CC BY
122
Вестник Ка^ЖМУ №1-2018
УДК 612.398.192:615.074:543.544
К.К. Шекеева
Казахский Национальный Медицинский Университет им.. С.Д. Асфендиярова ТЕХНОЛОГИЯ ОТДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
С помощью бумажной хроматографии аминокислоты были разделены и идентифицированы, а также аналитическии выделили аминокислоты методом высоковольтного электрофореза бумаги. Если аминокислота имеет более высокое сродство к подвижной фазе, она будет стремиться перемещаться с фронтом растворителя и быть относительно беспрепятственным с помощью фильтровальной бумаги. Напротив, если аминокислота имеет более высокую сродство к бумаге, чем растворитель, он будет стремиться «прилипать» к бумаге и путешествовать больше медленно, чем фронт растворителя. Именно эти различия в аффинности аминокислот приводят к их разделению на бумаге.
Ключевые слова: извлечение аминоксилот, хроматографическая бумага, высоковольтная электрофарезная бумага, н-пропанол, нингидрин.
Введение.
Аминокислоты, особенно незаменимые (не синтезирующиеся в организме), представляют большой интерес для медицины. За последние несколько лет список аминокислот, на основе которых изготовляются лекарственные препараты, заметно расширился. В этом исследовании использована бумажная хроматография для разделения и идентификации аминокислот, строительных блоков белков. Один из образцами для исследования в этом эксперименте является такая гидролизованная смесь. Когда белок нагревается в присутствии кислоты или основания, он гидролизуется, пептидные связи разрушаются, и составляющие аминокислоты высвобождаются. Для сравнения и потверждения результатов использован метод высоковольтного электрофореза бумаги. Эта технология описывается путем количественного определения с помощью некоторых модификация реакции нингидрина. Эти методы являются очень эффективными для отделение аминокислот для дальнейшего использования. Например, некоторые аминокислоты применяют при разработке лекарственных препаратов для лечения заболеваний печени за счет детоксицирующих свойств, а также благодаря их способности защищать SH-ферменты, причем не только в печени, но и в прочих тканях организма, от окисления [1]. При потреблении белка, он распадается внутри желудочно-кишечного тракта на отдельные аминокислоты, которые в последствии синтезируются в белки, гормоны и ферменты. Поэтому, нехватка аминокислот может привести к большим последствиям. Исследованиями аминокислот, в будущем мы сможем извлекать их и синтезировать в препараты для жизнидеятельности человека. Так как аминокислоты могут помочь лечении многих заболевании, таких как болезнь Паркинсона, депрессия, сонная болезнь, болезни печени и мозга [2].
Методы исследования.
А) Отделение аминокислот методом бумажной хроматографии
Хроматография является общей методикой отделения химических веществ. В этом исследовании использована хроматография для разделения и идентификации аминокислот, строительных блоков белков. Хроматография частично характеризуется средой, на которой происходит разделение. Композиции стационарной и подвижной фаз определяют специфический хроматографический метод. Действительно, возможны многие различные комбинации. Однако все методы основаны на скорости миграции анализируемых веществ в одновременном контакте со
стационарной и подвижной фазами. Относительное сродство вещества для каждой фазы зависит от таких свойств, как молекулярный вес, структура и формамолекулы и полярности молекулы. Для получения полного сравнения каждого испытания важно, чтобы каждое решение применялось на той же стартовой линии. После того, как решения будут применены, бумага будет свернута в цилиндр и помещана в химический стакан, который содержит несколько миллилитров жидкой подвижной фаза. Для этого разделения раствор, содержащий н-пропанол, воду и аммиак, представляет собой оптимальный мобильный фаза. Как только бумага помещается в подвижную фазу, решение начнет поднимать бумагу. Этот феномен называется капиллярным действием. Когда подвижная фаза поднимается на бумаге, она в конечном итоге столкнется с «пятнами» аминогруппы кислоты. Судьба каждой аминокислоты в смеси зависит от сродства каждого вещества для подвижной и стационарной фаз. Сходство этих аминокислот для подвижной фазы могут быть соотнесены с растворимостью различных аминокислот в растворителе (то есть аминокислота, которая является высокорастворимой в элюирующем растворителе, будет иметь более высокое сродство к подвижной фазе, чем аминокислота, которая менее растворима в растворителе.). Когда фронт растворителя приближается к верхней части фильтровальной бумаги, бумага удаляется в стакан и дать высохнуть. В этот момент различные аминокислоты невидимы. Кислоты можно визуализировать, распыляя бумагу соединением под названием нингидрин. Нингидрин реагирует с аминокислотами с образованием сине-фиолетового соединения.
