CC BY
22
я
ТЕХНИКА ОПЕРАТИВНОГО ВМЕШАТЕЛЬСТВА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЯЗВЕННОГО КОЛИТА НИСХОДЯЩЕГО ОТДЕЛА ТОЛСТОЙ КИШКИ У КРЫС ЛИНИИ «WISTAR»
КимА. Д., Лепехова С. А., Чашкова Е. Ю., ГольдбергО. А., ШедоеваЛ. Р.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Иркутский научный центр хирургии и травматологии
TECHNOLOGY SURGICAL INTERVENTION IN ULCERATIVE COLITIS MODELING DESCENDING PART OF THE COLON IN RATS LINE «WISTAR»
Kim A. D., Petuhova S. A., Chashkova Ye. YU., Gol'dberg O. A., Shedoeva L. R. Federal State Scientific Institution Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology
Ким Андрей Денсунович — младший научный сотрудник ФГБНУ ИНЦХТ; врач-хирург
Лепехова Светлана Александровна — доктор биологических наук, заведующая научным отделом экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ ИНЦХ; главный научный сотрудник отдела медико-биологических исследований и технологий ИНЦ СО РАН, ассистент кафедры госпитальной хирургии ИГМУ
Чашкова Елена Юрьевна — кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией реконструктивной и восстановительной хирургии ФГБНУ ИНЦХТ; врач-колопроктолог
Гольдберг Олег Аронович — кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник научно-лабораторного отдела ФГБНУ ИНЦХТ
Шедоева Людмила Руслановна — младший научный сотрудник ФГБНУ ИНЦХТ; врач-колопроктолог, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Иркутский научный центр хирургии и травматологии, Российская Федерация, Научный отдел экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ «ИНЦХТ»
Kim Andrey Densunovich- Junior Researcherther, the Federal Government Scientific Research Institution, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, surgeon
Lepekhekova Svetlana Aleksandrovna — Sc. D., Head of scientific department of experimental surgery and vivarium, the Federal Government Scientific Research Institution, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology. Chief Researcher of microbiological research and technology of Irkutsk Scientific Center, East Siberian Research Centre, Academy of Science. Assistant of the Department of hospital reconstructive surgery, Irkutsk State Medical University.
Chashkova Elena Yuryevna — PhD, Head of Laboratory of Reconstructive and Restorative Surgery, the Federal Government Scientific Research Institution, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, surgeon-coloproctologist. Goldberg Oleg Aronovich — PhD, Leading Researcher, Research and Laboratory Department, the Federal Government Scientific Research Institution, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology.
Shedoeva Lyudmila Ruslanovna- Junior Researcherther, the Federal Government Scientific Research Institution, Irkutsk Scientific Center of Surgery and Traumatology, surgeon-coloproctologist.
Резюме:
Язвенный колит (ЯК) — это хроническое иммунное негранулематозное воспалительное заболевание толстой кишки неясной этиологии. Страдают молодые люди детородного возраста. Во всем мире зарегистрировано увеличение заболеваемости и развитие тяжелых форм язвенного колита, приводящих к инвалидности и снижению качества жизни пациентов. Изучение механизмов патогенеза и этиологии этого заболевания способствует разработке новых эффективных методов лечения.
Цель исследования: Разработать технику оперативного вмешательства, направленного на индукцию обратимого ишемического повреждения стенки нисходящего отдела толстой кишки у крыс линии «WISTAR», с формированием язвенных дефектов и стандартизацией получаемого результата.
Материалы и методы: экспериментальное исследование выполнено с использованием крыс-самцов линии «Wistar» (n = 40), возрастом более 6 месяцев, массой тела 280 - 350 г. Животные распределены на три группы: 1 группа — (n = 14) оперативное вмешательство по Шалимову С. А.; 2 группа (n=16) — моделирование с использованием
Ким Андрей Денсунович
Kim Andrey D.
664003, Иркутск,
ул. Борцов Революции, д. 1
* Иллюстрации кстатье — на цветной вклейке в журнал.
