ТЕМНОВАЯ И ФОТОИНДУЦИРОВАННАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА A И ИХ АНАЛОГОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К КЛЕТКАМ HELA: НЕКОТОРЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ "СТРУКТУРА-АКТИВНОСТЬ" Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Porphyrins Порфирины

МаКрОГЗТЭрОЦИКЛЫ

http://macroheterocycles.isuct.ru

Paper Статья

DOI: 10.6060/mhc224176b

Темновая и фотоиндуцированная цитотоксичность производных хлорофилла a и их аналогов по отношению к клеткам HeLa: некоторые закономерности «структура-активность»

Я. И. Пылина,а И. С. Худяева,ь Д. В. Белыхь@

^Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, 167982 Сыктывкар, Республика Коми, Россия

ьИнститут химии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, 167000 Сыктывкар, Республика Коми, Россия

@E-mail: [email protected], [email protected]

В настоящей работе систематически исследована темновая и фотоиндуцированная цитотоксичность ряда производных хлорофилла а (выборка 36 соединений, количественная мера токсичности — выживаемость клеток HeLa и величина IC50) в экспериментах in vitro. Показано, что хлорины без экзоцикла, такие как, хлорин еб, его 15,17-диметиловый эфир и 13 -амидные производные вне зависимости от заместителя при 13 -амидном атоме азота, а так же заместителей в положениях3, 15 и 17обладают, как правило, наибольшей цитоток-сичностью (IC50(темн) < 10 мкмоль/л). Установлено, что величина IC50 при темновом воздействии большинства форбиновых производных более 10 мкмоль/л, а наличие на периферии макроцикла форбинового производного полярных заместителей, таких как карбоксильная группа и 1,2-дигидроксиэтильный заместитель, приводит к повышению токсичности (1С50(темн) < 10 мкмоль/л). Подавляющее большинство исследованных производных хлорофилла а оказывают выраженное фотодинамическое действие на клетки HeLa при концентрации 1 мкмоль/л. Более подробное исследование соединений с разной темновой токсичностью показало, что высокими значениями IC50(темн)/1С50(фото) обладают вещества как с высокой, так и с низкой темновой токсичностью, поэтому эффективность фотосенсибилизатора не связана однозначно с его низкой темновой токсичностью.

Ключевые слова: Хлорин ев, производные хлорофилла а, фотосенсибилизатор, цитотоксичность, in vitro, клетки HeLa.

Dark and Photoinduced Cytotoxicity of Chlorophyll a Derivatives and Their Analogues towards HeLa Cells: Some Structure - Activity Relationships

Y. I. Pylina,a I. S. Khudyaeva,b and D. V. Belykhb@

aInstitute of Biology of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 167982 Syktyvkar,

Russian Federation

b Institute of Сhemistry of Komi Scientific Centre of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 167000 Syktyvkar,

Russian Federation

@Corresponding author E-mail: [email protected], [email protected]

In the present work, we have systematically studied the dark and photoinduced cytotoxicity of a series of chlorophyll a derivatives (a sampling of 36 compounds, the quantitative measure of toxicity is HeLa cell survival and IC50 value) in experiments in vitro. It has been shown that chlorins without an exocycle, such as chlorin e6, its 15,17-dimethyl ether and 13-amide derivatives, regardless of the substituent at the 13-amide nitrogen atom, as well as substituents in positions 3, 15 and 17, as a rule, have the highest cytotoxicity (IC50(dark) < 10 цЫ). It has been established that the IC50 value during the dark exposure is more than 10 цЫ for the most part of phorbin derivatives, and the presence of polar substituents, such as carboxyl group and 1,2-dihydroxyethyl substituent, on the periphery of the phorbin macrocycle leads to an increase in toxicity (IC50(dark) < 10 цЫ ). Most of the investigated

derivatives of chlorophyll a shows an apparent photodynamic effect on HeLa cells at a concentration of 1 ¡M. A more detailed study of compounds with different dark toxicity showed that substances with both high and low dark toxicity have high IC50(dark)/IC50(photo) values, so the effectiveness of the photosensitizer is not unambiguously associated with its low dark toxicity.

Keywords: Chlorin e6, chlorophyll a derivatives, photosensitizer, cytotoxicity, in vitro, HeLa cells.

Введение

В настоящее время ряд порфириновых соединений используется в клинической практике в качестве диагностических препаратов и фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний.[1-9] Высокоактивные ФС с низкой темно-вой токсичностью были выявлены и среди производных хлорофилла а.'1-6, 8-29] В связи с этим поиск новых ФС в этой группе соединений имеет большие шансы на успех, а изучение механизма их действия и выявление закономерностей «структура-активность» представляет интерес с точки зрения прогнозирования фотодинамической активности соединений при планировании синтеза потенциальных ФС.'1-3-21'28-32' Варьирование химической структуры хлоринов, влияющее на заряд, гид-рофобность и стерические свойства, существенно изменяет способность пигментов проникать в клетку, что может определять их фотодинамическую эффективность.[33-34] Различное расположение однотипных заместителей на периферии макроцикла тоже существенно влияет на фотодинамическую активность ФС.'26-35-37' Среди направлений, в которых проводится оптимизация структуры и свойств противоопухолевых ФС на основе производных хлорофилла а, одним из наиболее значимых является снижение темновой токсичности потенциального ФС. Решению этой задачи может способствовать информация о влиянии природы периферических заместителей на цитотоксичность производных хлорофилла а. В настоящей работе выполнена оценка темновой и фотоиндуцированной цитотоксич-ности производных хлорофилла а по отношению к клеткам линии HeLa в экспериментах in vitro и выявлен характер влияния периферических заместителей макроцикла на цитотоксичность.

Экспериментальная часть

Спектры 'Н ЯМР записывали в CDCI3 на спектрометре «Bruker Avance III» (рабочая частота 300 МГц). Электронные спектры были записаны на спектрометре UV-1700 (PharmaSpec) фирмы SHIMADZU с диапазоном длин волн 200 -1100 нм. Съемку образцов проводили в кварцевых кюветах толщиной 10 мм. Образец сравнения - хлороформ. Контроль за ходом реакций осуществляли с помощью ТСХ на пластинах Silufol, элюент - СОд-ацетон 4 : 1 по объему. Для колоночной хроматографии использовали силикагель производства Alfa Aesar 70/230^.

