CC BY
121
ВОПРОСЫ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ
УДК 577.122.332
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ
ь-фенилаланин-аммоний-лиазы из шовозрошвшш ТОтЬвШЕБ
НА СИЛОХРОМЕ С-80
© 2012 О.О. Бабич, Л.С. Солдатова Кемеровский технологический институт пищевой промышленности Поступила 22.03.2011
Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза из Rhodosporidium toruloides иммобилизована при помощи глутарового альдегида на силанизированном силохроме С-80. Изучена термо- и рН-стабильность свободного и иммобилизованного препарата Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы, рассмотрено изменение его активности в процессе хранения. Исследована зависимость активности свободного и иммобилизованного ферментного препарата от концентрации белка в реакционной смеси и концентрации буфера. Проведена оценка влияния концентрации Ь-фенилаланина на количество образующейся транс-коричной кислоты. Проанализирована скорость дезаминирования Ь-фенилаланина при увеличении температуры инкубации.
Ключевые слова: Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизация, глутаровый альдегид, фенилаланин, термостабильность.
В последние годы все больше исследователей посвящают свои работы изучению процессов привязывания ферментов к твердой основе [1].
Свойства иммобилизованных ферментных препаратов часто значительно отличаются от свойств исходных растворимых ферментов, и их особенности зависят от вида фермента, источника его получения и способа пришивки на твердый носитель и условий реакционной среды [2].
При иммобилизации активность фермента может значительно снижаться за счет диффузионного сопротивления, экранирования активного центра, конформационной модификации [2, 3]. С другой стороны, активность иммобилизованных ферментов, пришитых методом ковалентной фиксации, может полностью сохраняться и даже повышаться [4]. За счет повышения стабильности фермента при иммобилизации количество превращенного с его помощью субстрата возрастает во много раз [5].
Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза (ФАЛ, КФ 4.3.1.5) катализирует реакцию обратимого дезами-нирования аминокислоты Ь-фенилаланина до транскоричной кислоты и аммиака [6]. Основным источником данного фермента являются клетки дрожжей. Фермент представляет интерес в качестве терапевтического средства для лечения фенилкетонурии, может быть использован как для прямой терапии фенилкетонурии, так и для производства полноценных продуктов питания, не содержащих фенилала-нин [7].
Целью настоящей работы являлось изучение оптимальных условий иммобилизации Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы из Rhodosporidium toruloides методом ковалентного связывания на силохроме С-80. Использование силохрома для получения иммобилизованных препаратов Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы имеет ряд преимуществ по сравнению с другими носителями [8]. Си-
Бабич Ольга Олеговна, к.т. н., e-mail: [email protected]; Солдатова Любовь Сергеевна, асп., e-mail: [email protected]
лохром является дешевым и доступным материалом, что создает перспективы внедрения иммобилизованных на нем ферментов в крупномасштабных промышленных процессах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований являлся фермент L-фенилаланин-аммоний-лиаза, выделенный из клеток дрожжей Rhodotorula glutinis (Sigma-Aldrich-Louis, США). Удельная активность препарата составляла в среднем 0,87 ед./мг белка.
В качестве носителя использовался силохром марки С-80 (ТУ 6-09-17-48-82) с радиусом пор от 250 до 1000 А и удельную площадь поверхности от 20 до 98 м2/г. Силохром предварительно обрабатывался у-аминопропилтриэтоксисиланом для введения аминогрупп и затем глутаровым альдегидом.
Для иммобилизации к влажному модифицированному носителю добавляли 30%-ный раствор исходного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы в количестве 10-15 ед. удельной активности на мг носителя. Процесс привязки фермента осуществлялся при перемешивании в ледяной бане в течение заданного промежутка времени при рН 7,4-7,5, после чего носитель отделяли на пористом фильтре от жидкости. Фильтрат проверяли на присутствие белка. Промывку иммобилизованного препарата вели до исчезновения в промывных водах следов белка. Отмытый иммобилизованный ферментный препарат осушивали на стеклянном фильтре под вакуумом и в дальнейшем использовали для изучения свойств.
