CC BY
42
УДК 57.085.1
В.М.Катола, Э.В.Хмелькова, Т.Б.Макеева
ТЕХНИКА ВЗЯТИЯ МАТЕРИАЛА ИЗ НЕБОЛЬШИХ ПО ПЛОЩАДИ ИЛИ ТРУДНОДОСТУПНЫХ УЧАСТКОВ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
АмурКНИИ ДВО РАН, ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН, Благовещенск
РЕЗЮМЕ
Предложен вариант метода отпечатков, позволяющий брать материал из труднодоступных или небольших по площади участков и образований тела человека для прямого электронномикроскопического и микробиологического исследования. С его помощью была обнаружена L-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой.
SUMMARY
V.M.Katola, E.V.Khmelkova, T.B.Makeeva
SAMPLE TECHNIQUE USED ON SMALL
SURFACES AND NOT EASILY ACCESSIBLE PARTS OF THE HUMAN BODY TO STUDY MICROORGANISMS
We suggested a print technique which enables us to take samples from not easily accessible parts and small surfaces of the human body used for ultramicroscopic and microbiological studies. This technique allowed us to detect bacterial L-transformation in nasal cavity in patients with polyps rhinosinusitis and bronchial asthma.
Для изучения количественного и качественного состава и специфики микросообществ открытых поверхностей, полостей и тканей человека в клинической практике используются традиционные методы микробиологических исследований [2]. Однако оценка результатов исследований порою не однозначна. Так, ссылаясь на большой фактический материал,
H.Y.Reynolds [6] утверждает, что бактерии закономерно присутствуют как в бронхах, так и альвеолах здоровых людей. Подобного рода противоречия возникают по многим причинам. Во-первых, внешние и внутренние факторов, которые не всегда можно определить, способны нарушать относительную стабильность аутомикроценоза и степень колонизации микроорганизмами тех или иных участков без какой-либо патологии. Во-вторых, следует учитывать, что около 99% бактерий не удается культивировать на искусственных питательных средах, хотя в местах своего естественного развития они сохраняют метаболическую активность и даже размножаются [5]. Это касается и некоторых микроскопических грибов [1]. В-третьих, разногласиям в оценке результатов микробиологических исследований способствует
несовершенство существующих методик. Нет уверенности, например, что материал, взятый с объекта-носителя с помощью марлевых и ватных тампонов, кашлевых пластинок, бронхиального смыва, отпечатков предметными стеклами и других общедоступных методов, всецело принадлежит только ему. Вызывают сомнения и случаи, когда объект-носитель небольших размеров, расположен в труднодоступном месте или же численность микроорганизмов скудная. Наконец, получению чистой культуры микроорганизмов могут препятствовать их биологические особенности, состояние в момент взятия материала, характер изменчивости, внутриклеточное расположение и т. д.
Таким образом, постоянно существует необходимость в совершенствовании техники собирания материала для микробиологических исследований. С учетом вышеизложенного, для прямого бактерио-скопического и бактериологического обследования отдельных участков организма человека нами разработан свой метод, представляющий собою вариант метода отпечатков.
Методика
Забор материала осуществляется с помощью металлического устройства с горизонтальной шляпкой на одном торце или без таковой. Одно устройство используют для взятия материала и последующего микроскопирования на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) LEO 1420 с энергодисперсионным спектрометром, другое устройство с рифлен-ной шляпкой или торцом применяют для взятия и посева материала на твердую питательную среду. В первом случае на шляпку (торец) наклеивают липкую ленту клейкой стороной кверху. Удерживая устройство пинцетом, прикладывают шляпку к интересующему участку тела или ткани и слегка надавливают. Клейкая поверхность ленты захватывает живые и погибшие микроорганизмы и прочно фиксирует их, сохраняя при этом форму, размеры, взаиморасположение и соотношения клеток. После напыления углеродом в вакуумной установке ВУП-4 для получения тонкого слоя токопроводящего покрытия препарат-отпечаток просматривают в СЭМ. Предварительный просмотр при увеличениях 500010000 и более раз позволяет: а) определить плотность заселения микроорганизмами объекта-носителя; б) по морфотипу клеток высказать предположение об их принадлежности к той или иной систематической группе; в) заранее избрать метод, технику посева, питательную среду и температуру
культивирования.
Взятие материала для бактериологического исследования проводят следующим образом: стерильным устройством рифленной шляпкой прикасаются к поверхности, колонизированной микробиотой, и делают отпечатки на выбранную питательную среду.
