CC BY
49
УДК 579.23+579.22:616.157:616.24-002.5 В.М.Катола
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЖИЗНИ НА НИТЕОБРАЗОВАНИЕ У БАКТЕРИЙ
Институт геологии и природопользования ДВО РАН, Благовещенск РЕЗЮМЕ
В организме здорового и больного человека, воздухе, речной воде, опытах in vitro с Myc. tuberculosis индуцируются разных размеров нитевидные бактериальные формы. Они дифференцируются на сегментированные, несегментированные и комбинированные, образующие или не образующие на полюсе петли (узлы). Каждый тип бактериальных нитей в организме человека продуцирует различающиеся между собою микроскопические и субмикроскопические клетки и конгломераты. Нити и их продуценты могут использоваться с прогностической и дифференциальнодиагностической целью.
Ключевые слова: туберкулез, гетероморфизм бактерий, бактериальные нити.
SUMMARY
V.M.Katola
THE INFLUENCE OF LIFE CONDITIONS ON BACTERIA THREAD FORMING
Thread bacterial forms of a different size induce themselves in the body of a healthy and sick person, in the air, river water, tests in vitro with Myc. tuberculosis. They can be classified into segmented, non-segmented and combined, forming and non-forming knots at the pole. Each type of bacterial threads in the human body produces different from each other microscopic and sub-microscopic cells and conglomerates. The threads and their producers can be used with the prognostic and differentially-diagnostic aim.
Key words: tuberculosis, bacteria heteromorphism, bacterial threads.
В 1894 году Н.Ф.Гамалея обнаружил, что клетки холерного вибриона в среде, содержащей соли лития, приобретают форму спирилл, шаров, нитей. Это явление он назвал гетероморфизмом. В дальнейшем было установлено, что гетероморфные изменения
характерны для бактерий различных систематических групп и обычно появляются при кратковремен-
ном воздействии физических, химических и биологических факторов. Индуцированные морфологические вариации чрезвычайно разнообразны, кроме того, они могут быть временными, то есть, быстро реверсировать в первоначальные клетки, и необратимыми [4]. Некоторые из них происходят особенно часто. К подобным изменениям относится так называемый несбалансированный рост, когда в экстремальной ситуации у бактерий сохраняется способность к росту (согласованному увеличению размеров и массы цитоплазмы за счет синтеза клеточного материала - ДНК, РНК, белка и др.), но при этом их деление нарушено. В таких случаях клетки превращаются в прямые либо извитые нити. Например, трансформация кишечной палочки в нитевидную форму возникает под влиянием пенициллина, Вас. brevis - при пониженной температуре в естественных условиях и т.д. [6]. В природной и антропогенной среде бактериальные нити встречаются довольно часто. Нами они были выявлены непосредственно в многолетних техногенных отходах золотодобычи, горных выработках из зоны вечной мерзлоты, в почве и речной воде. Для них характерны различные размеры: одни были широкими, другие - тонкими, изогнутыми либо ветвистыми. Одновременно с нитями часто встречались морфотипы, представляющие собою неодинаковой величины микроскопические и субмикроскопические палочковидные и шаровидные клетки, крупные клеточные агрегаты, бесструктурные массы и элементарные тельца. Подобные морфо-типы визуализированы у мышей, инфицированных штаммом H37Rv микобактерий туберкулеза, и больных с прогрессирующим туберкулеза легких [1, 5].
Однако с удалением индуцирующих факторов ге-тероморфные изменения у бактерий чаще исчезают. Широкое распространение гетероморфных проявлений в природной среде и организме человека продолжает вызывать интерес у исследователей. Во-первых, нитевидные формы, а также сферопласты и протопласты, которые появляются при действии факторов, частично или полностью подавляющих синтез клеточной стенки, считаются потенциальными предшественниками L-форм бактерий [6]. Во-вторых, до конца не выяснены биологические свойства и ультраструктура «реактивных» клеток, переходящих в ту
или иную гетероморфную форму, участие, в первую очередь бактериальных нитей в сохранении вида и гетерогенности популяции, степени опасности для здоровья человека и пр.