Содержание белка определяли методом Дюма, основанным на измерении теплопроводности молекулярного азота, образующегося после сжигания анализируемого образца при температуре около 1000°С в атмосфере кислорода и последующего восстановления всех образующихся оксидов азота при помощи восстанавливающего агента, с использованием прибора «Rapid N Cube» (Германия).
Активность нативного и иммобилизованного фермента оценивали по образованию транскоричной кислоты при 290 нм (рН 8,7; 30°С) [9].
Количество образующейся транс-коричной ки- Активность Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы рас-
слоты рассчитывали по увеличению светопоглоще- считывали по формуле ния с использованием молярного коэффициента экс-тинкции, равного 104 дм3-см-1-моль-1 [10].
Ед./мл фермента = ■
(А А270 пш/шш Те81 - А А270 пш/шт В1апк) х (3) х (df) (19,73) х (0,01)
где 3 - суммарный объем (в мл) испытания; df -фактор растворения; 19,73 - миллимолярный коэффициент экстинции транс-коричной кислоты при длине волны 270 нм.
ед./мл фермента
Ед./мг белка =---------------------
мг белка
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения термостабильности свободного и иммобилизованного препарата Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы реакционную смесь без Ь-фенилаланина прогревали в течение 5 минут при температуре от 20С° до 80°С. Нагревание проводили в 0,05 М трис-НС1 буфере, рН 8,5. После этого добавляли Ь-фенилаланин, инкубировали реакционные смеси при 30°С на качалке и определяли Ь-фенилаланин-аммоний-лиазную активность.
0,03 1 О'025 | 0,02 5 0,015 1 0,01 1 0,005
2 '
10 20 2,0 40 5й 011 70 00 ° С Рис. 1. Зависимость удельной активности Ь-фенилаланин-
лиаза теряет 50% своей активности, тогда как иммобилизованная сохраняет первоначальный уровень активности фермента.
Таблица 1. Изменение активности свободной и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы в процессе хранения (в мг транс-коричной кислоты/мг белка-час)
Варианты Время хранения, месяцы
0 3 4 6 8
Свободная 0,02 7 0,02 7 0,02 2 0,01 2 0,01 2
Иммобилизованная 0,04 0 0,04 0 0,04 0 0,04 0 0,03 7
аммоний-лиазы Rhodosporidium toruloides от температуры: 1 - свободный препарат, 2 - иммобилизованный препарат
Рис. 2. Зависимость Ь-фенилаланин-аммоний-лиазной активности Rhodosporidium toruloides от концентрации белка: 1-4 часа инкубации; а - свободный препарат, 2 - 20 часов инкубации; б - иммобилизованный препарат
Данные, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что свободная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза Rhodosporidium toruloides сохраняет свою активность при нагревании реакционных смесей вплоть до 60°С, а иммобилизованные препараты -до 65°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к падению Ь-фенилаланин-аммоний-лиазной активности. Полная инактивация фермента обнаружена при 75°С как у свободной, так и у иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы.
Дальнейшие исследования направлены на изучение изменения активности свободной и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы в процессе хранения. Результаты полученных исследований представлены в таблице 1.
Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о том, что иммобилизованная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза в течение длительного времени сохраняет более высокую активность, чем свободная. За 8 месяцев хранения при +4°С или +6°С в 0,15 М трис-НС1 буфере (рН 8,8) свободная Ь-фенилаланин-аммоний-
0,12 | 0,1 | о,0в | 0,06 | 0,04 3 0,02
■л
3 4 5 6 7 8 9 10 11 рн Рис. 3. Зависимость Ь-фенилаланин-аммоний-лиазной ак-
тивности Rhodosporidium toruloides от значений рН буфера (инкубация 4 часа): 1 - свободный препарат, 2 - иммобилизованный препарат
Также выяснили, что Ь-фенилаланин-аммоний-лиазная активность Rhodosporidium toruloides зависит от концентрации белка в реакционной смеси. Наибольшая активность фермента обнаружена при содержании белка от 3,0 мг/мл и выше в случае им-
Вопросы общей биологии
мобилизованной и от 7,0 мг/мл и выше в случае свободной (рис. 2).