Следовательно распыленная фильтровальная бумага должна содержать несколько пятен, каждая из которых соответствует аминогруппе кислота. Чем дальше пятно от стартовой линии, тем выше сходство аминокислоты для мобильной фазы и быстрее ее миграция. Результаты исследования. Относительная степень
перемещения растворенных молекул в хроматографическом эксперименте обозначенные значениями Rf. Значение Rf для компонента определяется как отношение расстояние, перемещенное этим конкретным компонентом, деленное на расстояние, перемещенный растворитель. На рисунке 1 показана миграция двух компонентов. Измерения сделаны от линии, на которой исходные образцы были применены к центру мигрированного место.
ЮеиЫ1к ХажМММ №1-2018
1- AmWU.lt
\
фраът ди-
©
упамгч.
мситг'л/члгсогп л
гтал^ть
Рисунок 1 - Бумажная хроматография - миграция двух компонентов
Таким образом, значения Rf для компонентов A и B являются:
Rf (А) = dA / ^расг); ^ (В) = дБ / д(раст);
воЬсрод
группа аминов
боковая цепь
кислотная группа
к
^-с-соон-^и-с-соо + и II
, ^N—0—000 + 2Н* I?
Нтий уровень рИ
Высокшуртн ь
рН»7 рв
Рисунок 2
20 различных аминокислот, которые составляют наши белки, и 20% других живых веществ, различаются по идентичности боковой цепи R. Кислотная группа одной аминокислоты может реагировать с основной группой другого с образованием что называется пептидной связью, с удалением молекулы воды. Этот процесс может повторяться для образования полипептидов или белков. Когда белок нагревается в присутствии кислоты или основания, он гидролизуется, пептидные связи разрушаются, и составляющие аминокислоты высвобождаются. Один из образцами для исследования в этом эксперименте является такая гидролизованная смесь.
Б) Аналитические выделения аминокислот методом высоковольтного электрофореза бумаги
В настоящем описывается системы для полного разделения всех аминокислоты, обычно встречающиеся в белке
Старт
1 Аргинин Гистидин Лизин
1 1 Н II
■ I! I
Рисунок 4
Рисунок 3
гидролизаты. В сочетании с улучшенными кадмий-нингидриновый метод Хейлмана, Баролье и Ватске дает новый метод аминокислотный анализ, который уменьшает оценки для каждой аминокислоты, присутствующей в гидролизат, тогда как точность сравнима с полученным методом ионообмена; 250, мкг. белка достаточно для полной аминокислоты.
Экспериментальная часть. Устройство, используемое для электрофоретического разделения, основанный на модификации Гросса и Михля, в котором полоса бумаги удерживается горизонтально между двумя охлаждаемыми поверхностями.
Результаты и их обсуждение. Три электрофоретических разделения в разных растворы электролита необходимы для 20 аминокислот, обычно встречающихся в белке гидролизаты.