оригинальной технологии; 3 группа (n=10) — индукция язвенного колита по Cooper H. S. Наблюдение проводилось в течение 10 суток. Нами предложена оригинальная техника оперативного вмешательства: пристеночное наложение лигатур на все прямые сосудистые ветви нисходящего отдела толстой кишки крысы протяженностью 3 см вдоль кишечной стенки, от уровня основания мочевого пузыря, с последующим пересечением. В послеоперационном периоде подопытным животным давали 1% раствор декстрана сульфата натрия на протяжении 7 суток. Результаты оценивали проведением гистологических исследований биоптатов стенки толстой кишки.
Результаты: получено эрозивно-язвенное поражение стенки толстой кишки крысы, сопровождающееся продуктивным воспалением, васкулитом с плазматическим пропитыванием стенок сосудов и утолщением интимы.
Заключение: предложенная техника оперативного вмешательства позволяет получить модель язвенного колита в эксперименте и может быть использована для разработки и апробации новых методов изучения и лечения исследуемой патологии.
Ключевые слова: язвенный колит, нисходяшая кишка крысы, техника операции
Summary:
Background: Ulcerative colitis (UC) is a chronic immune inflammatory condition of the colon with an unknown aetiology, leading to disability and reduced quality of life of patients. UC primarily affects young adults. In most cases, inflammatory bowel disease (IBD) debuts at reproductive age. The incidence of UC and severe clinical course has increased overall across the world. The study of the mechanisms of pathogenesis and aetiology of this disease contributes to the development of new effective methods of treatment.
Objective: The aim of our study was to develop technology of the surgery directed to induction of reversible ischemic damage, the erosive-ulceration of gut mucosae (descending colon) at rats of the WISTAR line.
Materials and methods: Experimental research was done using male rats «Wistar» (n=40), their age was more than 6 months, weight of body is 280 - 350 grams. The animals were separated into 3 groups: 1 — (n=14) Sholimov's operative method, 2 group (n=16) — model using special technology, 3 group (n=10) — Coopr's H. S. induction ulcerative colitis. Observation was been done during 10 days. We offered special surgical technique: parietal ligation on every vasa recta of colon descendens of rats the length 3 cm along colon, on the apex vesicae and then vasa recta are cut. Then during 7 days 1%% solution of dextran sulfate sodium (DSN) was given for experimental animals after postoperative period. By the histological biopsy of colon mucosa the results were estimated.
Results/Conclusion: we have created erosive-ulceration of gut mucosae (descending colon) of rat with productive inflammation, vasculitis and plasmatic impregnation of the vessel walls and intimal thickening. Our model of ulcerative colitis can be used for the development and testing of new methods for the study and treatment of this pathology.
Key words: ulcerative colitis, descending colon of rats, technology of the surgery
Введение
Язвенный колит (ЯК) — это хроническое иммунное негранулематозное воспалительное заболевание неясной этиологии, поражающее слизистую оболочку прямой кишки и непрерывно распространяющееся по ободочной кишке до различных уровней, характеризуется рецидивирующим течением [1]. В последние десятилетия отмечается стремительный рост воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) во всем мире, включая индустриально развитые страны, где тенденция роста наиболее высока. [Я. БоуараИ, 8а18апд1, 2015]. Возрастание тяжелых форм язвенного колита улиц молодого трудоспособного и детородного возраста обусловливает социальную и практическую значимость разработки новых эффективных методов лечения этого заболевания и изучения механизмов патогенеза.
