CC BY
30
УДК 579.23: 616.233-022-085.
В.М.Катола, Ю.В.Комогорцева
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ БАКТЕРИЙ ВОЗДУХА, ЗДОРОВЫХ И КАРИОЗНЫХ ЗУБОВ И ИХ РОЛЬ В РАЗВИТИИ БРОНХО-ЛЕГОЧНОЙ ПАТОЛОГИИ
Институт геологии и природопользования ДВО РАН, Благовещенск
РЕЗЮМЕ
Прямой электронной микроскопией установлено, что в воздухе служебных помещений, на здоровых и кариозных зубах распространены многочисленные бактериальные формы: варианты L-форм, нитевидные структуры, прямые и изогнутые палочковидные клетки и субмикро-скопические палочковидные элементы - нанопалочки. Предполагается, что размеры и пластичность элементарных телец позволяет им инфицировать локусы, недоступные для инвазии бактерий с естественной морфологией, и индуцировать воспалительный и кариозный процесс.
Ключевые слова: микроорганизмы здоровых и кариозных зубов.
SUMMARY V.M.Katola, J.M.Komogortseva
MORPHOLOGICAL VARIANTS OF AIR BACTERIA, HEALTHY AND CARIOUS TEETH
AND THEIR ROLE IN THE DEVELOPMENT
OF BRONCHOPULMONARY PATHOLOGY
By the direct electronic microscopy it was found out that in the office air and on healthy and carious teeth there were plenty of bacteria: L-form variants, filiform structures, direct and curved rod-shaped cells and submicroscopic rodshaped elements - nanobacillus. It is supposed that the size and plasticity of elementary particles let them infect the locuses, which are inaccessible for invasion of bacteria with natural morphology, and induce inflammatory and carious process.
Key words: microorganisms of healthy and carious teeth.
Считается, что в бронхах и альвеолах микроорганизмы отсутствуют, заселяя в основном носоглотку и полость рта [3, 4, 5]. Только в последней описано свыше 100 аэробных и анаэробных патогенных, условно-патогенных и сапрофитных таксонов, в основном бактерий, играющих важную роль в этиопатогенезе бронхолегочных заболеваний. Это различные виды Streptococcus, Lactobacillus, Fusobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Bacte-rioides, пневмококки, микоплазмы и другие, идентичность и линейная количественная корреляция которых в полости рта, глотке и бронхах в 1984 году убедительно доказана Van Uffelen R. и соавт. [8]. При ослаблении механических, неспецифических, специфических гуморальных и клеточных механизмов защиты организма бактерии в монокультуре или ассоциациях могут вызвать кариес, пародонтоз, тонзиллит, фарингит, бронхит, пнев-
монию, абсцесс и др. [2, 8, 9]. Перемещению бактерий из носоглотки и полости рта в нижние отделы дыхательных путей способствуют вирусная инфекция, иммунодефициты, старость, охлаждение, алкоголь, отягощающие заболевания и др. В этой связи следует указать также на аспирацию здоровыми лицами инфицированного ротоглоточного материала во время сна [12], так как в экспериментах на обезьянах установлено, что для развития пневмонии требуется проникновение пневмококка непосредственно в трахею либо легкие именно с капельками слизи или слюны.
С распространением неспецифических заболеваний легких и резистентности бактерий к антибиотикам первостепенное значение имеет обнаружение, этиологическая дифференцировка и идентификация возбудителя. Решение этих вопросов осложняет разнообразие морфологических и физиологических признаков микроорганизмов, поэтому приходиться выбирать материал, где мог бы находиться виновник заболевания, время и способ его взятия. Так, мокрота больше пригодна для обнаружения микобактерий туберкулеза и менее всего - для идентификации неспецифического возбудителя. Еще сложнее определить его источник, которым могут быть вдыхаемый воздух, носоглотка, зубы и др.
Одной и причин интоксикации и развития заболеваний органов и систем является одонтогенная патология, поскольку 70% микроорганизмов полости рта обитает в зубном налете. На их морфологию (форму) до сих пор не обращалось внимания, не выяснялось, в какой наиболее удобной форме они сопротивляются антимикробным свойствам слюны, проникают в зубодесневые структуры, инфицируют дыхательные пути и др. Напомним, что размеры стрептококков, лактобактерий и большинства других таксонов не позволяют внедряться в мягкие ткани здорового зуба. Но это под силу бактериям, имеющим субмикроскопические размеры, например, Ь-формам бактерий и микоплазм, а также хламидиям. Участие этих микробов в инфекционной патологии человека изучено достаточно полно [4, 13, 14]. Кстати, ранее нами было показано [1, 10, 11], что в полости носа здоровых людей и больных бронхиальной астмой Ь-формы не только обитают, но и образуются.
