CC BY
248
УДК 543. 253
КОЛИЧЕСТВЕННЫМ АНАЛИЗ а-АМИНОКИСЛОТ В МОЧЕ НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ПЛАСТИНКАХ «АРМСОРБ»
© В. Н. Майстренко *, Р. Р. Ильясова 1*, Ф. Х. Кудашева М. А. Садретдинов 2, Т. В. Майстренко 2
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Фрунзе 32.
Тел.: +7 (347) 273 6729.
E-mail: Ilyasova_r@mail.ru 2 Городская больница скорой медицинской помощи № 22 г. Уфы Россия, Республика Башкортостан, 450106 г. Уфа, ул.Батырская, 39/2.
Тел.: +7 (347) 255 5626.
Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проведено количественное определение 14 a-аминокислот в моче нейрохирургических больных. Оптимизированы условия разделения a-аминокислот на ТСХ-пластинках «армсорб». Предложены новые системы растворителей в качестве подвижных фаз для количественного определения а-аминокислот при совместном присутствии в биомедицинских объектах.
Ключевые слова: тонкослойная хроматография, «силуфол», «армсорб», a-аминокислоты, количественный анализ.
Изучение аминокислотного состава тканей и биожидкостей человека (сыворотки крови, мочи, спинномозговой жидкости и др.) является важной задачей аналитической химии, клинической биохимии, медицины и др.
Известно, что аминокислоты и их производные -биогенные амины являются не только строительным материалом биологически важных соединений, в том числе белков; но также регулируют множество физиологических функций живых организмов, в частности, принимают непосредственное участие в регуляции основных нервных процессов у человека: возбуждения, торможения, сна, памяти и т.д. Следовательно, для нормального функционирования и гармоничного развития организма человека большое значение имеет оптимальный аминокислотный состав биосред [1]. Избыточное или недостаточное содержание в тканях, органах, биожидкостях а-аминокислот является важным диагностическим признаком и может свидетельствовать о возникновении различных патологий, в том числе поражений нервной системы человека.
Содержание аминокислот в моче, крови, спинномозговой жидкости в силу протекающих в организме человека различных биохимических процессов неодинаково: от 1-10 мкг/л - в плазме крови и спинномозговой жидкости до 1 мг/л - в тканях, органах и моче здоровых доноров [1, 2].
В настоящее время основными методами анализа аминокислот в различных объектах являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез, спектрофотометрия, которые, как правило, основаны на анализе производных аминокислот [3, 4].
Следует отметить, что теоретические основы метода капиллярного электрофореза, ВЭЖХ, спектрофо-тометрии достаточно сложные, требуют наличия специалиста высокой квалификации и наличия специальной аппаратуры, достаточно дорогостоящей. Кроме
того, метод капиллярного электрофореза отличается малой чувствительностью при регистрации аналитического сигнала.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) занимает одно из ведущих мест в качественном и полуколичест-венном анализе сложных природных, фармацевтических, медикобиологических и химических объектов. Среди других аналитических методов ТСХ отличают следующие особенности:
• это - единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюи-рованные компоненты;
• по производительности превосходит ВЭЖХ, по крайней мере, на порядок; т.к. использует более простое и дешевое оборудование. Стоимость количественного анализа в ТСХ составляет всего ~35% от затрат, необходимых для проведения анализа тех же проб методом колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
• обладает высокой селективностью, которую легко варьировать, подбирая состав подвижной фазы; в отличие от ВЭЖХ нет ограничений в выборе растворителей;
• дает возможность одновременного разделения
нескольких образцов; использования однократного или многократного элюирования (при различных условиях), а также одновременного разделения компонентов одного и того же образца с помощью различных элюентов;
• возможна оптимизация разрешающей способности
хроматографической системы при разделении
сложной смеси только для интересующих компонентов, что позволяет экономить время;
автор, ответственный за переписку
• возможно детектирование соединений с высокой чувствительностью и селективностью, которые легко варьировать подбором проявляющего реагента; полученные результаты разделения легко оценить визуально;
• можно сохранять хроматограммы для последующего детектирования и осуществлять спектральную идентификацию хроматографических зон после разделения в любом диапазоне длин волн, включая инфракрасную область.
Отечественные и зарубежные аналитики уделяют развитию этого метода большое внимание, благодаря простоте приемов и оборудования, экспрессности, невысокой стоимости анализа, больших потенциальных возможностей [3-10].
В настоящее время в ТСХ развиваются и широко применяются новые направления: мицеллярная, элек-троосмотическая, микротонкослойная, высокоэффективная ТСХ (ВЭТСХ), которые отличаются повышенной эффективностью разделения, улучшенной экс-прессностью, повышенной чувствительностью, не уступающих по данным характеристикам известным методам аналитической химии [4, 9, 10].