Одним из ведущих методов в исследовании патологических процессов является экспериментальное моделирование, которое позволяет изучать механизмы заболевания и способы воздействия на ключевые звенья патогенеза
Модель с использованием декстрана сульфата натрия (ДСН) является одной из самых популярных
и широко используемых моделей для индукции язвенного колита благодаря простоте использования и воспроизводимости результатов. ДСН — это водорастворимый, негативно заряженный сульфа-тированный полисахарид, состоящий из декстрана и сульфатированной ангидроглюкозы (Ishioka et al., 1987). У животных, подвергшихся воздействию декстрана сульфата натрия, наблюдается потеря веса, жидкий стул и кровотечение в прямой кишке. При гистологическом анализе в кишечнике выявляют эрозии подслизистой основы, истощение клеток Гоблетта, язвы, инфильтрацию воспалительными клетками и гиперплазия (Huang et al., 2010). Точный механизм, благодаря которому ДСН вызывает воспаление кишечника, до сих пор не ясен. Возможно, колит, опосредованный воздействием ДСН, развивается из-за токсичности этого вещества для эпителия толстой кишки, в результате чего нарушается его барьерная функция (Poritz et al., 2007). Транслокация бактерий в системный лимфо -и- кровоток способствует синтезу воспалительных цитокинов и развитию воспаления. Кроме того, антикоагулянтное действие ДСН усугубляет кишечное кровотечение.
Недавно было показано, что ДСН формирует в толстой кишке нано-липокомплексы с цепочками жирных кислот MCFAs (medium-chain-length fatty acids) (Laroui et al., 2012). Специфичность эффекта воздействия ДСН исключительно натолстую кишку может быть связана с активной абсорбцией электролитов в присутствии многочисленных бактерий именно в этом отделе. [2,3].
Использование ДСН — модели позволяет получить эрозивное повреждение слизистой оболочки толстой кишки без формирования язвенных дефектов, которые характерны для клинического течения язвенного колита. В качестве подопытных животных наиболее часто используют крыс линии «Wistar» [2]. При использовании
гаптен — индуцируемых моделей, для повышения степени повреждения в стенке толстой кишки, на слизистую оболочку подопытных животных воздействуют 70% раствором этилового спирта или 5 - 25% уксусной кислотой. Применение этих веществ оказывает изолированное воздействие на слизистую оболочку стенки толстой кишки, не затрагивая другие слои [3]. Цель нашего исследования: разработать технику оперативного вмешательства, направленного на индукцию обратимого ишемического повреждения стенки нисходящего отдела толстой кишки крысы, с формированием язвенных поражений, приближенных к клиническому течению заболевания и стандартизацией получаемого результата.
Материалы и методы
Проведено рандомизированное исследование с использованием метода случайной выборки.
Критерии включения в исследование — крысы самцы линии «Ш181аг» в возрасте от 6 до 8 месяцев, массой тела 280 - 350 г.
Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 № 000360 от 30 апреля 2013 г., служба ветеринарии Иркутской обл.) по утвержденным стандартным операционным процедурам [4]. Все оперативные вмешательства
проводили в стерильных условиях под общим обезболиванием.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации через 3, 7 и 10сут.
После выведения животных из эксперимента производили взятие фрагмента биоптата толстой кишки, вскрывали вдоль стенки, фиксировали иглами к плотному картону и помещали в 10% раствор формалина. Срезы после депарафини-зации окрашивали гематоксилином и эозином. Оценку гистологического исследования выполняли методом световой микроскопии
Результаты
В рамках разработки техники оперативного вмешательства, направленного на индукцию обратимого ишемического повреждения стенки толстой кишки с формированием язвенных поражений стенки толстой кишки, приближенных к клиническому течению заболевания и стандартизацией получаемого результата на первом этапе нами была воспроизведена модель по Шалимову.
Известный способ моделирования тотального ишемического некроза толстой кишки у экспериментальных животных выполняли путем перевязки краниальных и/или каудальных брыжеечных артерий, вен и их ответвлений [5].
Первые признаки инфаркта кишечника появляются через 10 - 15 минут после перевязки сосудов, а полностью развиваются в течение 6-ти часов. При перевязке артерии, непосредственно отходящей от основного ствола, летальный исход наступает через 24 - 30 часов после операции. Одновременная перевязка брыжеечных артерии и вены также ведет к гибели животного через 4 - 5 часов.