Учитывая изложенное, целью настоящей работы явилось выделение и описание нитевидных форм, которые образуются бактериями различных таксономических групп в лабораторных условиях, окружающей среде и организме человека, выявление у них индивидуальных черт. Интересно было бы знать критерии, позволяющие судить о жизнеспособности бактериальных нитей, их морфологических особенностях в здоровом и больном организме, перспективу использования нитеобразования в дифференциальной диагностике бронхо-легочной и другой патологии.
Материал и методы исследования
Для обнаружения бактериальных нитей в природных условиях и организме человека мы использовали метод отпечатков в двух модификациях: в первой
модификации на торец объектного столика электронного микроскопа наклеивали ленту с клейкой наружной поверхностью и наносили на нее 0,1 мл речной воды или плазмы крови, взятой из локтевой вены доноров и больных различными формами туберкулеза легких. Во второй модификации препараты-отпечатки готовили с помощью специального устройства [3], которое прикладывали к слизистой носа здоровых и больных людей, полости экстрагированных кариозных зубов или к поверхностной колонии Mycobacterium. tuberculosis (штамм H37Rv), растущей в закрытой системе на искусственной солевой среде Сотона в присутствии образца из многолетних отходов шлихо-обогатительной установки (ШОУ), используемой для добычи россыпного золота. Все препараты-отпечатки просушивали, напыляли углеродом в вакуумной камере ВУП-4 и просматривали в двух сканирующих электронных микроскопах -JEOL jsm- 35 C (Япония) и LEO 1420 (Германия). Достоинство предложенного метода отпечатков состоит в том, что он предоставляет достоверную информацию о взаиморасположении нативных бактерий в местах обитания, их форме, размерах в длину и поперечнике.
Результаты исследования
На рис. 1 продемонстрированы бактериальные нитевидные структуры, выделенные нами из различных источников. По нашему мнению, эти структуры прямо отражают естественную готовность не только вида, но и отдельных групп «реактивных» клеток популяции, отличающихся своими биологическими свойствами от остальных, претерпеть морфологические изменения в кратковременных неблагоприятных условиях. При этом несбалансированный рост каждой клетки указанной группы может начинаться в разное время, а если учитывать еще неоднородность популяции по возрасту особей, то различной будет и скорость трансформации их в нити. Но несмотря на многообразие причин,
способных индуцировать нитеобразование у бактерий, в том числе и естественное старение микробных клеток, в конечном итоге постоянно формируется несколько четко дифференцированных типа нитей: 1 -сегментированные с сужениями и вздутиями вдоль контура и светлыми перемычками по ширине; 2 - не-сегментированные; 3 - комбинированные. Последний тип интересен тем, что у него часть нити находится в сегментированном состоянии, другая же часть сохраняет ровную гладкую поверхность. В свою очередь, среди сегментированных и несегментированных нитей нам удалось обнаружить варианты, отличающиеся тем, что на одном из их полюсов «завязывались» разной величины и формы петли (узлы). Поверхность петли (узла) соответствовала структуре поверхности остальной части нити. Согласно нашим исследованиям in vitro самую маленькую петлю формируют нити микобактерий туберкулеза (штамм H37Rv) в составе колонии, растущей на питательной среде Сотона в присутствии техногенного образца из отходов ШОУ, самую крупную петлю - бактериальные нити, найденные в кариозной полости и речной воде. Разумеется, это не окончательные выводы. Приведенное разделение нитей достаточно условно, базируется всего лишь на электронномикроскопических данных и может быть предметом дискуссии. Но оно удобно, к тому же указывает на существование разнообразных форм несбалансированного роста бактерий, поэтому их дальнейшее изучение целесообразно.
Изогнутые сегментированные нити без петель (узлов) обнаружены нами в воздухе служебных помещений, нити с петлеобразованием - на слизистой носа у здоровых людей (рис. 1 а) и в колонии микобактерий туберкулеза (рис. 1 г, д). Самыми длинными оказались нити микобактерий. Несегментированные нити постоянно находились на слизистой носовых ходов, такие же варианты с петлей на одном конце выявлялись в полостях кариозных зубов человека (рис. 1 б) и в речной воде (рис. 1 ж). В плазме венозной крови у больных инфильтративным (рис. 2 а), диссеминированным (рис. 2 б) и фиброзно-кавернозным туберкулезом легких (рис. 2 в, г) содержались, как правило, прямые или в той или иной степени изогнутые несегментирован-ные нити, которые не имели петель. Комбинированный тип нитей был довольно редким - в незначительном числе он встретился нам лишь при просмотре препаратов-отпечатков со слизистой носа у лиц, страдающих одновременно полипозным риносинуситом и бронхиальной астмой (рис. 1 в). В плазме доноров описанные микроструктуры несбалансированного роста бактерий не обнаружены, тем не менее, в ней содержатся единичные сферические тельца размером
0, 15- 0,3 мкм, обрывки клеточных мембран и др.