Метилпирофеофорбида (1), 13(1)^-метиламид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 (14), 13(1)-N,N-duMemunaMud 15(2),17(3) диметиловый эфир хлорина е6 (18) получали согласно.[38]

13(2)-Дигексиламид метилфеофорбида а (2), 13(2)-диоктиламид метилфеофорбидаа (3), 13(2)-дибутиламид метилфеофорбида а (5) получали согласно.'39'

13(2)-Бутиламид метилфеофорбида а (4) получали согласно.[40]

Метиловый эфир 13(2)-NN-диметиламинофеофор-бид а (6), 13(1)-^(н-бутил)-амид 15(2),17(3) диметиловый эфир хлорина е6 (15), 13(1)-N-(н-гексил)-амид 15(2), 17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 (19), 13(1)-^(н-октил)-амид 15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 (20), 3(1),3(2)-6uc-(N,N-диметиламинометил)хлорин e6 13(1)-^этиламид-15(2),17(3)-диметиловый эфир (31), 17(3)-метиловый эфир 13-NN-диме-тиламинокарбонил-15-(1-мета<ситрбонилвинил}хлорина е6 (36) полу чали согласно. '41'

Мезометилфеофорбид а (13) получали согласно. '42' Феофорбид а (7), пирофеофорбид а (8), метилфеофор-бид d (12), хлорин е6 (30) и диметиловый эфир протопорфи-рина IX (33) получали согласно.'43'

3(1),3(2) -Диг идроксиэтил-3-дезвинил-метилпирофеофор -бид а (10), 3(1),3(2)-дигидроксиэтил-3-дезвинил-метилфеофорбид а (11), 13(1)-дезоксомезометил-пирофеофорбида (35), 13(1)-N-морфолиниламид-15(2),17(3)-диметиловый эфир (32), мезо-13(1)^-метиламид-15(2),17(3)-диметиловый эфир 3(1),3(2)-бис-(N,N-диметиламинсметил)-хлорина е6 (27), 13(1)^-диметил-аминометил-13(1)-^метиламид-15(2), 17(3)-диметиловый эфир мезохлорина е6 (28) получали согласно.' 4]

13(1)-N-(2-Гидроксиэтил)амид 15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 (16), 13(1)^-морфолиниламид 15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 (22) получали согласно.'45'

13(1),17(3)-N,N'-(2-Гидроксиэтил)-диамид-15-метиловый эфир хлорина е6 (25) и 13(1)J5(2)J7(3)-N,N',N"-(2-гидрокси-этил)триамид хлорина е6 (26) получали согласно,'46] меток-сим метилпирофеофорбидаа (9) - согласно.'47'

15(2)-N,N-Дибутиламид хлорина е6 (23) получали согласно.'48'

13(1)-N-Метиламид 15(2)-метиловый эфир хлорина е6 (24) получали согласно.'49'

13(1)-N,N-Диметиламид 15(2),17(3) -диметиловый эфир мезохлорина е6 (29). К раствору 60 мг (0.099 ммоль) метилмезофе-офорбида а (13) (получен согласно'41') в 3 мл хлороформа добавляли 0.5 мл 33 % водного раствора диметиламина (примерно 3.3 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре до полного расходования исходного соединения (ТСХ). Реакционную смесь разбавляли 50 мл хлороформа, промывали водой (3x100 мл), полученный раствор сушили безводным Na2SÜ4 и упаривали при пониженном давлении при температуре 30-40 oC. Продукт реакции выделяли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: смесь CCI4 c ацетоном 10:1 по объему) и переосаждали из хлороформа с пентаном. Получили 35 мг (54 %) амида 29 в виде темного сине-зеленого кристаллического порошка. ЭСП (CHCI3) I нм: 652 (35 %), 611 (5 %), 558 (3 %), 530 (7 %), 504 (14 %), 404 (100 %). Масс-спектр (ESI) m/z: для [MH+' (C38H48N5O5) вычислено 654.4, найдено 654.7. 1Н ЯМР (CDCI3, 300 МГц) Sh м.д. (смесь атропоизоме-ров 3 к 2, «/» разделены сигналы преобладающего и минорного изомера, отличающиеся по хим. сдвигу): 9.74/9.72 с (1Н, 10-Н), 9.53/9.50 с (1Н, 5-Н), 8.79/8.74 с (1Н, 20-Н), 15-СНЯа: 5.88 д (1Н, J=19.1 Гц) / 5.72 д (1Н, J=19.1 Гц); 15-СНЯб: 5.06 д (1Н, J=19.1 Гц) / 5.15 д (1Н, J=19.1 Гц); 4.55-4.42 м (1Н, 18-Н), 17-Н: 4.39 уш. д (1Н, J=9.5 Гц) / 4.55-4.42 м (1Н), 4.01-3.76 м

(4Н, З-СН2СН3, 8-СН2СН3), 3.84/3.79 с (3Н, 15-СН2СО2СН3), 3.67/3.64 с (3Н, 17-СН2СН2СО2СЯ3), 3.53/3.52 с (3Н, 12-СШ), 3.50/3.54 с (3Н, 7-СНз), 3.42/3.41 с (3Н, 2-СНз), 13-CON(CH3)2: 3.38/3.37 c (3H) и 2.78/3.14 c (3H); 17-СЯ2СЯ2СО2СН3: 2.672.47 м (1Н), 2.44-2.05 м (2Н), 2.03-1.88 м (2Н); 1.80 т (6Н, J=7.4 Гц, 3-СН2СЯ3, 8-СН2СЯ3), 18-СНз: 1.69 д (3Н, J=6.6 Гц)/ 1.75 д (3Н, J=6.6 Гц), -1.71/-1.59 уш. с (1Н, III-NH), -1.80/-1.63 уш. с (1Н, I-NH).