С учетом выше изложенного задача настоящей работы - с помощью прямой электронной микроскопии уточнить естественный морфологический статус бактерий, которые находятся в воздушном пространстве, на здоровых и кариозных зубах и, следовательно, могут попадать в нижние отделы дыхательных путей, индуцируя инфекционный воспалительный процесс.
Материал и методы
Для реализации поставленной цели были обследованы моляры и премоляры, экстрагированные у 27 пациентов с разной интенсивностью кариозного процесса, и здоровые коронки зубов у 14 лиц без одонто-генной патологии (контрольная группа). Сперва с разных участков удаленных зубов (коронки, кариозные полости и корни) и здоровых коронок с помощью запатентованного устройства [11] готовили препараты-отпечатки. Затем одну часть зубов помещали в 50 мл синтетической солевой среды Сильвермана-Люндгрена (9К) рН 1,8, предназначенной для выделения культур хемолитоавтотрофных бактерий, другую часть - в такое же количество фосфатного буфера рН 7,0 и на протяжение 30 минут отмывали на качалке. После отмывания зубы удаляли, а среду и фосфатный буфер помещали в термостат при температуре 37оС. Мы исходили из того, что для роста гетеротрофных бактерий, вегетирующих на зубах, источником питания и энергии будут вымытые из зубов остатки органических веществ, а для хемолитоавто-трофных видов, если таковые окажутся - закись железа, которая является неотъемлемым компонентом среды Сильвермана-Люндгрена.
Чтобы обнаружить бактерии, находящиеся в воздуха, воспользовались методом седиментации на объектный столик с наклеенной на торец липкой лентой и открытые чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА). Объектный столик и чашки Петри расставляли на высоте 1 м и в течение 24 часов (1440 мин.) выдерживали в различных точках служебных помещений института геологии и природопользования (ИгиП ДВО РАН). Общее количество бактериальных форм и микроскопических грибов в 1 м3 определяли по формуле В.Л. Омелянского [6], несколько видоизменив ее:
х = 5ах102 х103 :10х вх t, где х - количество форм бактерий и грибов в 1м3, а -количество колоний на чашке или структур, визуализированных в поле зрения сканирующего микроскопа, в - площадь чашки или торца объектного столика в см2, t - время экспозиции. Подсчет колоний бактерий проводили через сутки, колоний грибов - на 6-7 сутки. Результаты выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) или визуализированных структур.
Препараты-отпечатки с удаленных зубов, коронок контрольной группы и объектные столики с различными формами микроорганизмов, седиментирован-ных из воздуха, просушивали, напыляли углеродом в вакуумной установке ВУП-4 и просматривали в сканирующих электронных микроскопах JEOL jsm-35C (Япония) или LEO 1420 (Германия). В ряде случаев приготовленные на предметном стекле мазки из материала, содержащего бактерии, окрашивали по Граму и Романовскому-Гимзе.
Такой методический подход предоставлял возможность увидеть естественную морфологию микроорганизмов, содержащихся в воздушной среде, на здоровых или кариозных зубах, определить прочность адгезии бактерий с твердыми тканями зубов и реакцию на состав среды культивирования.
Результаты и обсуждение
Просмотр препаратов в электронном микроскопе показал, что из воздуха служебных помещений на объектный столик оседали единичные сегментированные бактериальные нити (рис. 1 а), единичные палочковидные клетки длиною 0,5-1,0 мкм и сферические структуры диаметром 0,2-0,1 мкм, формой и размерами соответствующие элементарным тельцам (ЭТ) бактерий и микоплазм. В каждом поле зрения количество ЭТ варьировало от 5 до 11 (в 1м3 воздуха от 221 до 486). Одновременно на чашках Петри с МПА вырастали по 4 пигментированных колонии Micrococus spp. и Serratia spp. и по одной колонии различных видов темноокрашенных грибов. При этом концентрация КОЕ бактерий составляла 18/м3, концентрация грибных спор - 5 КОЕ/м3. Следует отметить, что в толще каждой выросшей на МПА бактериальной колонии, ближе к ее краевой зоне, среди обычных клеток располагались ЭТ (рис. 1 б), которые по форме и размерам не отличались от ЭТ, седиментировавших на объектный столик. Таким образом, в 1м3 воздуха служебных помещений ИгиП ДВО РАН доминировали ЭТ, принадлежащие различным бактериальным видам. К сожалению, задачи исследований регламентировали решение вопросов об их жизнеспособности, отличительных биологических признаках, являются ли они колониеобразующими единицами и представляют ли эпидемическую опасность. В то же время, базируясь на одной лишь численности ЭТ, можно предположить, что при дыхании или разговоре именно они способны проникать в носоглотку, полость рта, трахею, бронхи и альвеолы легких. Причем, распространение и перси-стенция ЭТ в этих биотопах должны быть относительно беспрепятственными, чему благоприятствуют структура и известная резистентность L-форм к ли-зоциму, секреторным иммуноглобулинам, фагоцитозу и др. [13, 14].