Из-за сложности выделения бактериальных нитей из среды обитания и вариабельного морфогенеза сказать что-либо определенное об организации их клеточной стенки нельзя, тем более, что мы не изучали их цитологическую картину.
\
С/
V
Zone Mag
1 pm*
I--------1
6.85 KX
\
>
V
!0KV X7800 0219 1.0U
20nm* Mag = 9.00 К X WD= 9 mm Detector = SE1
1
V и
|1иггГ Mag = 5.00 К X Detector = SE1
г д ж
Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия бактериальных нитей, образующих петли (излы) на одном полюсе: а - сегментированная нить на слизистой носа здорового человека (стрелками указаны места обрыва нити, х6850); б - фрагмент («петля») несегментированной нити в кариозной полости (стрелками отмечены места обрыва нити, х7800); в - комбинированная нить на слизистой носа при полипозном риносинусите (тонкими стрелками отмечены места почкования, крупной стрелкой - сегментированный участок). Вокруг нити множество элементарных телец (х7000); г-д - сферопласты, шаровидные клетки и сегментированные нити в культуре микобактерий И37Ку (х7800 и х7200, соответственно); д - несегментированная нить, обнаруженная в речной воде (х5000).
Но по имеющимся сведениям [4, 6] клеточная стенка у нитей может иметь дефекты. Не совсем ясен и процесс сегментации нитей в измененных условиях существования. Скорее всего, сегментация обусловлена нарушением сложного изоморфного деления клеток, в результате чего врастание цитоплазматической мембраны внутрь клетки после окончания репликации ДНК не завершается. Что касается несег-ментированных («гладких») нитей, то их появление может быть вызвано не регламентируемым ростом клетки в длину при неизмененном ее поперечнике.
В 50-е годы прошлого столетия М.А. Пешков [4] впервые разграничил явление полиморфизма на естественное и насильственное. Непременным условием превращения бактериальных клеток в гетероморфные in vitro и in vivo является присутствие в искусственной или естественной среде обитания индуцирующих агентов (колебаний рН и температуры, солей тяжелых металлов, сублетальных доз антибиотиков и др.). Следовательно, нитевидные структуры необходимо рассматривать как следствие вынужденной защитной реакции клеток, которая реализуется в течение неблагоприятного воздействия среды на популяцию. Действительно, все типы нитей, представленные на-
ми, возникли под влиянием неспецифических антибактериальных факторов, содержащихся в слизистой носа, слюне и плазме крови (лейкоцитарные ферменты, лизоцим и пр.), либо токсического комплекса среды Сотона (тяжелых металлов, выщелоченных из минералов, новообразованных солей, бактериальных экзометаболитов и др.), токсичных элементов, находящихся в речной воде, в частности ртути или экстремальных воздушных условий (метеорологических, сезонных и т.д.). Сразу же необходимо отметить, что в преобразовании бактерий, попавших в организм человека, вместе с неспецифическими агентами активное участие принимают иммунные реакции.
Следующим отличительным признаком анализируемых бактериальных морфотипов является их отношение к физическим воздействиям. С самого начала выявления сегментированных нитей обращала внимание их непрочность и склонность к разрывам в любом месте по длине, чаще выше петли-узла. Кроме того, они могли распадаться на мелкие (менее 1 мкм) цилиндрические или овальные клетки. Такие клетки обычно жизнеспособны и обладают репродуцирующими свойствами [6]. Нарушение же целостности самих узлов нами не регистрировалось. Эти факты
представляют несомненный интерес. Можно предполагать, что «завязывание» петель (узлов) у сегментированных нитей или их отсутствие у несегментиро-ванных в значительной степени связано с биологическими свойствами вида и индивидуальными характеристиками популяций. Наконец, не исключено, что петли (узлы) выполняют какую-то еще неизвестную роль, направленную на сохранение вида, поддержание его жизнестойкости и распространения. В некотором роде доказательство тому - «узлообразование» в сильно различающихся экологических системах: на слизистой носа практически здоровых людей, в полостях кариозных зубов, речной воде.