Для определения оптимального значения рН действия свободной и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы величину рН варьировали от 4 до 10,5. Результаты определения активности ферментов представлены на рис. 3.
В ходе исследований выяснили, что Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза активна в пределах значений рН от 5,0 до 10,0. Оптимальное значение рН для проявления активности свободной и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы одинаково и лежит в пределах от 8,8 до 9,1.
Кроме того, определили, что Ь-фенилаланин-аммоний-лиазная активность зависит от концентрации буфера (рис. 4). Максимальное значение ферментативной активности свободной и иммобилизо-
ванной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы обнаруживается при концентрациях буфера от 0,2 М и сохраняется до 1,0 М. Низкие концентрации буфера нежелательны, поскольку не обеспечивают поддержания постоянных значений рН. При концентрации буфера ниже 0,1 М значения рН уменьшались до 8,8-8,2 (исходное значение рН 9,1).
Далее в работе изучалось влияние концентрации Ь-фенилаланина на количество образующейся транскоричной кислоты. Результаты исследований представлены на рис. 5.
Определили, что количество транс-коричной кислоты, образуемой как свободной, так и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазой Rhodosporidium toruloides, увеличивается при повышении исходной концентрации Ь-фенилаланина в реакционной смеси.
Рис. 4. Зависимость Ь-фенилаланин-аммоний-лиазной активности Rhodosporidium toruloides от концентрации буфера
(инкубация 4 часа): А - трис-НС1 буфер с рН 9,1, Б - боратный буфер с рН 9,1. Удельная ФАЛ-активность: 1 - свободный препарат, 2 - иммобилизованный препарат. рН конечный: 3 - свободный препарат, 4 - иммобилизованный препарат
С увеличением исходного содержания Ь-фенилаланина возрастает и количество трансформированной аминокислоты, этот процесс сопровождается образованием аммиака и транс-коричной кислоты (рис. 6).
Максимальное количество Ь-фенилаланина, которое может быть трансформировано за 20 часов при 30°С, составляет для свободной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы 15,0 г/л (90 мкМ/мл), а для иммобилизованной - 12,5 г/л (73 мкМ/мл) при начальном содержании аминокислоты 45 г/л. Однако при этом иммобилизованный фермент по сравнению со свободным обладает большей удельной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазной активностью (0,07 и 0,05 мг транс - коричной кислоты/мг белка-час, со-
ной смеси (инкубация 4 часа) 1 - свободный препарат, 2 -
иммобилизованный препарат Ь-фенилаланин-аммоний-
лиазы Шюс1о$рогк\шт 1оги1ок1е$
80 70 60 50 40 30 20 10
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
час
Рис. 6. Трансформация Ь-фенилаланина Ь-фенилаланин-аммоний-лиазой Rhodosporidium toruloides. 1 - свободный препарат (13 мг/мл белка), 2 - иммобилизованный препарат
(12,5 мг/мл белка)
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5
\\
\
\
5 V
16
4 10 1 2
час
Рис. 7. Трансформация Ь-фенилаланина Ь-фенилаланин-
аммонии-лиазои при разной температуре. -
ответственно).
2
1--"1
1
О 5 10 15 20 25 30 35 40 45
мкМ^мп
Рис. 5. Зависимость образования транс-коричной кислоты клетками от концентрации Ь-фенилаланина в реакцион-
свободный препарат, - - иммобилизованный препарат. 1,2- 28°С; 3,4 - 37°С; 5,6 - 45°С
Количество трансформированного Ь-фенилаланина увеличивается при повышении температуры инкубации реакционных смесей (рис. 7).
Свободная и иммобилизованная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза при 30°С полностью трансформирует 2,5 г/л Ь-фенилаланина (15 мкМ/мл), а при 37°С и 45°С - 3,75 г/л (20 мкМ/мл). Скорость дезаминиро-вания Ь-фенилаланина также возрастает при увеличении температуры инкубации. Например, при 37°С свободная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза трансформирует 3,75 г/л Ь-фенилаланина за 12 часов, а при 45°С - за 4 часа. Иммобилизованная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза в первые часы инкубации проводит трансформацию Ь-фенилаланина несколько медленнее, а затем так же интенсивно, как и свободная.