Спустя 4-ро суток в прозрачной и бесцветной среде 9К, находившейся в термостате, выпал серовато-белый осадок. В фосфатном буфере, который также находился в термостате, изменений не наблюдалось. Электронномикроскопическим исследованием осадка (рис. 1 в), выпавшего в среде 9К, зарегистрированы бесцветные кристаллы, палочковидные бактерии с зауженными концами (полюсами) размером 1-3 х 0,4-0,5 мкм, иногда меньше, пары неразделив-шихся особей, разной величины конгломераты из овальных клеток, отдельно расположенные шаровидные или овальные клетки 0,5-0,8 мкм в диаметре, палочковидные клетки длиною менее 1 мкм (нанопалочки) и отдельные ЭТ. Бактерии сцеплялись друг с другом и кристаллами боковыми поверхностями, ЭТ располагались изолировано как от кристаллов, так и бактерий. Присутствие в осадке неразделившихся клеток свидетельствовало о том, что в среде 9К бактерии росли, развивались и даже реагировали на ее компоненты. Во-первых, это проявлялось выпадением в осадок растворенных в ней солей, во-вторых, нарушением деления бактерий, в-третьих, неодинаковым составом бактериальных структур и разным отношением к окраске - цилиндрические клетки и
1да‘
І I Detector = SE1
Zone Mag = 7.00 К X ЕНТ = 20.00 kV
w . Тої V»
vi'
: ^ ■ .
i
20KU X 1 1 000 407 4 1 . 0U
в
Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия: а - сегментированная бактериальная нить и элементарные тельца (отмечены стрелками), осевшие из воздуха служебного помещения (х7000); б - элементарные тельца и конгломераты неразделившихся клеток в культуре микрококка (отмечены соответственно тонкими и широкими стрелками), седиментированного из воздуха служебного помещения на чашки с мясо-пептонным агаром (х 6840); в - палочковидные бактерии, пары клеток и элементарные тельца (отмечены стрелками), обнаруженные при росте бактерий кариозных зубов на среде Сильвермана-Люндгрена (х 11000).
нитевидные формы окрашивались по Граму, ЭТ - по Романовскому-Г имзе в слабо синеватый цвет. Кроме того, растущая культура не изменяла цвета среды 9К, следовательно, не окисляла закисное железо в окис-ное, а это указывало на отсутствие в кариозных зубах ацидофильных хемолитоавтотрофных бактерий Aс. ferrоoxidans и Ac. thiooxidans. Но на таких зубах распространены другие кислототолерантные виды, которые развивались в аэробных условиях, сохраняли в культуре типичную форму, образовывали и поддерживали контактные взаимодействия с другими клетками и неживым субстратом (кристаллами). Правда, меньшая часть клеток (или отдельные особи) не проявляла заметной коммуникабельности и как результат - нарушение их репродукции, возможно, под воздействием тех же кристаллов.
Электронномикроскопический просмотр препаратов-отпечатков (рис. 2 а, б, в), снятых с эмали, кариозных полостей и корней кариозных зубов и эмали здоровых людей, выявил полиморфные бактериальные микроструктуры: различной длины нитевидные
формы, множественные, неправильных очертаний конгломераты и бесформенные тела размерами от 3x13,3 до 6,3x13,3 - 25x43,7 мкм, ЭТ диаметром от
0,2 до 0,1 мкм, даже меньше, и редкие прямые или изогнутые нанопалочки длиною 0,3-0,5 мкм. Обращало внимание, что в кариозной полости, независимо от ее класса, один конец бактериальных нитей часто закручивался в причудливый «узелок». По нашим данным этот «узелок» - универсальное явление в процессе нитеобразования в неадекватных условиях. Мы констатировали его у нитей Myc. tuberculosis, возникших под влиянием отходов золотодобычи, в крови пациентов, страдающих тяжелыми формами туберкулеза легких, в полости носа здоровых людей и речной воде. Помимо этих изменений в кариозной полости содержались небольшие комплексы, состоящие из обрывков нитей и нанопалочек. Однако характерные палочковидные бактерии, обнаруженные в осадке среды 9К при ее культивировании, в препаратах-отпечатках отсутствовали.