Авторами был проведен эксперимент по получению модели по вышеописанному способу на подопытных животных 1 группы. Выведение животных проводили на 3 и 7 сутки. Результат эксперимента показал, что при перевязке сосудов по данной методике в 71,5% случаев, на 7 сутки макроскопически был выявлен некроз кишки (рис. 1); при гистологическом исследовании — некроз кишечной стенки
без формирования язвенных дефектов (рис. 2). В 29,5% макроскопических и гистологических изменений не было.
На основании этого сделан вывод, что данная модель не позволяет изучать изменения в стенке толстой кишки в динамике исследования, т. к. смоделированная патология заканчивается либо смертью экспериментального животного из-за большого участка некроза кишки, либо выздоровлением без признаков хронического воспаления в зоне ишемии. Модель сложно стандартизировать по полу, возрасту и весу используемых лабораторных животных — собак, в том числе из-за особенностей кровоснабжения кишечника у этих животных. Отсутствует стандарт оперативного вмешательства, не указаны размеры участка перевязки сосудов.
Одним из самых известных методов моделирования язвенного колита у самцов крыс линии «'Ш81аг» является пероральное введение 5% водного раствора декстрана сульфата натрия [6,7]. Модель воспроизводили на подопытных животных 3 группы. Ежедневно измеряли вес животных и количество выпитого раствора декстрана сульфата натрия, а так же регистрировали наличие или отсутствие диареи и крови в кале животных. Из эксперимента животных выводили на 3 и 7 сутки исследования. После эвтаназии проводили гистологические исследования. Повреждение толстой кишки
развивалось на 3-и сутки; максимальные проявления повреждения толстой кишки наблюдали к 7-м суткам. При макроскопическом исследовании на 7-е сутки выявлено повреждение толстой кишки с гиперемией, отеком и кровоизлияниями в слизистой оболочке, отеком кишечной стенки.
При воспроизведении модели авторами на подопытных крысах (группа 3) к 7 суткам получено невыраженное воспаление в слизистой оболочке толстой кишки (рис. 3а, рис. 3б). При гистологическом исследовании на светооптическом уровне — язвенных дефектов, характерных для воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), не выявлено, изменения в стенке толстой кишки оказались минимальными и не соответствовали таковым в клинике. Отмечали общее угнетение состояния животных, не связанное с повреждением кишки. Экспериментальные данные авторов свидетельствуют о том, что к 7-м суткам эксперимента изменений в стенке толстой кишки не выявлено.
Исходя из изложенного, к недостаткам известного способа моделирования следует отнести отсутствие язвенных поражений слизистой оболочки, отсутствие васкулита, что выявляют при морфологическом исследовании биоптатов толстой кишки пациентов, страдающих ЯК. Морфологическим субстратом ВЗК является неспецифическое иммунное воспаление в стенке кишки с плотной инфильтрацией лимфоцитами и плазматическими клетками. Показателем неспецифического иммунного воспаления является васкулит, обусловленный оседанием иммунных комплексов в стенках сосудов с последующим образованием циркулирующих иммунных комплексов.
Сучетом полученных недостатков применяемых моделей, нами разработана оригинальная техника оперативного вмешательства для моделирования язвенного колита. Под общим обезболиванием выполняли нижне-срединную лапаротомию, в операционную рану выводили петли тонкого кишечника (рис. 4 - 1), слепую кишку и червеобразный отросток с отведением в левую сторону. Половые железы (рис. 4 - 2) и мочевой пузырь (рис. 4 - 3) отводили книзу с укрытием стерильным перевязочным материалом, обильно смоченным 0,9% раствором ЫаС1.