Получение соединений 17, 21 и 34. Раствор 86.0 мг (0.144 ммоль) хлорина еб (30) в смеси 50 мл метанола с 2.5 мл серной кислоты (46.8 ммоль) оставляли в темноте при комнатной температуре на 12 ч. Реакционную смесь разбавляли хлороформом (100 мл), промывали водой до нейтральной реакции промывных вод, полученный раствор сушили над безводным Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток после упаривания хро-матографировали на силикагеле (элюент СС14:ацетон, от 50:1 до 5:1 по объему). Получили 15.1 мг (17 %) целевого продукта 17. Кроме того, было выделено 6.6 мг (8 %) диметилового эфира изохлорина е4 (21) и 2.7 мг (4 %) порфирина 34.

Хлорин ев 15,17-диметиловый эфир (17) - черно-синий кристаллический порошок. ЭСП (CHCI3) X нм: 666 (29 %), 610 (4 %), 558 (3 %), 532 (6 %), 502 (10 %), 404 (100 %), 275 (30 %). 'Н ЯМР (CDCI3, 300 МГц) 5н м.д.: 9.69 с (1Н, 10-Н), 9.55 с (1Н, 5-Н), 8.75 с (1Н, 20-Н), 8.08 дд (1Н, J=18.0 и 11.4 Гц, 3-СЯ=СН2), 6.39 д (1Н, J=18 Гц, 3-СН=СНЯТранс), 6.18 д (1Н, J=11.4 Гц, 3-СН=СНЯцис), 5.53 д (1Н, J=18.7 Гц, 15-СНЯа), 5.29 д (1Н, J=18.7 Гц, 15-СНЯв), 4.47 к (1Н, J=7.0 Гц, 18-Н), 4.44 уш. д (1Н, J=9.2 Гц, 17-Н), 3.86 с (3Н, 15-СН2СО2СЯ3), 3.78 к (2Н, J=7.4 Гц, 8-СЯ2СН3), 3.67 с (3Н, 17-СН2СН2СО2СЯ3), 3.64 с (3Н, 12-СН3), 3.49 с (3Н, 7-СН3), 3.31 с (3Н, 2-СН3), 17-СЯ2СЯ2СО2СН3: 2.69-2.52 м (2Н), 2.29-2.15 м (2Н), 1.82 д (3Н, J=7.0 Гц, 18-СН3), 1.73 т (3Н, J=7.4 Гц, 8-СН2СЯ3), -1.03 уш. с (1Н, III-NH),-1.20 уш. с (1Н, I-NH).

Изохлорин е4 15,17-диметиловый эфир (21) - черно-синий кристаллический порошок. ЭСП (CHCI3) X нм: 659 (27 %), 604 (2 %), 553 (1 %), 526 (2 %), 501 (9 %), 402 (100 %). Масс-спектр (ESI) m/z: для [MH+] (C35H41N4O4) вычислено 581.3, найдено 581.6. ЯМР ^ (CDCI3, 300 МГц) 5ы м.д.: 9.76 с (1Н, 10-Н), 9.75 с (1Н, 5-Н), 8.88 с (1Н, 20-Н), 8.83 с (1Н, 13-Н), 8.19 дд (1Н, J=18.0 и 11.4 Гц, 3-СЯ=СШ), 6.40 д (1Н, J=18 Гц, 3-СН=СННтранс), 6.18 д (1Н, J=11.4 Гц, 3-СН=СННцис), 5.49 д (1Н, J=16.6 Гц, 15-СНЯД 5.36 д (1Н, J=16.6 Гц, 15-СНЯг), 4.68 дд (1Н, J=9.5 и 1.9 Гц, 17-Н), 4.56 к (1Н, J=7.3 Гц, 18-Н), 3.87 к (2Н, J=7.3 Гц, 8-СЯ2СН3), 3.76 с (3Н, 15-СН2СО2СЯ3), 3.66 с (3Н, 17-СН2СН2СО2СЯ3), 3.65 с (3Н, 12-СН3), 3.56 с (3Н, 7-СН3), 3.39 с (3Н, 2-СН3), 17-СЯ2СЯ2СО2СН3: 2.70-2.55 м (1Н), 2.53-2.39 м (1Н), 2.26-2.13 м (1Н), 2.09-1.93 м (1Н) 1.78 т (3Н, J=7.3 Гц, 8-СН2СЯ3), 1.77 д (3Н, J=7.3 Гц, 18-СН3), -1.96 уш. с (1Н, III-NH), -2.08 уш. с (1Н, I-NH).

Метиловый эфир филлопорфирина XV (34) - черно-фиолетовый кристаллический порошок. ЭСП (CHCI3) X нм: 663 (5 %) 635 (4 %), 582 (7 %), 565 (9 %), 523 (6 %), 415 (0.933 100 %), 275 (23 %). ЯМР >Н (CDCI3, 300 МГц) Sh м.д.: 9.96, 9.86 и 9.82 (все с 1Н, 5-Н, 10-Н и 20-Н), 8.28 с (1Н, 13-Н), 8.12 дд (1Н, J=18.0 и 12.1 Гц, 3-СЯ=СН2), 6.29 д (1Н, J=18 Гц, 3-СН=СНЯ„ранс), 6.18 д (1Н, J=12.1 Гц, 3-СН=СНЯ^с), 4.43-4.15 м (1Н, 17-СЯ2СН2СО2СН3), 4.13 с (3Н, 17-СН2СН2СО2СЯ3), 4.02 к (2Н, J=7.7 Гц, 8-СЯ2СН3), 4.01 с (3Н), 3.92 с (3Н), 3.60 с (3Н), 3.56 с (6Н: 2-СН3, 7-СН3, 12-СН3, 15-СН3, 18-СН3); 3.203.10 м (2Н, 17-СН2СЯ2СО2СН3), 1.83 т (3Н, J=7.7 Гц, 8-СН2СЯ3), -4.05, -4.13 оба уш. с (1Н, I-NH, III-NH).