В свою очередь, имеющиеся в нашем распоряжении данные, несмотря на убедительную наглядность, также оказались недостаточными для объяснения, почему в крови у пациентов инфильтративной, диссеминированной и фиброзно-кавернозной формами туберкулеза легких образуются одни лишь несегмен-тированные бактериальные нити, причем, без петель (узлов). Более того, не доказана генетическую принадлежность этих нитей к микобактериям туберкулеза, а не к смешанной инфекции, которая на различных этапах может в ряде случаев осложнять течение и исход туберкулезного процесса. Особенно в далеко зашедших случаях. Как известно, инфицирование
ослабленных морских свинок фильтратами микобактерий туберкулеза способствует усиленной регенерации возбудителя и циркуляции в крови. Тем не менее, диагностировать бактериемию даже у ослабленных больных туберкулезом легких удается не всегда. Собственные клинико-экспериментально исследования [1] убеждают нас, что циркулирующие в крови бактериальные нити представляют собою не что иное, как трансформированные клетки микобактерий туберкулеза. Следовательно, эти нити являются маркерами бактериемии, которая не выявляется обычным бактериологическим исследованием, но констатируется сканирующей электронной микроскопии.
В связи с появлением в крови больных туберкулезом легких бактериальных нитей значительный общебиологический интерес вызывает их жизнеспособность и функция. Из рис. 2 видно, что они продуцируют на поверхности, не исключено, и внутри цитоплазмы своеобразные сферические тельца размером
0,1-0,25 мкм, шаровидные клетки диаметром 0,4-1,0 мкм и более и конгломераты, сгруппированные из шаровидных клеток (рис. 2). По величине, форме, структуре и атипичному делению (чаще почкованию), наблюдаемому у некоторых из них, эти гете-роморфные формы были похожи на элементарные тельца и прочие клетки популяции Ь-форм бактерий.
в г
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия несегментированных бактериальных нитей в плазме крови: а - нить, образующая конгломерат на поверхности (отмечен крупной стрелкой) и ЭТ (отмечены мелкими стрелками) у больного инфильтративным туберкулезом легких, осложненным экссудативным плевритом (х3000); б - множество нитей, отпочковывающих крупные агрегаты, шаровидные клетки и ЭТ у больного диссеминированным туберкулезом легких (х1300); в-г - нити с почкующимися на поверхности и отдельно лежащими элементарными тельцами (ЭТ) и конгломератами (отмеченными стрелками) у больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких (х 10000).
Судить же о структуре их клеточной стенки, роли в жизненном цикле, продолжительности жизни непосредственно в крови либо других органах - в задачу настоящей работы не входило. Зато имелась уверенность, что крупным образованиям свойственен полноценный геном, значит, и способность к размножению и депонированию в организме. По возрастающему числу нитей и интенсивности образования ими Ь-подобных элементов можно было прогнозировать исход туберкулезного процесса. К сожалению, чем больше просматривается в плазме бактериальных нитей, сферических клеток и их конгломератов, тем сомнительней эффективность химиотерапии и выздоровление пациента.
Помимо крови больных туберкулезом легких регулярное почкование элементарных телец и сферических клеток гораздо большего диаметра в цитоплазме, на поверхности и одном полюсе мы постоянно наблюдали у сегментированных, несегментированных и комбинированных бактериальных нитей, которые были визуализированы нами на слизистой и полипах носа у здоровых лиц и страдающих полипозным риносинуси-том [2].