Предлагаемая нами методика удобна тем, что позволяет брать отпечатки для бактериоскопии и посева материала с отдельных участков площадью 2,25-4 мм2, локализованных в полости носа, зеве, на миндалинах (в криптах), задней стенке глотки, трахеи, крупных бронхах и других местах.
Эффективность данного метода апробирована при полипозном риносинусите у взрослых больных обоего пола, страдающих бронхиальной астмой. Проведенные посевы материала, ранее взятого у них из полости носа с помощью ватных тампонов, положительных результатов не дали.
Результаты и обсуждение
При электронно-микроскопическом просмотре отпечатков установлено, что непосредственно на полипах и слизистой носовых раковин распространены различные типы полиморфных микробных клеток, среди которых преобладали сферические клетки диаметром от 0,15 до 0,5 мкм, соответствующие элементарным телам Ь-форм бактерий. Кроме них встречались короткие палочки размером
0,2х0,5 мкм с закругленными концами и единичные, не ветвящиеся нитевидные структуры длиною 3,9120 мкм и шириною 0,2-0,4 мкм, не характерные для гифов грибов. Примечательно, что указанные клеточные типы располагались на полипах и слизистой носого хода в виде отдельных элементов или групп. Одновременно в комочках самой слизи найдены шаровидные клетки диаметром около 1 мкм. Они соприкасались друг с другом и различались способами репродукции. Одни из них образовывали не-
Рис. 1 а-г. Ь-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой: а - общий вид нитевидных структур. Местами частицы пыли и мелкие палочки. Увеличение х 3000; б - сегментация в нижней части нити с почкованием элементарных тел (ЭТ) в верхней части. Увеличение х 9000; в, г - почкование ЭТ в области верхнего полюса. Отдельно расположены мелкие сферические тела. Увеличения 15000 и 10000.
65
сколько дочерних клеток, другие делились бинарно, на поверхности третьих происходило почкование, а у некоторых наблюдалось даже внутреннее почкование. Такое атипичное деление свойственно Ь-формам бактерий и давно описано [3]. Вместе с шаровидными клетками в слизи находились как мелкие (0,3x0,15 мкм) палочки, так и элементарные тела, нитевидные структуры здесь отсутствовали. Между тем проведенный анализ привел нас к предположению, что именно эти нити явились одним из этапом процесса Ь-трансформации и источником для всех остальных Ь-клеток (рис. 1). Показано, как элементарные тела выходят из нитей, формируясь внутри их цитоплазмы, а после этого в местах их выхода на клеточной стенке остаются выраженные дефекты. Другая, несколько укрупненная часть элементарных тел отпочковывается со стороны верхнего полюса нити. Еще
д
больше укрупняясь, элементарные тела объединяются между собою и образуют различной величины гроздевидные конгломераты - на их периферии можно увидеть даже остатки одной или нескольких нитей. Такие конгломераты содержаться в комках слизи, на полипах в носовых раковинах (рис. 2). В свою очередь, нижняя часть нити сегментируется и служит началом мелким палочковидным формам.
Итак, в отличие от техники взятия посевного материала ватными тампонами, не выявившего присутствия микроорганизмов в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой, предложенная нами методика оказалась наиболее результативной. С ее помощью установлено, что микросообщество полости носа у таких лиц представляет собою различные L-варианты бактерий. Согласно даным литературы [4] они не растут на обыч-
ГЛад = 25.00КX WD = бігші DetBCtcr= 5Е1 ЕНТ =10.00kV
I 1
е
|1|Wlj Кал» GQ0KX WD- 5 mm Detector = SE1 EHT=10QOkV H Мвд=20ШКХ DetBCMr - SEl BHT = 1Q00 kY
ж з
Рис. i д-з. L-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой: д - ЭТ на поверхности нити и начало ее фрагментации. Увеличение x SGGG; е - выход ЭТ из нити с повреждением ее структуры. Увеличение x 25GGG; ж, з - распад нитей, образование конгломератов L-клеток. Увеличения 6GGG и 2GGGG.
бб
Иаа= 7ЩКК WU= 3mm СямЬ* - S!I- zHT=mmiiV
в
Рис. 2. Ь-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой: а, б - Ь-формы в комочках слизи. Увеличения 8000 и 10000; в - скопления Ь-клеток на слизистой полипа. Увеличение х 7000.
ных твердых и жидких средах - состав сред (с добавлением лошадиной сыворотки, бычьего альбумина, экстракта дрожжей, пенициллина и других ингриди-ентов) и условия культивирования (аэро-анаэробиоз или в атмосфере СО2) зависят от видов бактерий. Ь-формы длительно персистируют в организме, могут сохранять патогенные свойства исходных бактерий, иницируют иммунологические расстройства и плохо фагоцитируются [3].