Темновая цитотоксичность. Стоковые растворы тести-р у емых веществ полу чали пу тём р аств орения в ДМСО (Amresco, USA) в разных концентрациях По 1 мкл стокового раствора соответствующей концентрации вносили в 199 мкл питательной среды, содержащей 5000 клеток HeLa в лунки стерильного культурального планшета. Конечные концентрации веществ составляли от 0.01 до 100 мкмоль/л (для скрининговых исследований концентрации 0.01, 0.1, 1.0, 10 и 100 мкмоль/л, при необходимости дополнительно определяли выживаемость

при концентрациях, близких к IC50), а концентрация ДМСО 0.5 % (v/v). В контрольную суспензию добавляли чистый ДМСО в той же концентрации. Клетки с тестируемыми веществами инкубировали 72 ч в темноте при 37 °С, 100 % влажности в атмосфере, содержащей 5 % СО2. Затем удаляли питательную среду, промывали монослойную культуру 200 мкл раствора PBS. Добавляли 100 мкл раствора диацетата флуо-ресцеина (Sigma, USA) и инкубировали при 37 °С / 5 % СО2 в течение 40 мин, после чего производили измерения интенсивности флуоресценции на анализаторе жидкости «Флюо-рат-02-Панорама» (ООО «Люмэкс», Санкт-Петербург) при длине волны 485 (возбуждение) / 520 (регистрация) нм. Выживаемость клеток рассчитана, как отношение интенсивности флуоресценции клеток в лу нке с веществом к интенсивности флуоресценции клеток в контрольной лу нке (содержащей чистый ДМСО), выраженное в %. Эксперименты проводили в девятикратной повторности. IC50 рассчитывали из уравнения зависимости концентрации соединения от выживаемости клеток, полученного в программе Microsoft Excel 2007; SE -стандартная ошибка. Выборки проверяли на наличие артефактов с помощью критерия Граббса. Факторный анализ осуществляли при помощи критерия Краскела-Уоллиса в программе R 4.03.

Фотоиндуцированную цитотоксичность соединений определяли аналогично.[26] По 1 мкл стокового раствора соответствующей концентрации вносили в 199 мкл питательной среды, содержащей 5000 клеток HeLa в лунки стерильного культурального планшета. Конечные концентрации веществ составляли от 0.01 до 10 мкмоль/л, а концентрация ДМСО 0.5 % (v/v). Клетки с тестируемыми веществами инкубировали в течение 2 ч в темноте. Далее клетки подвергались действию света длиной волны 660 нм (источник света - светодиоды, Х=660 нм, величина световой экспозиции 12 Дж/см2) в течение 20 мин. Затем клетки снова инкубировали в темноте 69 ч 40 мин при 37 °С, 100 % влажности в атмосфере, содержащей 5 % СО2. Далее как описано выше. Эксперименты проводили в девятикратной повторности.

Результаты и обсуждение

Для поиска новых потенциальных ФС для ФДТ онкологических заболеваний в настоящей работе исследована темновая цитотоксичность ряда производных хлорофилла а 1-36, отличающихся следующими структурными параметрами: наличие/отсутствие экзоцикла в макроциклической молекуле (соответственно, макроциклы с форбиновым скелетом и аналоги хлорина еб); вне зависимости от наличия экзоцикла - природа заместителей в положении 3; при наличии экзоцикла - природа заместителей в положениях 13(1) и 13(2) форби-нового скелета; для аналогов хлорина еб (хлоринов без экзоцикла) - заместители в положениях 13, 15 и 17 (Схема 1, соединения 1-36). Получение соединений 116, 18-20, 22-28, 31-33 и 35, 36 выполнено согласно методикам, описанным в литературе.[38-50]

Для дополнения исследуемого ряда соединений были синтезированы соединения 17, 21 и 34 (Схема 2). Для синтеза хлорина 17, в положении 13 макроцикла которого вместо амидной находится карбоксильная группа, проводили этерификацию хлорина еб 30 действием метанола (катализатор - H2SO4). Как известно из литературы,[50] карбоксильная группа в положении 13 макроцикла хлорина еб 30 в этих условиях не этери-фицируется, что и позволило получить искомый продукт 17. Помимо целевого продукта 17 из реакционной смеси колоночной хроматографией были выделены диме -тиловый эфир изохлорина е4 21 и порфирин 34 (Схем а 2), которые в дальнейшем тоже были исследованы.

R 3

O^ R2

X

1 -1 3

R1 = CH=C^, X = OCH,, Y = O

CH = C^, X = Y = OCH,

1: R2 = R3 = H 1 4 : Z =

2: R2 = CON(C6H13) 2, R3 = h 16: Z =

3: R2 = CON(C8H17) 2, R3 = " 18: Z =

4: R2 = C O N H C 4 H 9 , R3 = H 20: Z =

5: R2 = C O N (C 4 H 9)2 , R3 = H

6: R2 = CO CH , R3 = C H 2 N (C H 3)2 22: Z =

15: Z = CONHC.H.

H2C "2° H Нз)2, 19: Z

- H 2)yC H 3,

H,

R 1 = C H = C H 2, X = OH, Y = O 7: R2 = CO,CH,, R3 = H

9: R1 = CH=CH , X = OCH , Y = NOCH ,

R2 = R3 = H

R1 = CH(OH)CH2OH, X = OC^, Y = O

10: R2 = R3 = H

11: R2 = CO2CH3, R3 = H

1 2 : R 1 = C H O , X = O C H , Y = O ,

R2

CO CH , R3 = H

13: R1 = C H2CH3, X = O C H 3, Y = O,

R1 = CH=CH , X = OH, Y R1 = CH=CH , X = OH, Y

N(C4H9)2,

OCH , Z

Z = COOH CONHCH

R1 = CH=CH , X = NHCH CH OH, Y = OCH CONHCH CH OH

2 C H 2 O

26: R1 = CH = C^, X = Y = NHCH,CH,OH, Z = CONHCH,CH,OH

R

CH CH , X = Y = OCH

R2

CO CH , R3 = H

2 C H 3, X = Y = O C H 3 27: Z = CONHCH3, 28: Z = CON(CH3)CH2N(CH3)2, 29: Z = CON(CH )

30: R1 = CH=CH , X = Y = OH, Z = COOH

R1 = C(C^N(C^^)=CH(C^N(C^^), X = Y = O C H 3

31: Z = CONHC^C^, 32: Z = C-N O 2 3 // \_/

O

X

Y

14-32

R

3

2 '5

O

O

8: R

R = H

Схема 1.