Хорошо известно, что условия окружающей среды оказывают огромное влияние на форму, рост и распространение микроорганизмов. Особенно губительно действуют на них высокие концентрации ионов тяжелых металлов, антибиотиков, антисептических и многих других факторов. В небольших дозах они не вызывают их гибели, но считаются стрессорами, поскольку заставляют бактерий включать специальные метаболические механизмы, необходимые для выживания. Поэтому приходиться признать, что в местах, где происходит нитеобразование, условия жизни для бактерий относительно щадящие. Более сильные воздействия всегда приводят к летальному исходу.
Итак, кратковременные взаимоотношения бактерий с неадекватной средой обитания заставляют клетки популяции перейти на соответствующую стадию жизненного цикла и вырабатывать приспособительные механизмы. И это проявляется конкретным типом нитеобра-зования. У остальных вегетативных клеток, которые отличаются физиологическим состоянием и биологической реакцией на действие стрессоров, нитеобразование не происходит, зато они могут сохранять свою форму и структуру стабильной или трансформироваться в сфе-ропласты и протопласты. Множественный характер нитеобразования у бактерий в эксперименте и клинических условиях, позволяет прийти к следующему заключению - микроскопические размеры, форма, структура поверхности, наличие или отсутствие петель (узлов) совокупнно указывают на возможность использования этого явления в дифференциально- диагностических и прогностических целях.
Таким образом, превращение бактерий в нити не ограничивается лишь несбалансированным ростом и делением бактериальной клетки в стрессорной обстановке. Как представляется нам, оно одновременно отражает и переход индивидуальной группы клеток в закономерное морфо-физиологическое состояние, необходимое для поддержания жизнеспособности и сохранности вида, реконструкции неоднородности бак-
териальной популяции, причем, путем продуцирования клеточных форм с новыми свойствами. Но так как истинное назначение нитевидных форм малоизвестно, то для более полной информации требуются сравнительные и детальные изучения их биологических вариаций, распространения, структурной организации, химизма и типа обменных процессов, антигенной специфичности (видовой и типовой), особенностей орга-нотропности, поведения и персистенции в чувствительном и резистентном организме, роли в соматической и не уточненной инфекционной патологии.
Выводы
1. С помощью сканирующей электронной микроскопии впервые установлено, что в воздухе, воде, колонии Myc. tuberculosis, растущей в экстремальной среде, в организме здорового и больного человека постоянно образуются различных размеров и формы нитевидные бактериальные структуры. Они дифференцируются на сегментированные, несегментиро-ванные и комбинированные, с наличием или отсутствием петель (узлов) на одном полюсе.
2. В организме больных туберкулезом легких или полипозным риносинуситом каждый тип бактериальных нитей продуцирует различающиеся между собою микроскопические и субмикроскопические сферические клетки и их агрегаты, обеспечивающие, по-видимому, выживание и сохранность вида, реконструкцию неоднородности популяции и пр.
3. Микроскопические размеры, форма и структура бактериальных нитей, присутствие или отсутствие у них петель (узлов) в своей совокупнности могут найти применение в дифференциально- диагностических и прогностических целях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Индукция L-форм микобактерий туберкулеза и их электронномикроскопическая визуализация in vitro и in vivo [Текст]/Катола В.М. [и др.]//Бюл. физиол. и патол. дыхания. -2005. -Вып. 21. -С.75-77.
2. Техника взятия материала из небольших по площади или труднодоступных участков тела человека для изучения микроорганизмов [Текст]/В.М.Катола, Э.В.Хмелькова, Т.Б.Макеева// Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2004.-Вып.18.-С.64- 68.
3. Устройство для топического электронномикроскопического обнаружения L-форм бактерий на полипах носа [Текст] : пат. № 2269938 RU: МПК А 61 B 10/00 G 01 N 33/48/авторы и заявители В.М.Катола, Э.В.Хмелькова; патентообладатель ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН.-№2001125117; заявл. 16.08.04; опубл. 20.02.06, Бюл. №5.
4. Цитология бактерий [Текст]/М.А.Пешков.-М.; Л., 1955, изд-во АН СССР.-220 с.
5. Электронномикроскопический анализ морфофизиологического состояния бактерий в местах колонизации [Текст]/ Катола В.М. [и др.]//Бюл. физиол. и патол. дыхания. -2005. -Вып. 21.-С.79-83.
6. L-формы бактерий [Текст]/С.В.Прозоровский, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1981.-236 с.
Поступила 10.04.2008
