CC BY
132
УДК 577.112.387.2:612.398.193
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ Ь-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ*
С.А. СУХИХ, аспирант нина. Последующая адсорбция или мембранное
О.О. БАБИЧ, кандидат технических наук, руководитель научно-образовательного центра Л.С. СОЛДАТОВА, аспирант Кемеровский ТИПП E-mail: stas-asp@rambler.ru
Резюме. Выбраны рациональные условия осаждения фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы органическим растворителем. Установлены оптимальные параметры очистки препарата с использованием мембранных и хроматографических методов. Ключевые слова: фенилкетонурия, фенилаланин, L-фенилаланин-аммоний-лиаза, гидролизаты белка, специализированные продукты.
В последние годы во всем мире особое внимание уделяется созданию специализированных и лечебных продуктов питания. К ним относятся продукты, предназначенные для систематического употребления в составе пищевых рационов, сохраняющие и укрепляющие здоровье благодаря наличию веществ, способных оказывать благоприятный эффект на физиологические функции и процессы обмена веществ в организме [1].
При некоторых заболеваниях применение рационов с включением специализированных и лечебных продуктов - единственный метод, позволяющий предупреждать развитие последствий болезни. К числу таких заболеваний относятся наследственные нарушения аминокислотного обмена [1, 2].
Среди них наиболее распространенное заболевание - фенилкетонурия. В его основе лежит нарушение активности фенилаланин-4-гидроксилазы, осуществляющего превращение фенилаланина в тирозин [2]. Отсутствие этого фермента в организме приводит к накоплению в тканях и жидкостях больного как самого фенилаланина, так и его производных, которые оказывают прямое токсическое действие на центральную нервную систему, вызывают нарушения в белковом обмене, обмене липо- и гликопротеидов [2, 3].
До сих пор единственный эффективный методом лечения фенилкетонурии - диетотерапия, построенная по принципу резкого ограничения поступления фенилаланина с пищей [4]. Для этого из рациона исключают продукты с высоким содержанием соответствующей аминокислоты. Адекватной заменой им служат специализированные продукты на основе смеси аминокислот или белковые эквиваленты с минимальным содержанием фенилаланина [2, 4].
Традиционная технология получения продуктов для питания больных фенилкетонурией основана на селективной адсорбции или мембранном фракционировании частичных гидролизатов белка. Расщепление полипептидной цепи молекулы белка проводят протеазами, при этом степень гидролиза достигает 30...60 %, что не обеспечивает полного удаления фенилала-
*Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
фракционирование - не достаточно эффективны, поскольку при этом могут быть удалены только молекулы фенилаланина, находящиеся в свободном состоянии. Кроме того, на поверхности сорбента остается значительное количество аминокислот, что вызывает необходимость подбора соответствующих элюентов для их удаления и в дальнейшем дополнительного обогащения полученных гидролизатов до физиологических потребностей организма [4, 5].
На наш взгляд, целесообразнее использовать реакцию биотрансформации фенилаланина с помощью фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы (ФАЛ, PAL, КФ 4.3.1.5), обладающего высокой специфичностью к этой аминокислоте, в целенаправленных энзиматических гидролизатах молочного белка, полученных в результате действия комплекса специально подобранных ферментов. Это обеспечит максимальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи и позволит разработать технологию получения молочного белкового эквивалента для специализированных продуктов, предназначенных для питания больных фенилкетонурией [5]. Существенное препятствие для повсеместного использования этого фермента в России полное отсутствие его производства.
В связи с этим цель наших исследований - разработка технологии выделения и очистки ферментного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Условия, материалы и методы. Исследования осуществляли в научно-образовательном центре Кемеровского ТИПП.
Объект исследований - фермент L-фенилала-нин-аммоний-лиаза (ФАЛ, PAL), продуцированный клетками E. Coli. На предварительном этапе проводили молекулярное клонирование гена pal в клетках E. Coli, получение рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию гена pal, и наработку биомассы с использованием стандартных методик [5].
Для выделения ферментного препарата использовали метод осаждения смешивающимися с водой органическими растворителями (ацетон, этиловый и изопропиловый спирт).
Для осаждения L-фенилаланин-аммоний-лиазы ацетоном необходимо правильно подобрать рН реакционной среды, рабочую концентрацию растворителя и температурный режим, так как совместно эти факторы способны оказывать существенное воздействие на биологическую и каталитическую активность, а также выход целевого белка.