Схема 2.

Рисунок 1. Спектры 'Н ЯМР порфиринов 17 (А), 21 (В) и 34 (С) (CDClз, 300 МГц, область сигналов мезо-протонов).

3(2)

10.0 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0

10.0 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0

3(2)

10.0 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0

Строение соединений 17, 21 и 34 подтверждено данными ЯМР и электронной спектроскопии, а также масс-спектрометрии. Спектр 1Н ЯМР целевого продукта 17 полностью соответствует структуре 15,17-диметилового эфира хлорина еб (см. Экспериментальную часть). В спектре 1Н ЯМР соединения 21 наблюдается сигнал Р-протона в положении 13, которое становится незамещенным после декарбоксилирования хлорина 17 (Рисунок 1). Остальные сигналы в спектре 1Н ЯМР 21 аналогичны сигналам в спектре соединения 17. В спектре 1Н ЯМР порфирина 34 отсутствуют сигналы протонов в положениях 17 и 18, что свидетельствует об окислении хлоринового макроцикла в порфириновый. Об этом же свидетельствует и смещение сигналов внутри-циклических протонов из области около -2 м.д. в сильное поле (-4.05 и -4.13 м.д.), а также смещение в слабое поле сигналов мезо-протонов, особенно сигнала протона в положении 20, окружение которого значительно меняется при переходе от хлоринового макроцикла к порфириновому (см. Рисунок 1). Образование димети-лового эфира изохлорина е4 21 происходит при декар-боксилировании целевого продукта в условиях реакции.

Порфирин 34 образуется в небольших количествах, по всей видимости, из диметилового эфира изохлорина е4 21 при его декарбоксилировании и окислении.

В настоящей работе на темновую цитотоксичность на опухолевых клетках линии HeLa были протестированы производные хлорофилла а 1-36, которые на периферии макроцикла содержат различные заместители. В качестве количественной меры цитотоксичности использовали выживаемость клеток и величину ГС50 (концентрация полумаксимального ингибирования роста клеток) (Таблица 1). При скрининговом исследовании темновой цитотоксичности исследовали действие соединений при концентрациях 0.01, 0.1, 1, 10, 100 мкмоль/л, что позволяет оценить токсичность при темновом воздействии (1С50(темн)) и разбить соединения на группы по темновой токсичности.

Полученные значения 1С50(темн) позволяют разделить все исследованные соединения на три группы: вещества с высокой (Ю50(темн) < 10 мкмоль/л), средней (1С5 0(темн) от 10 до 100 мкмоль/л) и низкой (1С50(темн) > 100 мкмоль/л) цитотоксичностью. Величина 1С50(темн) большинства форбиновых производных более 10 мкмоль/л.

Таблица 1. Значения ГС50(темн)±£Е (мкмоль/л) при темновом воздействии исследуемых соединений 1-36 на клетки линии

HeLa.

Соединение IC50(темн)±SE, мкмоль/л* Соединение IC50(темн)± SE, мкмоль/л

1 > 100 (58.86±2.01 %) 19 2.30±0.60

2 > 100 (79.72±5.10 %) 20 2.37±0.70

3 > 100 (96.44±5.73 %) 21 63.01±13.50

4 46.32±19.38 22 3.03±1.34

5 24.56±10.56 23 23.22±2.98

6 16.17±5.45 24 8.12±5.25

7 2.36±1.27 25 1.89±0.22

8 3.82±0.17 26 11.56±1.44

9 68.78±34.93 27 1.53±0.31

10 0.99±0.16 28 2.82±0.42

11 2.33±0.48 29 4.77±0.66

12 > 100 (57.76±1.86 %) 30 3.20±0.34

13 35.95±17.58 31 6.18±0.62

14 4.01±0.80 32 6.00±0.43

15 3.03±1.21 33 38.02±25.26

16 5.63±0.49 34 7.95±4.27

17 9.11±3.15 35 17.16±8.61

18 0.80±0.30 36 2.25±0.26

*При ГС50 > 100 мкмоль/л в скобках указана доля выживших клеток при концентрации соединения 100 мкмоль/л.

Малотоксичными являются метилпирофеофорбид а 1, метилфеофорбид d 12, 13(2)-дигексил- и 13(2)-диоктил амиды метилфеофорбида а (2, 3). Повышение токсичности (1С50(темн) < 10 мкмоль/л) наблюдается при наличии на периферии макроцикла форбинового производного полярных заместителей, таких как карбоксильная группа (7, 8) и 1,2-дигидроксиэтильный заместитель (10, 11). Повышение токсичности можно объяснить амфи-фильностью перечисленных производных при наличии на периферии гидрофобного форбинового макроцикла полярной группы. Хлорины без экзоцикла, такие как, хлорин е6 (30), его 15,17-диметиловый эфир и 13-амидные производные вне зависимости от заместителя при 13-амидном атоме азота, а также заместителей в положениях 3 (этильная или аминометилированная ви-нильная группа вместо винильной), 15 и 17 (амидные группы) обладают, как правило, наибольшей цитоток-сичностью (1С50(темн) < 10 мкмоль/л). Исключение составляют 15-дибутиламид хлорина е6 (23) с карбоксильной гру п-пой в положении 13 и диметиловый эфир изохлорина е4 (21), не содержащий заместителя в положении 13. Наличие экзоцикла в молекулах исследуемых соединений статистически значимо влияет на цитотоксичность (p = 0.01422).