После доступа и освобождения нисходящей части толстой кишки (рис. 4 - 4), выделяли
аорту (рис. 5 - 1), каудальную брыжеечную артерию (рис. 5 - 2), ее главные ветви: левую артерию толстой кишки (рис. 5 - 3) и краниальную прямокишечную артерию (рис. 5 - 4). Далее выделяли прямые пристеночные ветви (рис. 5 - 5) этих артерий с сопровождающими венами на протяжении 3 см проксимальной части прямой кишки (рис. 5 - 6) и нисходящего отдела толстой кишки (рис. 5 - 7) от основания мочевого пузыря. Нитью (пролен 6,0) (рис. 5 - 8) с применением микрохирургической техники проводили лигирование всех прямых ветвей на протяжении 3 см с последующим их пересечением. Нить проводили в бессосудистых областях, продольно оси толстой кишки, с захватом прямой артерии, вены, лимфатических сосудов, нервов в один узловой шов. Один шов накладывали вблизи кишечной стенки, без захвата последней, второй в 2 - 3 мм от кишечной стенки, после чего сосудисто-нервный пучок пересекали. Левую артерию толстой кишки с нижней каудальной брыжеечной веной нитью перевязывали проксимально, краниальную прямокишечную артерию с той же веной (рис. 5 - 9) — дистально от участка ишемизации, с последующим пересечением (рис. 5). Окончательный вид операции представлен на (рис. 6). Восходящую часть толстой кишки, половые железы, мочевой пузырь, слепую кишку, петли тонкого кишечника укладывали в брюшную полость, после чего проводили послойное ушивание раны.
В последующем животных содержали в боксах по 6 особей. Подопытные животные имели свободный доступ к пище и водному раствору 1% декс-трана сульфата натрия в течение 7 суток с момента операции, 1% раствор декстрана сульфата натрия готовили ежедневно.
У животных, выведенных из эксперимента на 7-е сутки после операции, выявлено развитие язвенного дефекта (рис. 7 - 1) (рис. 8 - 1) слизистой оболочки толстой кишки и острых эрозий с эпителизацией, сопровождающиеся продуктивным воспалением кишечной стенки. Кроме этого выявлен васкулит (рис. 7 - 2) в стенке язвенного дефекта слизистой оболочки с плазматическим пропитыванием стенок сосудов с утолщением интимы, в том числе и в микроциркуляторном русле.
За время проведения экспериментального исследования летальных исходов не было.
Обсуждение
Моделирование язвенного колита по Cooper H. S. et all. приводило к развитию минимальных изменений в стенке толстой кишки и не соответствовали таковым в клинической практике, при общем угнетенном состоянии животных, не связанном с повреждением кишки [8]. По данным литературы явных язвенных дефектов и васкулита при моделировании по данной методике не образовывалось [2,3].
При моделировании ишемического повреждения стенки толстой кишки по Шалимову С. А., в 71,5% случаев, на 7 сутки макроскопически был выявлен некроз кишки (рис. 1); при гистологическом исследовании — некроз кишечной стенки без
формирования язвенных дефектов (рис. 2). В 29,5% макроскопических и гистологических изменений не было.
Использование предложенной техники оперативного вмешательства позволило получить модель язвенного колита у крыс линии «Ш181аг» с образованием явных язвенных дефектов и васкулита в сосудах кишечной стенки. Однако это подразумевает дополнительное инвазивное вмешательство, с травматизацией подопытных животных, дополнительными материальными затратами, повышением риска летального исхода в связи с проведением оперативного вмешательства на сосудах кишечника.
Проведение отбора лабораторных животных по полу и возрасту (самцы крыс в возрасте более 6 месяцев) позволило стандартизировать получаемые результаты, а также повысить воспроизводимость модели, вследствие максимального снижения вариабельности кровоснабжения нисходящего отдела толстой кишки.
Нижне-срединный лапаротомный доступ позволил минимизировать объем повреждаемых тканей с обеспечением адекватного доступа к заинтересованному отделу толстой кишки. Лигирование и последующее пересечение всех прямых сосудистых ветвей на протяжении 3 см от основания мочевого
Литература:
1. Second European evidence-based Consensus on the diagnosis and management of ulcerative colitis: Definitions and diagnosis, A. Dignass et all // Journal of Crohn's and Colitis. — 2012. — V. 6 (10). — December 2012. — P. 965 - 990
2. William A Rose, Kaori Sakamoto, Cynthia A Leifer: Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases, BMC Immunology 2012, 13:41 doi: 10.1186/1471-2172-13-41
3. Martina Perse and Anton Cerar: Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Trics. J. ofBiomedical and Biotechnology, volume 2012, article ID 718617, 13 pages.