Разработка способа анализа ряда несвязанных аминокислот в условиях тонкослойной хроматографии с применением компьютерной обработки хроматограмм с целью повышения чувствительности и селективности метода; с учетом специфики биологических образцов, а именно мочи нейрохирургических больных и дальнейшее использование методики для биомедицинских исследований определяет актуальность данной работы.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования изучены 14 а-аминокислот: лейцин, изолейцин, валин, триптофан, аланин, аспарагин, глутамин, глутаминовая кислота, орнитин, глицин, гистидин, метионин, аргинин, таурин.
Исходные растворы с концентрацией 1 г/л готовили растворением навески кислоты марки «ч. д. а.» в бидистиллированной воде, из которых последовательным разбавлением готовили растворы необходимой концентрации.
При проведении эксперимента использовали пластинки для тонкослойной хроматографии: «силу-фол» с нанесенным сорбционным слоем силикагеля КСКГ (толщина сорбционного слоя - 2 мм ± 0.01 мм); «армсорб» с нанесенным слоем силикагеля КСКГ, (толщина слоя 100 ± 10 мкм), а также «алуфол» с толщиной нанесенного сорбционного слоя оксида алюминия 0.1 мм ± 0.01 мм.
Для приготовления системы подвижных фаз применяли предварительно очищенные н-гептан, н-бутанол, метанол, этанол, н-пропанол, уксусную кислоту, дихлорэтан, ацетон.
В качестве реагента для обнаружения исследуемых веществ в виде окрашенных соединений использовали нингидрин марки «ч. д. а.».
Для большей степени разделения перед хроматографированием следует отделить мешающие вещества, в частности белки. Согласно литературным данным, для удаления белков, присутствующих в образце мочи, рекомендуют использовать органические и неорганические кислоты.
В соответствии с вышеуказанным, образцы мочи готовили по методике Лемперта, используя для осаждения белка мочи 0.1 н. серную кислоту.
Подготовленные образцы мочи и растворы «свидетелей» (по 10 мкл) наносили на расстоянии 1.5-2 см от края на угол хроматографических пластинок с нанесенными на нее ранее линиями старта и финиша. Капли наносили микрошприцом в несколько приемов в одну и ту же точку после высушивания предыдущей капли. Пластинку с нанесенными растворами подсушивали. Конец пластинки помещали в камеру для хроматографирования с подвижной фазой так, чтобы пятна исследуемых веществ не были погружены в смесь растворителей. Предварительно в камеру помещали подвижную фазу и насыщали парами смеси растворителей ~30 мин.
Хроматографирование проводили восходящим методом двумерной ТСХ. Фронт подъема элюирующей смеси 10 см.
В качестве подвижной фазы использовали:
1. В первом направлении: смесь гептан - дихлорэтан -уксусная кислота (20:30:30).
2. Во втором (перпендикулярном) направлении смесь бутанол - уксусная кислота - вода (80:20:20).
После двукратного элюирования смесями растворителей в условиях двумерной восходящей ТСХ происходило разделение анализируемой смеси веществ в зависимости от сродства к сорбенту. После окончания хроматографического процесса ТСХ - пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе до полного испарения компонентов подвижной фазы и погружали ее в 0.5% раствор проявителя - нингидрина в ацетоне для обнаружения пятен. После чего пластинку нагревали в течение 10-15 мин при 60 °С в сушильном шкафу. Значения коэффициентов подвижности Rf аминокислот определяли по среднему значению из трех определений.
Качественное и количественное определение пятен аминокислот после проведения цветной реакции проводили с использованием сканера и компьютерной программы обработки хроматограмм «Rosslyn medical».
Оценку степени разделения АК на хроматограммах при анализе образцов мочи проводили сравнением с хроматограммой стандартной смеси АК и с хроматограммой, полученной при анализе образца мочи здорового человека.
Количественное определение аминокислот осуществляли с использованием калибровочной кривой. При компьютерной обработке хроматограмм погрешность определений составляла не более 2% при отно-
сительном стандартном отклонении 8Г < 0.33.
Результаты и их обсуждение
Для установления оптимальных условий количественного определения несвязанных аминокислот при совместном присутствии были изучены факторы, влияющие на чувствительность, селективность и воспроизводимость определения исследуемых соединений: тип пластинки в зависимости от природы сорбента, состав и соотношение компонентов в системе растворителей, условия проведения проявляющей реакции аминокислот с нингидрином, способ подготовки образца мочи к анализу.