Д^ак Сфи .4ЛЖЛИЯ Гв!Ш1
Ичч, ,
[ шшш ■ 1 * 4 4 I 11
Рисунок 5
Вестник Ка^ЖМУ №1-2018
1 электрофорез:
■ основные аминокислоты:лизин, гистиднн и аргинингидроксилнзин. и орнитин 1 кислотные амнн окне лоты :цистенновая, аспарагиновая н глугаминовая кислоты
II электрофорез:
• Глицин, аланин, серии, в алии, лейцин, изолейцин, треонин. пролин, i. iyi аминован кислота, фенилаланин,аспарагиновая кислота, метионинсульфон и тирозин,триптофан
III
электрофорез:
' Валин f ссрнн (неразрешенные), изолейиин, leucine, alliosolcucinc, треонин, пролнн, глугаминовая кислота, фенилаланин, аспарагиновая кислота, меггиоиинсульфон и тирозин
Рисунок 6
В конце эксперименты на бумаге на разных стадиях проявлялись разные аминокислоты. На рисунке 6 выведены данные по отделению аминокислот в разных стадиях высоковольтного электрофореза. Основные аминокислоты вместе с глицин и аланин, мигрируют с бумаги во время необходимо увеличить продолжительность электрофореза для разделения изомерных лейцинов. Благодаря контролируемой и постоянной влажности
стабилизирующая среда, измеренная подвижность показало
менее 2% вариации в течение периода 18 месяцев, а также расстояния миграции от 40 до 80 см. Они обеспечивают однозначную идентификацию всех изученных аминокислот. Выводы. Проведенные эксперименты для синтеза аминокислот методами хромотографической бумаги и высоковольтного электрофореза бумаги показали отличные результаты, так как в обеих случаях мы смогли извлечь группы аминокислот.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Хазова О. А. Аминокислоты. - М.: 2010. - 126 с.
2 Сагиян А. С. Энантиомерно чистые небелковые аминокислоты. Способы получения. - М.: 2010. - 48 с.
3 N. A. Gladys and C. J. Morris Analytical Separations by High - Voltage Paper Electrophoresis. - London: 1961. - 264 р.
4 R. Bhushan and J. Martens Amino Acids: Chromatographic Separation and Enantioresolution. - Germany: 2010. - 241 р.
К.К. Шекеева
С.Ж. Асфендияров атындагы К,азац ¥лттыц Медициналыц yHueepcumemi
ЦАГАЗДЫ ХРОМАТОГРАФИЯМЕН АМИНЦЫШЦЫЛДАРДЫ Б6Л1П АЛУ ТЕХНОЛОГИЯСЫ
ty^h: Кагазды хроматографиямен аминк;ышк;ылдар белшш, идентифицирленген, сонымен ;атар, аналитикалы; ;агазды жогары вольтты электрофорез эдiсiмен амин;ыш;ылдар аньщталган. Егер амин;ыш;ылдар жылжымалы фазага жогары дэрежеде ыгысса, онда сузп ;агазымен салыстырмалы кедергiсiз ерiткiш фронтымен жылжыйды. Керiсiнше, амин;ыш;ылдары ерiткiшке ;араганда ;агазга ыгысуы жогары болса, ;агазга жабысып, ерiткiш фронтына ;араганда жэй жылжыйды. Амин;ыш;ылдарыныц осы ерекшелiктерiне ;арай ;агазда бвлiнiп алынады
ТYЙiндi сездер: амин;ыш;ылдарды бвлiп алу, хроматографты ;агаз, жогарывольтты электрофорез ;агазы, н-пропанол, нингидрин.
K.K. Shekeyeva
Asfendiyarov Kazakh National Medical University
TECHNOLOGY OF AMINO ACID DEPOSIT BY PAPER CHROMATOGRAPHY
Resume: Using paper chromatography, amino acids were separated and identified, and also analytically isolated amino acids by high-voltage paper electrophoresis. If the amino acid has a higher affinity for the mobile phase, it will tend to move with the solvent front and be relatively unhindered with filter paper. In contrast, if the amino acid has a higher affinity for paper than the solvent, it will tend to "stick" to the paper and travel more slowly than the front of the solvent. It is these differences in the affinity of amino acids that lead to their separation on paper. Keywords: aminoxylot extraction, chromatographic paper, high-voltage electrophoresis paper, n-propanol, ninhydrin.