4. Лепехова С. А. Программа стандартных операционных процедур: лабораторные животные (прием, содержание, уход и контроль здоровья животных в вивариях медицинского учреждения): учеб. пособие. Иркутск: НЦРВХ СО РАМН; ИГМУ, 2012; 96 с.].
пузыря обеспечило индукцию обратимых ишеми-ческих изменений в стенке толстого кишечника. Последующее поение подопытных животных 1% раствором декстрана сульфата натрия в течении 7 суток привело к развитию поддерживаемого воспалительного процесса в кишечной стенке с формированием язвенных дефектов и васкулита.
Таким образом, моделирование язвенного колита по оригинальной методике позволяет получить модель язвенного колита приближенную к его клиническому течению, а, следовательно, может быть использована в экспериментальной хирургии для разработки и апробации новых методов лечения.
5. Шалимов С. А., Радзиховский А. П., Кейсевич Л. В. Руководство по экспериментальной хирургии. — М., 1989. — с. 207
6. Puneet Kaur Randhawa, Kavinder Singh, Nirmal Singh, and Amteshwar Singh Jaggi. A Review on Chemical-Induced Inflammatory Bowel Disease Models in Rodents. Korean J. Physiol. Pharmacol. Vol 18: 279-288, August, 2014
7. W. Elsheikh, K. L. Flannigan, W. Mcknight, J. G. P. Fer-raz, J. L. Wallace. Dextran sulfate sodium induces pan-gastroenteritis in rodents: implicationsfor studies of colitis. Journal of physiology and pharmacology 2012, 63, 5, 463 - 469
8. H. S. Cooper, S. N. Murthy, R. S. Shah, and D. J. Seder-gran, «Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis,» Laboratory Investigation, vol. 69, no. 2, pp. 238 - 249, 1993.
К статье
Техника оперативного вмешательства при моделировании язвенного колита нисходящего отдела толстой кишки у крыс линии <т1Б1аг» (стр. 28-32)
Рисунок 1.
Крыса группа 1 — макропрепарат нисходящего отдела толстой кишки:
Рисунок 2
Крыса 1 группа. Гистологический препарат гангрены стенки толстой кишки. Увеличение 15-х
Рисунок 4
Крыса группа 2 — нижнесрединная лапаротомия;
1. петли тонкой кишки (отведены вправо),
2. половые железы,
3. мочевой пузырь (отведены книзу),
4. нисходящий отдел толстой кишки.
Рисунок 3
Рисунок 3.а — крыса группа 3 макропрепарат неизмененного нисходящего отдела толстой кишки, рассечен продольно. Рисунок 3.6 — крыса группа 3 гистологический препарат малоизмененной стенки толстой кишки с отеком подслизистого слоя. Увеличение 40-х
Рисунок 5
Крыса группа 2. Этап выделения. перевязки прямых ветвей сосудов: 1. брюшная аорта, 2. каудальная брыжеечная артерия, 3. левая ободочная артерия, 4. краниальная прямокишечная артерия, 5. прямые ветви кровеносных сосудов, 6. нисходящая часть толстой кишки, 7. проксимальная часть прямой кишки, 8 нить, 9 каудальная брыжеечная вена.
Рисунок 6
Крыса группа 2. Окончательный вид операции.
Рисунок 7
Крыса группа 2 гистологический препарат стенки толстой кишки на 7 сутки моделирование по оригинальной методике: 1 — язвенный дефект, 2 — васкулит
Рисунок 8
Крыса группа 2 макропрепарат нисходящего отдела толстой кишки на 7 сутки моделирования по оригинальной методике (кишка рассечена продольно): 1 — язвенный дефект.