С ними связан патогенез многих хронических заболеваний и их рецидивы. Поэтому сам факт обнаружения Ь-форм при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой заслуживает пристального внимания.
Выводы
1. Предложенный вариант метода отпечатков позволяет проводить эффективное наблюдение за составом и поведением микроорганизмов в труднодоступных и небольших по площади местах человеческого организма как в норме, так и при патологии.
2. Микроорганизмы полости носа у больных, стадающих полипозным риносинуситом и бронхи-
альной астмой, подвержены сплошной L-трансформации. Ее особенностью является отсутствие гигантских форм и многоэтапный переход микроорганизмов в гетероморфные L-клетки с атипичным делением.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клиническая иммунология и аллергология/Под ред. Л.Йегера.-М.: Медицина, 1990.-Т.2.-
С.107-111.
2. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований.-М.: Медицина, 1978.-391 с.
3. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий.-М.: Медицина, 1981.-237 с.
4. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Биология L-форм бактерий.-М.: Медгиз, 1961.-233 с.
5. Nybroe O. Asessments of metabolic activity of siggle bacterial cells - new developments in microcolony and dehydrogenase assays//FEMS Microbiol. Ecol.-1995.-Vol.17, №2.-P.77-84.
б. Reynolds H.Y. Microbiologische und Pneumonie//Atemwegs-Lungen Kr.-i9SS.-Bd.i4, №i.-Wirstsfactoren in der Pathogenese der S.^^.
□ □□
УДК 611.233:612.215.1:612.592 М.Т. Луценко
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БРОНХОВ ПРИ ОБЩЕМ ОХЛАЖДЕНИИ ОРГАНИЗМА
ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
Проводилось моделирование экстремальных условий для воздухоносных путей организма -общее охлаждение животных в климатокамере при температуре -30°С в течение 10, 20 и 30 дней по 3 часа ежедневно. Опыты показали, что в экстремальных условиях в течение 10 дней эксперимента нарушается нервно-трофический процесс в слизистой бронхов, происходит усиленная миграция тучных клеток в эпителии слизистой оболочки бронхов, приводящих к усиленной выработке гистамина, NO и перекисей жирных кислот. Данные компоненты являются пусковым началом нарушения управления процессом дифференци-ровки специализированных клеток однослойного многорядного эпителия, порождая явления метаплазии. Появляются очаги гиперплазии соединительной ткани и мышечных элементов по ходу слизистой бронхов, приводящие к явлениям обструкции.
SUMMARY
M.T.Lutsenko
MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF BRONCHIAL TREE SUBJECTED TO COLD
We subjected organism airways to simulated I extreme conditions. Animals were kept in climate |
chamber with air temperature - 30°C for 3 hours every day during 10, 20 and 30 days. Studies showed that subjecting animals to cold during 10 days leads to disturbance of nervous-trophic processes in bronchial mucosa, resulting in increased migration of mast cells, enhanced production of histamine, NO and fat acid peroxides. This causes disturbances differentiation process regulation of specific cells of single layer stratified epithelium, generating metaplasia. There are hyperplasia focuses in connective tissue and muscular elements in bronchial mucosa, leading to obstruction.
В структуре заболеваемости населения, проживающего на Северо-Востоке России, ведущее место принадлежит процессам, поражающим органы дыхания: бронхиты, пневмония, бронхиальная астма, на-гноительные заболевания легких [1, 2, 3, 7, 8, 11, 13, 15, 16, 17, 18]. На территории Чукотки и Магаданской области почти 50% в структуре общей заболеваемости отводится неспецифическим процессам в дыхательной системе [14]. Это самые тяжелые по климатическим условиям регионы на территории России, характеризующиеся низкими температурами атмосферы в осенне-зимний период, а также высокой влажностью вдыхаемого воздуха. У лиц, проживающих в таких условиях, отмечается возрастание теп-лопотери в верхних дыхательных путях, особенно при физической активности, что и приводит к холодовому поражению воздухоносного отдела легких [4, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 19, 20, 21, 22, 23]. Охлажденный
Таблица 1
Физиологическая относительная влажность для насыщенного влагой воздуха
Температура, °С Физиологическая относительная влажность, % Температура, °С Физиологическая относительная влажность, % Температура, °С Физиологическая относительная влажность, %
G iG 2i 4G 3G 67
5 i4 22 42 3i 72
iG 2G 23 45 32 76
i5 27 24 48 33 SG
i6 29 25 5G 34 85
i7 3i 26 54 35 9G
iS 33 27 57 36 95
i9 35 28 6G 37 iGG
2G 37 29 63
6s
