствовать заражению восприимчивого поголовья и снижению репродуктивной активности этих особей. Таким образом, удельная доля генов носителей такой положительной мутации будет расти. В результате такой признак становится эволюционно-выгодным и закрепляется в популяции. Отсутствие контрселекции в этом направлении чревато накоплением вертикально передающихся инфекций в свиноводстве и птицеводстве, увеличением вклада племенных репродукторов в усиление эпизоотического неблагополучия на отечественных птицефабриках и свинокомплексах. Например, ассоциируемость сальмонеллезов с репродукторами наблюдается чаще, чем с кормами. Аналогичная ситуация наблюдается в птицеводстве с хламидиозом, микоплазмозами, везикулярным энтеритом, астрови-русным нефритом, парвовирусным энтеритом и некоторыми другими инфекциями.
Анализируя существующие проблемы, очевидно, что необходимы ассоциативные генетические исследования по поиску маркеров устойчивости к заражению вертикально-передающимися инфекционными агентами или более тщательный отбор племенных животных, не зараженных актуальными инфекционными агентами (возбудителями микоплазмозов и сальмо-неллезов у птиц, возбудителями репродуктивно-ре-спираторного синдрома, КЧС у свиней).
Снижение гетерозиготности сельскохозяйственных животных и птицы (финальных гибридов), чревато, помимо уменьшения эффекта гетерозиса, уменьшением репертуара антиген-распознающих клеток и, соответственно, снижением устойчивости животных к инфекциям. Следовательно, необходимы методы, позволяющие прогнозировать эффективность скрещивания родительских форм, для получения потомства с высоким уровнем гетерозиготности, генов главного комплекса гистосовместимости и прогнозируемо высоким эффектом гетерозиса.
Важное значение имеет молекулярно-генетический контроль, поставляемых из-за рубежа и отечественных племенных центров птиц и свиней. Выявление генетической неоднородности партии родительских форм заставляет усомниться в том, что эти животные дей-
ствительно поступили из соответствующего племенного центра, а не являются выбракованными особями из эпизоотически не благополучного предприятия.
Молекулярно-генетические методы оценки генетического разнообразия сельскохозяйственных животных представляют также интерес более утилитарный. Например, выявление контрафактных вакцин путем идентификации линий культур клеток или партий, развивающихся куриных эмбрионов, на которых производили культивирование вакцинных штаммов вирусов, играет важную роль в обеспечении инфекционной безопасности страны. Например, нам уже доводилось выявлять наличие микоплазм в живых вакцинах и, в одном из таких случаев, партия вакцины оказалась контрафактной.
Случаи продажи продуктов животного происхождения и птицеводства из эпизоотически неблагополучных территорий, теоретически могли бы верифицироваться по выявлению генетической идентичности ДНК в продуктах питания с ДНК сельскохозяйственных животных из соответствующего хозяйства. Например, это актуально при африканской чуме свиней, когда очень часто с карантинируемых территорий вывозятся свиньи в соседние регионы, для последующей перепродажи. Собственно, именно этот фактор является основной причиной длительного эпизоотического неблагополучия РФ по АЧС.
В настоящий момент времени анализ копийности микросателлитных последовательностей в геномах млекопитающих является «золотым стандартом» для идентификации, паспортизации и генетического картирования [6,7]. Целый ряд коммерческих организаций предлагают уже готовые, валидированные тест-системы (например, StockMarks™ for Cattle Genotyping Kit, https://www.thermofisher.com/order/ catalog/ product/4307480), результаты которых принимаются основными мировыми регламентирующими агентствами (например, Международное Общество Генетики Животных, http://www.isag.us). Однако данный тип анализа имеет и свои слабые стороны. Он требует наличия дорогостоящего, как для покупки, так и для обслуживания, прибора для капиллярного электрофореза, высококвалифицированного персонала. Появление аллелей с нестандартными нуклеотидными последовательностями ведет к сложности их интерпретации и ошибкам.
Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) на основе ПЦР в режиме реального времени в последнее время представляется привлекательной альтернативой [8]. Анализ SNP более прост по чтению вариаций, его легче стандартизовать. В тоже время, сегодня он осуществляется в основном с применением дорогостоящих микрочипов и сложных сканеров для их анализа. Например, это панели производства американской компании Illumina (BovineHD DNA Analysis Kit 777,000 SNPs; PorcineSNP60 DNA Analysis Kit v2 64,000 SNPs). В тоже время, представляется перспективным адаптация анализа SNP к минимальному парку оборудования, доступного в ветеринарных и генетических
SELECTION AND GENETICS
лабораториях и учреждениях, а также разработка тестирования в формате point-of-care для наиболее востребованных тестов. Последнее направление развивается сегодня особенно быстро и тесно связано с информатизацией и применением различного рода бытовых мобильных устройств.