Сопоставление динамики изменений морфологии
бактериальных структур, визуализированных в препаратах-отпечатках, показало, что все они взаимосвязаны между собою и являются закономерным следствием ответных реакций бактерий на антимикробные свойства слюны. В первую очередь, у определенных бактериальных клеток нарушалась координация между ростом и делением, которая завершалась ните-образованием. Впрочем, оно наблюдается довольно часто и в других случаях [13]. В наших же случаях на зубах, особенно кариозных формировалось два типа нитей, зависящих, очевидно, от вида бактерий, степени неоднородности популяции и ее состояния. Одни нити сперва сегментировались, затем частично распадались на мелкие клетки (нанопалочки). Нити другого порядка были гладкими и на одном из полюсов отпочковывали шаровидные клетки. Последние, не разделяясь, формировали крупные конгломераты и бесформенные тела (рис. 2 а, б). Многие шаровидные клетки отделяли дочерние особи (ЭТ), делились неравномерно пополам или в разных направлениях. ЭТ возникали и на поверхности конгломератов и бесформенных тел. Нередко сегментированные нити выполняли одновременно две функции: отщеп-
ляли ЭТ на одном полюсе, шаровидные клетки - на другом (рис. 2 в). Если перечисленные способы репродукции происходили в культурах, то это расценивалось как переход бактерий в новую структуру, лишенную клеточной стенки либо с ее дефектами, иначе, в L-формы [13, 14]. L-формы считаются способом существования бактерий, их индукцию могут вызвать различные биологические агенты, химические вещества и физические факторы, включая лизоцим, пенициллин, цефалоспорин, полимиксин и др. Нами получены L-формы E. coli и Myc. tuberculosis с частичной утратой клеточной стенки под воздействием отходов золотодобычи (рис. 2 г), содержащих высокие концентрации тяжелых металлов, в том числе ртути. Согласно многочисленным литературным источникам [4, 13, 14] L-формы вполне жизнеспособны, могут реверсировать в бактериальные клетки, а их ЭТ способны к регенерации (делению пополам) при наличии в геноме всего лишь 0,2 млн. пар нуклеотидов. Тем не менее, с помощью препаратов- отпечатков и электронной микроскопии нам не удалось визуализировать размножение ЭТ непосредственно в воздухе, на кариозных или здоровых зубах.
V-..
Ч
XI 0000 0106 1 0 U
1 .. -
1
\ 1 . > tmá * W - *
1(jm*
I 1 Detector = SE1
Mag= 6.50 К X ЕНТ= 15.00 kV
в г
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия препаратов-отпечатков: а - бактериальная нить, на которой образуются крупные Ь-тела (отмечены крупными стрелками) и элементарные тельца (ЭТ), отмеченные мелкими стрелками, на эмале кариозного зуба (х 10000); б - Ь-конгломераты (отмечены крупными стрелками), отпочковывающие ЭТ, и обособленно лежащие ЭТ (обозначены мелкими стрелками) в кариозной полосте (х8600); в - формирование конгломерата из шаровидных клеток на одном полюсе (отмечены крупными стрелками) и выброс ЭТ на другом полюсе сегментированного фрагмента бактериальной нити, обнаруженного на эмале здорового зуба (х6500); г - ультрасрез Ь-клеток E.coli. Стрелками отмечены дефекты в клеточной стенке (ПЭМ, х9000).
а
Итак, коронки здоровых и все части кариозных зубов являются местом L-трансформации бактерий. Превращение в L-формы является адаптивной стратегией, предохраняющей бактерии от других конкурирующих видов, но особенно от лизоцима, лакто-ферина, каталазы, пероксидазы, иммуноглобулинов, комплемента и иных агентов смешанной слюны. Вероятно, сильную защиту, механическую прочность и продолжительное выживание обеспечивает L-формам адгезия на твердых тканях зубов. Вместе с тем, некоторые аспекты, касающиеся L-форм, продолжают вызывать интерес, хотя практически все их варианты были тщательно изучены как в опытах in vitro, так и in vivo, в частности при выяснения их роли в патологии [13, 14]. Распространение элементарных телец в таких непохожих местах как воздух помещения, колонии бактерий и макроорганизм свидетельствует об их гораздо большей биологической значимости, чем известно до сих пор. Вполне возможно, что в составе облигантных и транзитор-ных микробов они в качестве симбионтов организма выполняют особые функции - при определенной ситуации могут проникать через пограничные барьеры в кровь, циркулировать в ней, поддерживать развитие органов, их физиологические функции, стимулировать специфические иммунологические реакции или же, наоборот, становиться причиной инфекционного процесса, в том числе участвовать в развитии кариеса зубов.