Изучение влияния хроматографического поведения АК от природы сорбента на поверхности пластинок показало, что в ряду пластинок: «армсорб», «силу-фол» «алуфол» в случае применения пластинок «силу-фол» и «армсорб» достигалась наибольшая чувствительность количественного определения, в то время как пятна АК на пластинках «алуфол» после проведения цветной реакции отсутствовали. Наблюдаемый эффект объясняется большей сорбционной емкостью слоя силикагеля на поверхности пластинок «силуфол» и «армсорб» по отношению к АК в отличие от оксида алюминия на поверхности пластинок «алуфол». При этом чувствительность к исследуемому классу соединений пластинок «силуфол» (до мкг/л) оказалась выше чувствительности пластинок «армсорб» (до мг/л), что объясняется большей толщиной слоя силикагеля на поверхности пластинок «силуфол».
В результате проведенных исследований установлено, что пятна аминокислот сохранялись на пластинках «силуфол» ~24 часа. На хроматограммах, полученных с применением пластинок «арм-сорб» в неизменном виде пятна аминокислот сохранялись ~72 часа, что является более рациональным для проведения серийных анализов. Поэтому дальнейшие исследования проводились с использованием пластинок «армсорб».
При использовании приобретенных пластин, для дальнейшего хроматографирования их необходимо предварительно подготовить [5, 7]. Это связано с тем, что сорбенты пластин при хранении сорбируют не только влагу, но и другие вещества, содержащиеся в воздухе. Следует отметить, что активирование силикагеля, предложенное в рекомендации фирмы-производителя (выдерживание пластин в сушильном шкафу 30 мин при 110 °С), показало, что последующее хроматографирование смеси АК и их проявление приводило к интенсивному отслаиванию слоя сорбента от пластинки. Поэтому нами для предварительной подготовки пластин предложена обработка пластинок на всю высоту пластинки в хроматографической камере с использованием ацетона, с последующей сушкой пластин при комнатной температуре на воздухе (желательно при невысокой влажности воздуха). Таким способом можно подготовить сразу несколько пластин; при хранении их в сухом герметичном месте сохраняются необходимые свойства пластин в течение не-
скольких месяцев.
В результате исследований установлено, что оптимальным растворителем для приготовления серии растворов аминокислот из исходного раствора с концентрацией 1 г/л является смесь 70%-ный этанол - вода в соотношении 1:1.
На рис. 1 представлены концентрационные зависимости валина и таурина на пластинках «армсорб». Приведенные зависимости свидетельствуют о линейности концентрационной зависимости аминокислот в интервале до 10 мг/л.
концентрация, мг/л Рис. 1. Концентрационная зависимость валина (1) и таурина (2) в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «армсорб» проявитель 0.5% - нингидрин в ацетоне.
Особое внимание уделено подбору компонентов и соотношению компонентов в составе подвижной фазы. Состав системы растворителей в ТСХ должен быть постоянным и легко воспроизводимым; система должна полностью разделять вещества близкого строения, система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов; в выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы коэффициент подвижности Rf имел значение не более 0.85. При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ [5, 7].
Установлено, что наилучшее разделение и наибольшие различия в подвижности различных по строению и свойствам АК получены при использовании следующих смесей растворителей - в первом направлении: смесь гептан - дихлорэтан - уксусная кислота (20:30:30); во втором (перпендикулярном) направлении смесь бутанол - уксусная кислота - вода (80:20:20).
Также нами с целью большей степени разделения использован двумерный вариант ТСХ, поскольку применение одномерного варианта ТСХ не позволяет разделить смесь аминокислот, пятна АК сливаются.
В табл. 1 представлены значения коэффициентов подвижности Rf аминокислот в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «армсорб». Различия в значениях коэффициентов подвижностей свидетельствуют о возможности разделения а-АК в указанных условиях, что позволяет использовать метод ТСХ для
разделения аминокислот при совместном присутствии в биомедицинских объектах.
Таблица 1
Коэффициенты подвижности Rf аминокислот, полученные в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «армсорб»
| Аминокислота | Rf | Аминокислота | Rf |
Метионин 0.14 Лргинин 0.12
Гистидин 0.18 Триптофан 0.50
Глутамин 0.17 Глутамин 0.33
Аланин 0.30 Глицин 0.37
Орнитин 0.71 Лейцин 0.63
Изолейцин 0.55 Валин 0.48
Таурин 0.28 Aспарагин 0.22
В результате исследований установлено, что оптимальными условиями проведения проявляющей реакции в условиях двумерной восходящей ТСХ являются: обработка хроматограммы 0.5% раствором нингидрина в ацетоне методом погружения, время проведения цветной реакции 10-15 мин; температура проведения цветной реакции 50°С для пластинок «армсорб» (табл. 2, 3).