Фотоиндуцированную цитотоксичность исследовали на клетках линии HeLa при концентрации производных хлорофилла а 1 мкмоль/л. При этой концентрации исследуемые соединения практически не оказывают темнового цитотоксического действия. Подавляющее большинство исследованных в настоящей работе производных хлорофилла а дают достаточно выраженную фотоиндуцированную цитотоксическую активность (Таблица 2).

Соотношение ГС50(темнУГС50(фото) является информативной характеристикой, позволяющей оценить перспективность ФС для дальнейших исследований. Для определения этого соотношения были более подробно изучены некоторые соединения, отнесенные в разные группы по токсичности (низкотоксичные хлорины 1 и 12, соединения 5 и 26 со средней токсичностью, и высокотоксичные производные 14, 16 и 25). Оказалось, что высокие значения ГС50(темнуЮ50(фото) наблюдаются не только для низкотоксичных соединений 1 и 12, но и для высокотоксичных веществ 14 и 16 (Таблица 3). Таким образом, высокие значения IC50(темн.)/IC50(фото) не связаны однозначно с низкой темновой токсичностью соединения.

Таблица 2. Выживаемость клеток линии HeLa (при концентрации исследуемых соединений 1 мкмоль/л) при фотоинду цированном и темновом (контроль) воздействии исследуемых соединений 1-36 (источник света - светодиоды, Х=660 нм, величина световой экспозиции 12 Дж/см2).

^ Выживаемость клеток линии HeLa, % Выживаемость клеток линии HeLa, % Соединение ___

фото контр оль (темновая) Соединение фото контроль (темновая)

1 94.24±5.78 91.74±3.60 19 1.04±0.07 81.38±1.43

2 68.51±21.49 84.20±2.50 20 1.00±0.07 88.77±2.31

3 48.25±12.51 91.28±4.46 21 1.98±0.14 74.07±4.16

4 10.31±0.45 76.35±2.07 22 1.05±0.09 88.25±2.87

5 65.07±6.40 94.30±4.78 23 93.49±6.87 93.65±2.70

6 4.06±0.82 77.60±3.86 24 19.05±3.70 81.28±4.80

7 10.46±3.08 78.76±5.24 25 20.87±3.11 92.50±2.50

8 70.62±5.98 84.09±5.19 26 23.04±2.76 89.23±3.30

9 11.70±2.10 76.42±1.99 27 19.98±2.75 80.09±3.74

10 9.44±0.44 80.17±2.68 28 20.28±2.56 75.33±2.09

11 3.43±0.69 68.76±1.94 29 19.16±2.99 83.07±2.17

12 25.10±4.18 85.55±3.42 30 96.39±4.52 80.78±4.99

13 19.37±2.99 83.78±2.39 31 1.07±0.07 81.68±2.34

14 3.55±0.80 90.95±3.54 32 1.15±0.10 85.4±1.69

15 9.68±0.50 85.33±1.84 33 25.65±4.26 71.96±2.10

16 1.24±0.11 74.11±1.81 34 2.61±0.18 79.58±2.12

17 25.54±2.48 88.12±1.75 35 3.59±0.66 65.41±2.93

18 1.67±0.12 77.72±3.26 36 1.85±0.14 75.59±1.93

Таблица 3. Значения IC 50 (мкмоль/л) для темновой и фотоиндуцированной цитотоксичности исследу емых пр оизводных хлор офилла а в эксперименте на линии клеток HeLa (источник света - светодиоды, Х=660 нм, величина световой экспозиции 12 Дж/см2), значения

1С50(темн)/1С50(фото).

Соединение

IC50±SE(темн), мкмоль/л

IC50±SE(фото), мкмоль/л

1С50(темн)/1С50(фото)

1 5 12 14 16

25

26

> 100 24.56±10.56 > 100 4.01±0.80 5.63±0.49

I.89±0.22

II.56±1.44

1.42±0.16 1.61±0.37 0.25±0.02 0.025±0.003 0.047±0.002 0.22±0.06 2.70±0.22

> 70 15

> 400 160 119

8 4

Заключение

Таким образом, в настоящей работе систематически исследована темновая и фотоиндуцированная цито-токсичность ряда производных хлорофилла а в экспериментах in vitro и выявлен ряд тенденций влияния строения соединений на их цитотоксичность. Полученные в настоящей работе значения IC50 при темновом воздействии (1С50(темн)) производных хлорофилла а поз-

воляют разделить исследованные соединения на три группы: вещества с высокой (1С50(темн) < 10 мкмоль/л), средней (1С50(темн) от 10 до 100 мкмоль/л) и низкой (1С50(темн) > 100 мкмоль/л) цитотоксичностью. Соединения с 1С50(темн) < 10 мкмоль/л вероятно можно рассматривать как потенциальные темновые цитотоксические агенты. Менее токсичные производные перспективны для дальнейшего исследования в качестве ФС. Хлорины без экзоцикла, такие как, хлорин еб 30, его 15,17-диметиловый

эфир и 13-амидные производные вне зависимости от заместителя при 13-амидном атоме азота, а также заместителей в положениях 3 (этильная или аминометили-рованная винильная вместо винильной), 15 и 17 (амид-ные группы) обладают, как правило, наибольшей цитоток-сичностью (1С50(темн) < 10 мкмоль/л). Величина 1С50(темн) большинства форбиновых производных более 10 мкмоль/л Повышение токсичности (1С50(темн) < 10 мкмоль/л) наблюдается при наличии на периферии макроцикла форбинового производного полярных заместителей, таких как карбоксильная группа (7, 8) и 1,2-дигидроксиэтильный заместитель (10, 11). Подавляющее большинство исследованных в настоящей работе производных хлорофилла а дают достаточно выраженное фотодинамическое действие на клетки HeLa при концентрации 1 мкмоль/л. Более подробное исследование некоторых соединений с разной темновой токсичностью показало, что высокими значениями 1С50(темн)/1С50(фото) могут обладать вещества как с низкой, так и с высокой собственной токсичностью. Поэтому эффективность ФС не связана однозначно с его низкой темновой токсичностью.