Разработка панели тестов для анализа SNP в качестве альтернативы анализу микросателлитной ДНК, при оценке чистопородности, контроле разведения представляет интерес и для прогнозирования эффекта гетерозиса как для подбора линий при создании кроссов кур, так и при индивидуальных скрещиваниях. По данным Amuzu-Aweh et al [9], анализ частот аллелей позволяет прогнозировать эффект гетерозиса с приемлемой точностью.
Таким образом, разработка низкобюджетных, мультиплексных методов выявления SNP для генетической паспортизации и определения хозяйственно ценных признаков сельскохозяйственных животных с возможностью адаптации к стандартным приборам для проведения real-time PCR представляет собой важную, практически ориентированную, задачу.
Важным преимуществом тестов на основе ПЦР в режиме реального времени является их количествен-ность. С одной стороны, это позволяет использовать количественные критерии для выявления неспецифических реакций. С другой стороны - количественность аллельспецифичных ПЦР позволяет изучать представленность изучаемых аллелей в пулированных образцах. Таким образом, становится возможным снижение себестоимости ассоциативных исследований в десятки и сотни раз, что позволит снизить и существенно расши-
Литература
рить поиск и верификацию молекулярно-генетических маркеров, ассоциируемых с устойчивостью к болезням, продуктивности, качеством продукции в условиях РФ.
Заключение. Развитие устойчивости к заболеванию вертикально-передающимися инфекциями (поражающими репродуктивную систему и/или вызывающую повышенную смертность молодняка) является эволюционно-выгодным, т.к. способствует увеличению удельной доли генов племенного животного - носителя инфекционного агента и должно сопровождаться закреплением данного признака в популяции.
Проведение селекции кур и свиней в направлении устойчивости к заражению санитарно- и эпизоотически значимыми инфекционными агентами следует считать обязательным элементом селекции хозяйственно-полезных признаков, и элементы этой селекции должны дополняться тщательной выбраковкой зараженных племенных животных и птицы.
Особенности эпизоотических процессов в условиях крупных птицеводческих и свиноводческих предприятий требуют поиска маркеров устойчивости к заражению соответствующими инфекционными агентами именно в условиях данных хозяйств, с последующей организацией маркерной селекции, выбраковкой племенных животных с неблагоприятными аллельны-ми вариантами.
Современные методы оценки генетического разнообразия следует шире использовать, в том числе при осуществлении контроля перемещения животноводческой продукции из эпизоотически неблагополучных хозяйств и вакцинных препаратов (на предмет источника происхождения соответствующей партии вакцины).
1. Красота, В.Ф. Разведение сельскохозяйственных животных Текст / В.Ф.Красота, Т.Г.Джапаридзе, Н.М.Костомахин. - 5-е изд., перераб. и доп. - M.: КолосС, 2005. -424 с.
2. Stender, David R. "Swine Feed Efficiency: Influence of Market Weight" / David R. Stender - 2012. Iowa Pork Industry Center Fact, 2012. - 9 Sheets .https:// lib.dr.iastate.edu/ipic_factsheets/9.
3. Ресурсосберегающие технологии в молочном животноводстве и кормопроизводстве / В.М.Тараторкин, Е.Б.Петров. - М.: Колос, 2009. - 211 с.
4. Современные методы контроля сальмонеллеза / В.Н.Афонюшкин, Е.В.Дударева, Л.И.Малахеева [и др.] // Птицеводство. - 2008. - № 9. - С. 43-44.
5. Биологические проблемы животноводства в XXI веке / Л.К.Эрнст, Н.А.Зиновьева. - M.: РАСХН, 2008. - 81 р.
6. Association between multiple sclerosis risk-associated SNPs and relapse and disability a prospective cohort study / R. Lin [et al.] // Mult. Scler. - 2014. - Vol. 20, № 3. - P. 313-321.
7. Efficiency of microsatellite markers of the international standard panel for parentage control in German horse population / K.Wimmers [et al.] // Zuchtungskunde. - 1998. - Vol. 70, № 4. - P. 233-241.
8. Detection and characterization of SNP useful for identity control and parentage testing in major European dairy breeds / F.A.O. Werner [et al.] // Anim. Genet. - 2004. - № 35. - P. 44-49.
Assessing SNP markers for assigning individuals to cattle population / R.Negrini [et al.] // Animal Genetics. - 2008. - № 40(1). - Р. 18-26.
9. Prediction of heterosis using genome-wide SNP-marker data: application to egg production traits in white Leghorn crosses / E.N.Amuzu-Aweh [et al.] // Heredity. - 2013. - № 111. - Р. 530-538, doi:10.1038/hdy.2013.77.