Таблица 2
Зависимость площади пятен глутамина и глицина от времени проведения цветной реакции с проявителем - 0.5% нингидрином в ацетоне на пластинках «армсорб»
Глутамин Глицин
Время, мин Площадь пятна, мм2 Время, мин Площадь пятна, мм2
3.2 13.9 4.5 12.3
6.9 17.7 4.8 14.9
1O.O 2S.7 1O.1 22.5
15.6 Э5.2 l5.O 23.8
20.1 26.1 20.2 21.7
24.2 20.6 24.8 14.9
30.0 19.8 29.8 13.8
30.1 19.8 30.1 13.5
30.0 19.7 30.0 13.6
Таблица 2
Зависимость площади пятен глутаминовой кислоты и аспарагина от температуры реакции проявления с 0.5% нингидрином в ацетоне на пластинках «армсорб»
Aспарагин Глутаминовая кислота
Температура, “С Площадь нятна, мм2 Температура, “С Площадь нятна, мм2
41.6 17.8 43.2 14.5
42.9 23.9 46.5 22.9
5O.O 34.8 5O.O 28.7
60.1 25.7 60.1 22.7
64.8 20.1 76.7 12.6
74.6 15.2 90.2 11.7
90.0 14.9 99.7 10.8
90.1 14.9 99.8 10.7
Разработанная методика была использована для определения АК в моче нейрохирургических больных отделения нейрореанимации и нейроанестезиологии больницы скорой медицинской помощи №22
г. Уфы (БСМП №22 г. Уфы). Было обследовано 14 здоровых человек, 22 больных с инсультами различного характера, 25 больных с травмами головного и спинного мозга, все группы - в возрасте 21-75 лет. По результатам анализа образцов мочи здоровых людей и нейрохирургических больных обнаружены достоверные различия в содержании аминокислот в образцах их мочи (рис. 2, 3).
Исследованиями установлено, что у большинства больных с неврологическими нарушениями, развившимися в результате ишемического и геморрагического повреждения мозга, в большинстве случаев наблюдалось повышение содержания в моче гистидина, аланина, аргинина, орнитина, лейцина и одновременное уменьшение содержания метионина (особенно в первые пять суток заболевания), валина, триптофана, аспарагина, глутамина, глицина, таурина, глутаминовой кислоты. Содержание изолейцина оставалось в норме.
Met
Рис 2. Картина аминокислотного состава образца мочи здорового человека, мг/л.
Met
а)
Met
Рис. 3. Картина аминокислотного состава образца мочи, мг/л: а) больного с инсультом головного мозга по геморрагическому типу; б) больного с острой сочетанной травмой.
В то же время в моче больных с различными травмами головного и спинного мозга наблюдалось увеличение содержания гистидина, лейцина, глутаминовой кислоты. Одновременно отмечено уменьшение содержания в моче глицина, аспарагина, валина, триптофана, глутамина, орнитина, таурина, в ряде случаев изолейцина. Концентрации метионина, аланина, аргинина в большинстве случаев оставались в пределах нормы.
Таким образом, разработана методика качественного и количественного определения 14 несвязанных аминокислот в моче человека в условиях восходящей двумерной ТСХ на пластинках «армсорб». Оптимизированная методика использована для анализа 14 АК в моче нейрохирургических больных. По результатам анализа исследованных образцов мочи обнаружены достоверные различия в содержании АК в образцах мочи здоровых доноров и пациентов с инсультами и травмами различных типов.
Работа явилась продолжением совместных исследований с сотрудниками отделения нейрореанимации и нейроанестезиологии БСМП №22 г. Уфы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Березов Т. Т. Биологическая химия. М.: Медицина, 2002. -752 с.
2. Соботка Л. Материалы лекций для курсов Европейской ассоциации парентерального и энтерального питания. Петрозаводск.: ИнтелТек, 2004. -412 с.
3. Алесковский В. Б., Бардин В. В., Булатов М. И. Физикохимические методы анализа. Практическое руководство. Л.: Химия, 2001. -376 с.
4. Материалы тезисов докладов Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в органической химии». Краснодар. 2002. -250 с.
5. Гейсс Ф. Фундаментальные основы тонкослойной хроматографии. В 2-х томах. М.: изд-во Научного совета РАН по адсорбции и хроматографии, 1999. -845 с.
6. Шаршунова М. Н. Тонкослойная хроматография в фармацевтике и клинической биохимии. М.: Мир, 1998. -167 с.
7. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. Т 1. М.: Мир, 1995. -612с.
8. Кибардин С. А. Тонкослойная хроматография в органической химии. М.: Химия, 1998. -124 с.
9. Кайзер Р., Златкис А. Высокоэффективная тонкослойная хроматография. М.: Мир. 1999. -320 с.
10. Беленький Б. Г. Тонкослойная хроматография. М.: Наука, 2002. -200 с.
11. Майстренко В. Н., Ильясова Р. Р., Кудашева Ф. Х., Садретдинов М. А., Майстренко Т. В. // Башкирск. хим. ж. 2007. Т.14. №5. с.140-144.
12. Эмде Р. Идентификация органических соединений. М.: Наука, 1989. -95 с.
Поступила в редакцию 16.11.2007 г. После доработки — 30.04.2008 г.