Благодарности. Спектральные исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Химия» Института химии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Исследования биологической активности выполнены с применением оборудования ЦКП «Молекулярная биология» Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Работа выполнена в рамках государственных заданий Института химии ФИЦ Коми научного центра Уральского отделения РАН (Сыктывкар) № 122040600073-3 и ИБ ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) № 122040600024-5.

Список литературы References

1. Abrahamse H., Hamblin MR. Biochem. J. 2016, 473(4), 347-364.

2. Van Straten D., Mashayekhi V., de Bruijn H.S., Oliveira S., Robinson D.J. Cancers 2017, 9, 19.

3. Koifman O.I., Ageeva T.A., Beletskaya I.P., Averin A.D., Yakushev A.A., Tomilova L.G., Dubinina T.V., Tsivadze A.Yu., Gorbunova Yu.G., Martynov A.G., Konarev D.V., Khasanov S.S., Lyubovskaya R.N., Lomova T.N., Korolev V.V., Zenkevich E.I., Blaudeck Th., von Borczyskowski Ch., Dietrich l, Zahn R.T., Mironov A.F., Bragina N.A., Ezhov A.V., Zhdanova K.A., Stuzhin P.A., Pakhomov G.L., Rusa-kova N.V., Semenishyn N.N., Smola S.S., Parfenyuk V.I., Vashurin A.S., Makarov S.V., Dereven'kov I.A., Mamardash-vili N.Zh., Kurtikyan T.S., Martirosyan G.G., Burmistrov V.A., Aleksandriiskii V.V., Novikov I.V., Pritmov D.A., Grin M.A., Suvorov N.V., Tsigankov A.A., Fedorov A.Yu., Kuzmina N.S., Nyuchev A.V., Otvagin V.F., Kustov A.V., Belykh D.V., Berezin D.B., Solovieva A.B., Timashev P.S., Milaeva E.R., Gracheva Yu.A., Dodokhova M.A., Safronenko A.V., Shpakovsky D.B., Syrbu S.A., Gubarev Yu.A., Kiselev A.N., Koifman M.O., Lebedeva N.Sh., Yurina E.S. Macroheterocycles 2020, 13, 311-467.

4. Ormond A.B., Freeman H.S. Materials 2013, 6(3), 817-840.

5. Nazarova A.I., Feofanov A.V., Sharonov G.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I., Lebedeva V.S., Mironov A.F., Maurizot J.-C., Vigny P. Russ. J. Bioorg. Chem. 2005, 31, 482-494.

6. Nechaev A.V., Mironov A.F. Russ. J. Bioorg. Chem. 2008, 34, 245-251.

7. Kustov A.V., Privalov O.A., Strelnikov A.I., Koifman O.I., Lubimtsev A.V., Morshnev Ph.K., Moryganova T.M., Kusto-va T.V., Berezin D.B. J. Clin. Med. 2022, 11, 233.

8. Zamilatskov I.A., Savinkina E.V., Volov A.N., Grigoriev M.S., Lonin I.S., Obolenskaya L.N., Ponomarev G.V., Koifman O.I., Kuzovlev A.S., Kuzmicheva G.M., Tsivadze A.Yu. Macroheterocycles 2012, 5, 308-314.

9. Lyapina E.A., Larkina E.A., Tkachevskaya E.P., Mironov A.F., Machneva T.V., Osipov A.N. Biophysics 2010, 55, 296-300.

10. Osati S., Ali H., Guerin B., van Lier J.E. J. Porphyrins Phthalocyanines 2017, 21, 701-730.

11. Kustov A.V., Kustova T.V., Belykh D.V., Khudyaeva I.S., Berezin D.B. Dyes Pigm. 2020, 173, 107948.

12. Li G., Slansky A., Dobhal M.P., Goswami L.N., Graham A., Chen Y., Kanter P., Alberico R.A., Spernyak J., Morgan J., Mazurchuk R., OseroffA., Grossman Z., Pandey R.K. Biocon-jugate Chem. 2005, 16, 32-42.

13. Chen Y., Gryshuk A., Achilefu S., Ohulchansky T., Potter W., Zhong T., Morgan J., Chance B., Prasad P.N., Henderson B.W., Oseroff A., Pandey R.K. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 1264-1274.

14. Pandey S.K., Sajjad M., Chen Y., Pandey A., Missert J.R., Batt C., Yao R., Nabi H.A., Oseroff A.R., Pandey R.K. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 274-282.

15. Glowacka-Sobotta A., Wrotynski M., Kryjewski M., Sobotta L., Mielcarek J. J. Porphyrins Phthalocyanines 2019, 23, 1-10.

16. Mojzisova H., Bonneau S., Vever-Bizet C., Brault D. Bio-chimica et Biophysica Acta 2007, 1768, 2748-2756.

17. Machneva T.V., Lokhmatov A.V., Shevtsova I.S., Larkina E.A., Tkachevskaia E.P., Mironov A.F., Vladimirov Iu.A., Osipov A.N. Biofizika 2012, 57, 274-285.

18. Garcia G., Sol V., Lamarche F., Granet R., Guilloton M., Champavier Y., Krausz P. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3188-3192.

19. Karmakova T., Pankratov A., Kazachkina N., Yakubovskaya R., Feofanov A., Nazarova A., Lebedeva V., Ruziyev R., Mironov A., Maurizot J.-C., Vigny P. J. Photochem. Photo-biol. B: Biol. 2006, 82, 28-36.

20. Aggarwal A., Samaroo D., Jovanovic I.R., Singh S., Tuz M. P., Mackiewicz M.R. J. Porphyrins Phthalocyanines 2019, 23, 741-765.

21. Chen Y., Zheng X., Dobhal M.P., Gryshuk A., Morgan J., Dougherty T. J., Oseroff A., Pandey R.K. J. Med. Chem. 2005, 48, 3692-3695.

22. Zheng X., Morgan J., Pandey S.K., Chen Y., Tracy E., Baumann H., Missert J.R., Batt C., Jackson J., Bellnier D.A., Henderson B.W., Pandey R.K. J. Med. Chem. 2009, 52, 4306-4318.