Для предотвращения денатурации ферментного препарата при осаждении органическими растворителями, согласно [5], температурный режим не должен превышать 0±2оС. Поэтому процесс осаждения белковой фракции из экстракта проводили при такой температуре.
Очистку фермента осуществляли мембранными методами - диализ, ультрафильтрация и микрофильтрация, а затем методом хроматографии с карбок-симетилцелюллозой (КМ-целлюлозой) и диэтилами-ноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой).
Удаление остатков молекул ацетона из выделенного ферментного препарата проводили методом диализа. Для концентрирования белкового раствора, полученного после разрушения клеточной суспензии, его подвергали ультрафильтрации через мембраны марки УПМ различной пористости и проницаемости для низкомолекулярных веществ и растворителя.
Для очистки концентрата от контаминирующей микрофлоры методом микрофильтрации использовали фильтры с различным диаметром пор.
Для повышения каталитической активности ферментного препарата и удаления положительно заряженных белков осуществляли ионообменную хроматографию на колонке с КМ-целлюлозой. Раствор фермента наносили на колонку (2,2x10,0 см) и элюировали градиентом концентраций NaCl в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10,0 см3/
ч. Элюат собирали порциями по 3,0±0,1 см3. В каждой фракции определяли концентрацию белка на экспресс-анализаторе Rapid N и удельную активность PAL.
Хроматографиию с ДЭАЭ-целлюлозой осуществляли с использованием фосфатного буфера с рН 6,5, скорость элюирования 10,0 см3/ч.
Определение массовой доли белка проводили с использованием экспресс-анализатора RAPID N Cube (ELEMENTAR, Германия), действие которого основано на определении теплопроводности молекулярного азота при сжигании анализируемого вещества известной массы в условиях высокой температуры (около 900°C).
Для разделения фракций белков использовали денатурирующий полиакриламидный гель (12 % -разделяющий и 4 % фокусирующий) с 0,1 %-ным до-децилсульфатом натрия. Электрофорез проводили на однократном электродном буфере с добавлением 0,1% 0,1%-ного додецилсульфата натрия при 15 мА. Гель окрашивали 0,2 %-ным Кумасси R250. Просмотр и фотографирование гелей осуществляли на УФ-трансиллюминаторе TCP-20M при длине волны излучения 312 нм. Сохранение и обработку данных осуществляли с помощью гель-документирующей системы Vitran-Photo.
Результаты и обсуждение. Наибольший выход фермента наблюдается при осаждении раствором ацетона с массовой долей растворителя 90 % (рис. 1). Это, вероятно, связано с тем, что PAL в процессе осажде-
ния взаимодействует с этанолом и изопропанолом.
Еще одно преимуществом ацетона перед этанолом и изопропанолом - высокая летучесть, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. В связи с этим ацетон обладает менее выраженным денатурирующим эффектом.
Наибольший выход белка наблюдлся при проведении процесса осаждения в интервалах рН 9,0±0,5 (рис. 2).
500"
*
2 40,0 с;
• ю
4 о
5 30,0 ш
20,0 \______________________________________
7,00 8,00 9,00 10,00 11.00
Активная кислотность, pH
Рис. 2. Влияние активной кислотности на выход белка.
Сравнительный анализ результатов ультрафильтрации ферментного раствора с использованием мембран марки УПМ с различной пористостью показал, что оптимальное соотношение производительности, выхода PAL по активности и степени очистки в процессе ультраконцентрирования обеспечивает полиамидная мембрана марки УПМ-67. При ее использовании можно получить концентрат с удельной активностью 843,0±50,6 Е/мг белка, что указывает на эффективность применения стадии ультрафильтрации для изготовления ферментных препаратов высокой степени очистки.
Результаты микробиологических исследований свидетельствует о том, что микрофильтрация концентрата через мембраны с размерами пор 0,60 и 0,40 мкм недостаточно эффективна, поскольку наблюдается развитие колоний микроорганизмов на питательной среде в процессе инкубации при температуре 37±2оС в течение 12 ч. Стерилизующая фильтрация с использованием мембран с диаметром пор 0,22 мкм позволила получить готовый про-
Рис. 1. Влияние массовой доли органических растворителей на эффективность осаждения PAL при концентрации органического растворителя: 1 - 50 %; 2 - 60 %; 3 - 70 %; 4 - 80 %; 5 - 90 %; 6 - 96%; % - ацетон; S¡ - изопропиловый спирт; Щ - этиловый спирт.
Рис. 3. Профиль элюции PAL на КМ-целюллозе.