THE ORETICAL ASPECTS OF ENSURING INFECTIOUS WELL-BEING IN POULTRY FARMING AND SWINE BREEDING BY USING BREEDING METHODS AND MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF DNA
1Afonyushkin V.N. - Candidate of Biological Sciences; Donchenko N.A. - Doctor of Veterinary Sciences;
1Bushmeleva P.V. - Candidate of Veterinary Sciences; 2Barsukova M.A. - Candidate of Biological Sciences;
3Frolova O.A. - Research Assistant.
1Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Sciences, Krasnoobsk
(e-mail: lisocim@mail.ru).
2Federal State Budget Educational Institution of Higher Education Novosibirsk State Agrarian University,
Novosibirsk (e-mail: rector@nsau.edu.ru).
3Krasnoyarsk Research Institute of Animal Husbandry - Separate Division of the Federal Research Center "Krasnoyarsk Science Center" of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
(e-mail: kristal_o@bk.ru).
The high intensity of production, the high concentration of animals and poultry per unit area, the large size of agricultural enterprises in the Russian Federation - all have a significant impact not only on the growth of animal infection but also create the prerequisites for the emergence of new infections, including potentially dangerous for humans. Associative genetic studies are needed to find markers of resistance to infection by vertically transmitted infectious agents or to more carefully select breeding animals that are not infected with actual infectious agents (pathogens of mycoplasmosis and salmonellosis in birds, pathogens of the reproductive and respiratory syndrome, swine fever in pigs). Modern methods for assessing genetic diversity should be used more widely, including when controlling the movement of livestock products from epizootic unsuccessful farms and vaccine preparations (for the source of origin of the appropriate batch of vaccine). The molecular genetics control of the breeding centers of birds and pigs both domestic and supplied from abroad is of great importance. Identifying the genetic heterogeneity of the party of parental forms makes us doubt that these animals really came from the corresponding tribal center, and are not rejected individuals from an epizootically unsuccessful enterprise. Molecular genetics methods for estimating the genetic diversity of agricultural animals are of more utilitarian interest. For example, the identification of counterfeit vaccines by identifying cell culture lines or lots of developing chick embryos on which vaccine strains of viruses were cultivated plays an important role in ensuring the country's infectious safety. It seems promising to adapt the SNP analysis to the minimum park of equipment available in veterinary and genetic laboratories and institutions, as well as the development of point-of-care testing for the most popular tests. The latter direction is developing especially quickly and is closely connected with informatization and application of various kinds of household mobile devices.
KEYWORDS: selection, broiler chicken, swine, productivity, resistance to disease, PCR, DNA.
References
1. Krasota, V.F. Razvedenie selskohozjajstvennyh zhivotnyh [Farm animals breeding]. / V.F.Krasota, T.G.Dzhaparidze, N.M.Kostomahin. - 5-e izd., pererab. i dop. - M.: KolosS, 2005. - 424 p.
2. Stender, David R. "Swine Feed Efficiency: Influence of Market Weight" / David R. Stender. - Iowa Pork Industry Center, 2012 Fact Sheets. 9.https://lib.dr.iastate.edu/ipic_factsheets/9.
3. Resursosberegajushhie tehnologii v molochnom zhivotnovodstve i kormoproizvodstve [Resource-saving technologies in dairy cattle breeding and fodder production] / V.M.Taratorkin, E.B.Petrov. - M.: Kolos, 2009. - 211 p.
4. Sovremennye metody kontrolja salmonelleza [Modern methods of controlling salmonellosis] / V.N. Afonjushkin, E.V. Dudareva, L.I. Malaheeva [et al.] // Pticevodstvo. - 2008. - №. 9. - P. 43-44.
5. Biologicheskie problemy zhivotnovodstva v XXI veke [Biological problems of animal husbandry in the 21st century] / L.K.Jernst, H.A.Zinoveva. - M.: RASHN, 2008. - 81 p.
6. Association between multiple sclerosis risk-associated SNPs and relapse and disability a prospective cohort study / R. Lin [et al.] // Mult. Scler. - 2014. - Vol. 20, № 3. - P. 313-321.
7. Efficiency of microsatellite markers of the international standard panel for parentage control in German horse population / K. Wimmers [et al.] // Zuchtungskunde. - 1998. - Vol.70, № 4. - P. 233-241.
8. Detection and characterization of SNP useful for identity control and parentage testing in major European dairy breeds / F.A.O.Werner [et al.] // Anim. Genet. - 2004. - № 35. - P. 44-49.
Assessing SNP markers for assigning individuals to cattle population / R.Negrini [et al.] // Animal Genetics. - 2008 . - №. 40(1). - P. 18-26.
9. Prediction of heterosis using genome-wide SNP-marker data: application to egg production traits in white Leghorn crosses / E.N.Amuzu-Aweh [et al.] // Heredity. - 2013. - № 111. - P. 530-538, doi:10.1038/hdy.2013.77.