ВЫВОДЫ
В результате проделанной работы были подобраны условия, при которых свободная и иммобилизованная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза полностью трансформирует 15-20 мкМ/мл (2,5-3,75 г/л) Ь-фенилаланина.
Впервые получены препараты иммобилизованной на силохроме С-80 Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы. Сопоставление данных по свободному и иммобилизованному ферменту свидетельствует о том, что иммобилизация Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы на силохроме С-80 благоприятно сказывается на свойствах фермента. Иммобилизованная Ь-фенилаланин-аммоний-лиаза в течение длительного времени сохраняет более высокую активность, чем свободная. При термообработке препараты иммобилизованного фермента обнаруживают более высокую Ь-фенилаланин-аммоний-лиазную активность по сравнению со свободным. Однако полная инактивация как свободной, так и иммобилизованной Ь-фенилаланин-аммоний-лиазы наступает при одина-
ковых условиях. Кроме того, показано повышение рН-стабильности фермента после иммобилизации.
Сравнение свойств свободной и иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы показало, что процесс иммобилизации не оказывает значительного влияния на действие фермента. Иммобилизованный фермент так же хорошо, как свободный, осуществляет неокислительное дезаминирование L-фенилаланина.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, госконтракт № 02.740.11.5133.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреева И.Н., Пантюхин А.В., Сысуев Б.Б. Иммобилизация
ферментов и других биологически активных веществ. Учебное пособие.Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001. 340 с.
2. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф. и др. Адсорб-
ционная иммобилизация глюкоамилазы на амфотерных полиэлектролитах // Журнал физической химии. 2001. Т. 75, №11. С. 2080-2010.
3. Berry C., Curtis A. Functionalisation of magnetic nanoparticles for
applications in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. 2003. V. 3. P. 36.
4. Bruce I.J. Sen T. Surface modification of magnetic nanoparticles
with alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations // Langmuir. 2005. V. 21. P. 7029-7035.
5. Johnson А., Zawadzka A., Deobald L., et al. Novel method for im-
mobilization of enzymes to magnetic nanoparticles // Journal of nanoparticle research. 2008. № 10. Р. 1009-1025.
6. Sarkissian C.N., Gamez A. Phenylalanine ammonia lyase, enzyme
substitution therapy for phenylketonuria, where are we now? // Mol. Genet. Metab. 2005. № 86. Р.22-26.
7. Sarkissian C.N., Shao Z., Blain F., et al. A different approach to
treatment of phenylketonuria: Phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammonia lyase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. № 96. Р.2339-2344.
8. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы.
М.: Мир, 1988. 215 с.
9. Havir E.A. Phenyllalanin ammonia lyase: purification and characte-
rization from soybean suspension cultures // Arch. Biochem. Bio-phys. 1981. 211. P. 556-563.
10. Zucker M. Induction of phenylalanine ammonia lyase in Xanthium leaf disks: photosynthetic requirement and effect of daylength // Plant. Physiol. 1969. 44. P. 912-922.
STUDYING OF PROPERTIES OF FREE AND IMMOBILIZED L-PHENYLALANINE-AMMONIA-LYASE FROM RHODOSPORIDIUM TORULOIDES
ON SILOHROME C-80
© 2012 O.O. Babich, L.S. Soldatova
Kemerovo Institute of Food Science and Technology
L-phenylalanine-ammonia-lyase from Rhodosporidium toruloides immobilized with glutaraldehyde on silohrome ^80. Thermo- and pH-stability of free and immobilized preparation L-phenylalanine-ammonia-lyase, change of its activity at storage is studied. Dependence of activity of free and immobilized enzymatic preparation from a protein concentration in a reactionary mix and concentration of the buffer is investigated. The estimation of influence of concentration of L-phenylalanine on quantity of formed trans-cinnamon acid is spent. The rate of desami-nation of L-phenylalanine at increase in temperature of an incubation.
Key words: L-phenylalanine-ammonia-lyase, immobilization, glutaraldehyde, phenylalanine, thermostability.
Babich Olga Olegovna, e-mail: [email protected]; Soldatova Lyubov Sergeevna, post-graduate student, e-mail: [email protected].