23. Gurinovich G.P., Zorinab T.E., Melnov S.B., Melnova N.I., Gurinovich I.F., Grubina L.A., Sarzhevskaya M.V., Cherenkevich

5.N. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1992, 13, 51-57.

24. Isakau H.A., Parkhats M.V., Knyukshto V.N., Dzhagarov B.M., Petrov E.P., Petrov P.T. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2008, 92, 165-174.

25. Galindev O., Badraa N., Shim Y.K. J. Porphyrins Phthalocyanines 2007, 11, 829-835.

26. Pylina Y.I., Shadrin D.M., Shevchenko O.G., Startseva O.M., Velegzhaninov I.O., Belykh D.V., Velegzhaninov I.O. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. 103.

27. Nazarova A., Ignatova A., Feofanov A., Karmakova T., Pljutinskaya A., Yakubovskaya R., Mass O., Grin M., Mironov A., Maurizot J.-C. Photochem. Photobiol. Sci. 2007,

6, 1184-1196.

28. Singh S., Aggarwal A., Bhupathiraju N.V.S.D.K., Arianna G., TiwariK., Drain C.M. Chem. Rev. 2015, 115(18), 10261-10306.

29. Lovell J.F., Tracy W.B. Liu, Chen J., Zheng G. Chem. Rev. 2010, 110, 2839-2857.

30. Pandey S.K., Gryshuk A.L., Sajjad M., Zheng X., Chen Y., Abouzeid M.M., Morgan J., Charamisinau I., Nabi H.A., Oseroff A., Pandey R.K. J. Med. Chem. 2005, 48, 6286-6295.

31. Gryshuk A., Chen Y., Goswami L.N., Pandey S., Missert J. R., Ohulchanskyy T., Potter W., Prasad P.N., Oseroff A., Pandey R.K. J. Med. Chem. 2007, 50, 1754-1767.

32. Osterloh J., Vicente M.G.H. J. Porphyrins Phthalocyanines 2002, 6, 305-324.

33. Gurinovich G.P., Zorina T.E., Arkatov Yu.M. et al. Cytology [Гуринович Г.П., Зорина Т.Е., Аркатов Ю.М., Саржевская М .В., Черенкевич С.Н. Цитология] 1989, 31, 1058-1062.

34. Fomichev Yu.A., Zorin V.P., Zorina T.E., Cherenkevich S.N. Microbiology [Фомичев Ю.А., Зорин В.П., Зорина Т.Е., Черенкевич С.Н. Микробиология] 1991, 60, 507-511.

35. Chen H., Humble S. W., Waruna Jinadasa R. G., Zhou Z., Nguyen A. L., M. Vicente G. H., Smith K. M. J. Porphyrins Phthalocyanines 2017, 21, 354-363.

36. Jinadasa R., Hu X., Vicente M., Smith K. J. Med. Chem. 2011, 54(21), 7464-7476.

37. Pylina Y.I., Khudyaeva I.S., Startseva O.M., Shadrin D.M., Shevchenko O.G., Velegz haninov I.O., Kukushkina N.V., Bere-zin D.B., Belykh D.V.Macroheterocycles 2021, 14, 317-322.

38. Belykh D.V., TarabukinaI.S., Matveev Yu.S.,Kuchin A.V. Zh. Obshch. Khim. [Белых Д.В., Тарабукина И.С., Матвеев Ю.С., Кучин А.В. Журнал общей химии] 2007, 77, 1218-1225.

39. Belykh D.V., Kopylov E.A., Gruzdev I.V., Kuchin A.V. Zh. Org. Khim. [Белых Д.В., Копылов Е.А., Груздев И.В., Кучин А.В. Журнал органической химии] 2010, 46, 584-592.

40. Belykh D.V., Pushkareva E.I. Zh. Obshch. Khim. [Белых Д.В., Пушкарева Е.И. Журнал общей химии] 2011, 81(6), 1023-1028.

41. Belykh D.V, Tarabukina I.S., Gruzdev I.V., Kodess M.I., Kutchin A.V. J. Porphyrins Phthalocyanines 2009, 13, 949-956.

42. Kenner G.V., Mac Combie S.W., Smith K.M. J. Chem. Soc. Percin Trans 1973, 1, 2517-2523.

43. Porphyrins: Structure, Properties, Synthesis (Enikolopyan N.S., Ed.), Moscow: Nauka, 1985. 334 p. [Порфирины: структура, свойства, синтез (Ениколопян Н.С., ред.), М.: Наука, 1985. 334 с.].

44. Belykh D.V., Shevchenko D.V., Tarabukina I.S. Macroheterocycles 2014, 7, 79-87.

45. Belykh D.V., Karmanova L.P., Spirikhin L.V., Kutchin A.V. Mendeleev Commun. 2002, 12, 77-78.

46. Belykh D.V., Karmanova L.P., Spirikhin L.V., Kutchin A.V. Zh. Org. Khim. [Белых Д.В., Карманова Л.П., Спирихин Л.В., Кучин А.В. Журнал органической химии] 2007, 43, 120-128.

47. Belykh D.V., Tarabukina I.S., Gruzdev I.V., Kutchin A.V. Macroheterocycles 2010, 3, 145-149.

48. Belykh D.V., Khudyaeva I.S. Macroheterocycles 2018, 11, 273-276.

49. Tulaeva L.A., Belykh D.V., Yakovkeva N.M. et al. Chem-ChemTech [Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol.] [Тулаева Л.А., Белых Д.В., Яковлева Н.М., Селькова И.А., Рочева А.В., Кучин А.В. Изв. вузов. Химия и хим. технология.] 2006, 49(4), 82-87.

50. Gurinovich G.P., Sevchenko A.N., Solov'ev K.N. Spectroscopy of Chlorophyll and Related Compounds. Minsk, 1968. 518 p. [Гуринович Г.П., Севченко А.Н., Соловьев К.Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск: Наука и техника, 1968. 518 с.].

Received 03.02.2022 Accepted 01.03.2022