Субмикроскопические размеры, пластичность и физиологические свойства позволяют элементарным тельцам в отдельности и ассоциациях при незначительных механических, химических и термических раздражениях внедряться в мягкие ткани в местах контакта поверхности зубов, а задолго до обызвествления зубного налета - в канальцевую систему через поры или микропоры. С появлением же кариесогенной обстановки они выходят из латентного состояния и реверсируют в исходные бактерии, которые и запускают цепные реакции. В результате в мягких тканях генерируется воспаление, в твердых - более сложные процессы, приводящие к постепенной обтурации канальцевой системы растущей биомассой бактерий, формированию внутренних и внешних очагов деминерализации и минерализации эмали и дентина. Окончательную деструкцию твердых тканей зубов завершают агрессивные бактериальные экзометаболиты — органические кислоты, ферменты, белки, пептиды, аминокислоты и сероводород, которые разрушают все известные минералы в природных условиях. Конечно, это всего лишь гипотетическая схема, но вопрос об участии ЭТ в развитии кариеса и заболеваний пародон-та заслуживает внимания, так как эти заболевания служат источником распространения инфекции с капельками слюны или слизи на бронхолегочную и другие системы.
Выводы
1. Прямой электронной микроскопией установлено, что в воздухе служебных помещений, на здоровых и кариозных зубах распространены многочисленные бактериальные формы: различные варианты
Ь-форм (шаровидные клетки, их конгломераты, бесформенные тела и элементарные тельца), цилиндрические клетки, нитевидные структуры и субмикро-скопические палочковидные элементы - нанопалочки.
2. Предполагается, что субмикроскопические размеры и пластичность элементарных телец позволяет им инфицировать локусы, недоступные для инвазии бактерий с естественной морфологией, и индуцировать воспалительный и кариозный процесс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бактериальные формы на слизистой оболочке носа у здоровых людей [Текст]/В.М.Катола, Э.В.Хмелькова//Бюл. физиол. и патол. дыхания. -2006.-Вып.22. -Приложение.-С.64-68.
2. Клинико-диагностические аспекты пневмонии [Текст]/Е.В.Никонова, А.Л.Черняев, А.Г.Чучалин// Пульмонология. -1997. -№ 1. -С.60-63.
3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Текст]/А.И.Коротяев, С.А.Бабичев.-СПб.: Спец. Литература, 1998.-580 с.
4. Медицинская микробиология [Текст]/гл. ред. акад. РАМН В.И.Покровский, проф. О.К.Поздеев.-М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999.-1183 с.
5. Медицинская микробиология. Учебник для вузов [Текст]/О.К.Поздеев.-М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.765 с.
6. Микробиота воздуха в помещениях различного назначения [Текст]/Л.Н.Егорова, Ю.А.Климова //Микология.-2006.-Т.40, вып.6.-С.487-493.
7. О наннобактериях [Текст]/М.Б.Вайнштейн,
Е.Б.Кудряшова//Микробиология.-2000.-Т.69, №2.-
С.163-174.
8. Пневмония [Текст]/В.П.Сильвестров,
П.И.Федотов.-М.: Медицина, 1987.-246 с.
9. Справочник по клинической микробиологии [Текст]/В.В. Тец.-СПб.: Стройлеспечать, 1994.-223 с.
10. Техника взятия материала из небольших по площади или труднодоступных участков тела человека для изучения микроорганизмов [Текст]/В.М.Катола, Э.В.Хмелькова, Т.Б.Макеева// Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2004.-Вып.18.-С. 6468.
11. Устройство для топического электронномикроскопического обнаружения Ь-форм бактерий на полипах носа [Текст] : пат. № 2269938 ЯИ: МПК А 61 В 10/00 в 01 N 33/48/авторы и заявители
B.М.Катола, Э.В.Хмелькова; патентообладатель ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН.-№2001125117; заявл. 16.08.04; опубл. 20.02.06, Бюл. №5.
12. Этиология и патогенез внебольничных пневмоний у взрослых [Текст]/М.Н.Зубков//Пульмоноло-гия.-2005.-№ 5.-С.53-60.
13. Ь-формы бактерий (механизм образования, структура, роль в патологии) [Текст]/
C.В.Прозоровский, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1981.-236 с.
14. Ь-формы бактерий и семейство Мусор1а8та1а-сеае в патологии [Текст]/В.Д.Тимаков, Г.ЯКаган.-М.: Медицина, 1973.-С.3-138.
Поступила 26.03.2008