123456 789
Продолжительность ЭЛЮЦМИ. I.IIIH Рис. 4. Профиль элюции PAL на ДЭАЭ-целлюлозе.
дукт, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной фармакопеи.
Удельная активность фермента после проведения ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой составила 1156,0±66,4 Е/мг белка.
В ходе исследования выявлено, что подобранные условия хроматографии с ДЭАЭ-целлюлозой позволяют сорбировать на носитель положительно
Таблица. Характеристика стадий очистки ферментного препарата
Стадия процесса Объ- ем, 3 см Массовая доля белка, % Удельная активность, Е/мг белка Вы- ход, %
Экстракция сырья 150,0 1,60±0,1 103,0±6,2 100
Диализ 80,0 1,17±0,07 506,0±30,4 95
я и ц ра т ь -& а р ьтр £ 25,0 1,00±0,06 843,0±50,6 82
Хроматография на:
КМ-целлюлозе 1 5, 0 0,65±0,05 1156,0±66,4 85
ДЭАЕ-целлюлозе 15,0 0,54±0,03 1293,0±77,6 80
заряженные белки. Фермент выходит в пике несор-бированных белков, что дает возможность значительно повысить каталитическую активность PAL, а также удалить часть примесей белковой природы.
В полученном после очистки с помощью ионообменной хроматографии диэтиламиноэтил-целлюло-зой (ДЭАЭ-целлюлоза) продукте массовая доля
белка составляет 0,54±0,03 %, удельная активность 1293,0±77,6 Е/мг белка (см. табл.)
В целом следует отметить, что применение хроматографии с использованием КМ-целюллозы позволяет избирательно выделять PAL из раствора. Однако при этом для полученного препарата характерно высокое содержание примесей, о чем свидетельствует неравномерный хроматографический профиль (рис. 3).
При последующей очистке фермента хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе каталитическая активность PAL зарегистрирована в двух пиках, характеризующихся ферментативной активностью по отношению к фенилаланину (рис. 4).
Электрофоретические исследования фракций белка, содержащихся в конечном продукте (рис. 5), показали наличие полосы, соответствующей по молекулярной массе L-фенилаланин-ам-моний-лиазе (76880 Да), а также гомогенность и чистоту ферментного препарата.
Выводы. Таким образом, рациональные условия осаждения ферментного препарата PAL - массовая доля ацетона 90 %, рН реакционной среды -9,0±0,5, температура - 0±2оС; очистки - диализ против дистиллированной воды при температуре 0±2оС в течение 24 ч; ультрафильтрация на мембранах марки УПМ-67; микрофильтрация на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм; сорбция белка сначала на колонке с КМ-целлюлозой, а потом на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Это позволяет отделить инертные белки и другие полимерные вещества, снижающие потребительские и каталитические свойства L-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Рис. 5. Электрофореграмма очищенного фермента: 1 - контроль; 2 - опытный образец.
Литература.
1. Кочеткова А.А., Нестерова И.Н. Функциональные ингредиенты и концепция здорового питания // Вопросы питания. - 2002. - № 2. - С.4-7.
2. Копылова Н.В. Фенилкетонурия: классификация, диагностика, диетотерапия // Вопросы детской диетологии. -2004. - Т.2. - №6. - С. 31-46.
3. Ладодо К.С. Руководство по лечебному питанию детей. - М.: Медицина, 2000. - 384 с.
4. Диетотерапия наследственных нарушений аминокислотного обмена / Е.П. Рыбакова, Т.В. Бушуева, К.С. Ладодо и др. // Вопросы детской диетологии. - 2005. - Т. 3. - №1. - С.11-17.
5. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Под ред. Панина А.Н. - М.: «Аграрная наука». - 2000. - 295 с.
TECHNOLOGY OF ALLOCATION AND CLEARING OF L- PHENYLALANINE-AMMONIA-LYASE
S.A. Su^ih, O.O. Babich, L.S. Soldatova
Summary. Various ways of treatment of hereditary disease phenylketonuria are considered. It is shown that the most perspective way of treatment of phenylketonuria is use of reaction of biotransformation of phenylalanine by means of enzyme L-fenylalanine-ammonia-lyase. The rational conditions of sedimentation of a fermental preparation by organic solvents are chosen. Optimum parameters of clearing L-fenylalanine-ammonia-lyase with use membrane and chromatographic methods are established. The expediency of use L-fenylalanine-ammonia-lyase in technology of obtaining of specialized products is shown.
Key words: phenylketonuria, phenylalanine, L-fenylalanine-ammonia-lyase, protein hydrolysate; specialized products.
