CC BY
27НАНОСИСТЕМЫ
DOI: 10.17725/rensit2019.11.321
Связывание коротких днк-олигонуклеотидов с поверхностью восстановленного оксида графена для создания биологических сенсоров
1Комаров И.А., 2Антипова О.М. 3Стручков Н.С., Калинников А.Н., 1Щербин ^Н., 1Селезнев В.А.
Московский государственный технический университет им. Н.Э.Баумана, http://www.bmstu.ru/ Москва 105005, Российская Федерация
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, https://www.msu.ru/ Москва 119991, Российская Федерация
3Московский институт электронной техники, https://miet.ru/ Москва 124498, Зеленоград, Российская Федерация
E-mail: ikomarov@emtc.ru, antipovachem@gmail.com, struchkov.nikolaj@gmail.com, alexandr. kalinnikov@emtc.ru, sshcherbin@emtc.ru, vseleznev@emtc.ru Поступила 31.10.2019, рецензирована 11.11.2019, принята 18.11.2019 Представлена действительным членом РАЕН С.П. Губиным
Аннотация. Изучалась возможность иммобилизации коротких ДНК-олигонуклеотидов (аптамеров) на поверхность восстановленного оксида графена с целью формирования биочувствительного сенсорного слоя. Рассмотрены особенности лазерного восстановления оксида графена и определены параметры лазерного излучения, позволяющие добиться частичного восстановления пленки оксида графена. Показана возможность иммобилизации аптамеров на оксиде графена с низкой степенью восстановления и продемонстрирован отклик сенсорных структур, сформированных на его основе. Продемонстрировано существенное отличие отклика сенсоров на воздействие тромбина (таргетный белок) и альбумина (белок сравнения).
Ключевые слова: аптамеры, биосенсоры, иммобилизация, нуклеотиды, оксид графена УДК 620.3
Благодарности: Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации № 14.574.21.0182 (уникальный идентификатор RFMEFI57417X0182).
Для цитирования: Комаров И.А., Антипова О.М. Стручков Н.С., Калинников А.Н., Щербин СН., Селезнев В.А. Связывание коротких днк-олигонуклеотидов с поверхностью восстановленного оксида графена для создания биологических сенсоров. РЭНСИТ, 2019, 11(3):321-330; DOI: 10.17725/rensit.2019.11.321._
Binding of short DNA oligonucleotides to the surface of reduced graphene oxide to create biological sensors
Ivan A. Komarov, Alexander N. Kalinnikov, Sergey N. Shcherbin, Vyacheslav A. Seleznev
Bauman Moscow State Technical University, http://www.bmstu.ru/ Moscow 105005, Russian Federation. Olga M. Antipova
Lomonosov Moscow State University, https://www.msu.ru/ Moscow, 119991 Russian Federation Nikolay S. Struchkov
National Research University of Electronic Technology, https://miet.ru/ 124498, Moscow, Zelenograd, Russian Federation.
E-mail:ikomaroi@emtc.ru, alexandnkalinnikov@emtc.ru, sshcherbin@emtc.ru, vseleznev@emtc.ru, antipovachem@gmail. com, struchkov.nikolaj@gmail.com
Received 31.10.2019, peer reviewed 11.11.2019, accepted 18.11.2019
НАНОСИСТЕМЫ
Abstract. The study examined the possibility of immobilization of short DNA oligonucleotides (aptmers) on the surface of reduced graphene oxide, with the aim of forming a bio-sensitive sensory layer. The features of laser reduction of graphene oxide were considered, and the parameters of reduction were determined, which were implicated in achieving partial reduction. The possibility of immobilization of aptamers on graphene oxide with a low degree of reduction and the response of sensory structures formed on the basis of this basis is shown. A significant difference between the response of the sensors to the effects of thrombin (target protein) and albumin (comparison protein) was demonstrated.
Keywords: aptamers, biosensors, immobilization, nucleotides, graphene oxide. UDC 620.3
Acknowledgements: This work was financially supported by the grant of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation No. 14.574.21.0182 (unique identifier RFMEFI57417X0182)
Foratatiow. Ivan A. Komarov, Olga M. Antipova, Nikolay S. Struchkov, Alexander N. Kalinnikov, Sergey N. Shcherbin, Vyacheslav A. Seleznev. Binding of short DNA oligonucleotides to the surface of reduced graphene oxide to create biological sensors. RENST, 2019, 11(3):321-330; DOI: 10.17725/rensit.2019.11.321._
Содержание
1. Введение (322)
2. материалы и методы (323)
3. результаты и обсуждение (324)
3.1. АСм визуализация пленок оксида графена (324)
3.2. Исследование особенностей восстановления пленок оксида графена (325)
3.3. Иммобилизация аптамеров (326)
3.4. Исследование особенностей иммобилизации (326)
3.5. Исследование отклика сенсоров (328)
4. заключение (328) Литература (328)
1. ВВЕДЕНИЕ
Рынок электронных устройств стремительно развивается, все более смещаясь в сторону персонализированных устройств с максимальным количеством различных датчиков. Особенную популярность приобретают устройства, позволяющие проводить мониторинг состояния здоровья. Кроме того, недавно появились мобильные сети 5-го поколения, которые позволяют осуществлять передачу информации с большого числа различных датчиков. Также следует отметить одну из тенденций в мировом здравоохранении, предполагающую проводить удаленное обслуживание пациентов без необходимости,
во многих случаях, посещения медицинского учреждения. Учитывая приведенные тенденции, можно сделать вывод о том, что в ближайшем будущем нас ждет переход к диагностике части заболеваний полностью в удаленном онлайн режиме. А в пределе развития должен состояться переход на удаленную диагностику максимально широкого спектра заболеваний, для чего в первую очередь требуется техническое обеспечение такого перехода. В области же технического обеспечения главной проблемой является создание сенсоров, и т.к. далеко не все заболевания и патологии могут быть определены путем косвенных измерений частоты сердечных сокращений, давления или снятия ЭКГ (на сегодняшний день наиболее совершенные умные браслеты и часы позволяют делать такие измерения), требуются такие сенсоры, которые смогут определять присутствие патогенов или их маркеров в физиологических жидкостях или дыхании человека. Разработка доступных сенсоров такого рода могла бы существенно упростить цепочку: сдача анализов; логистика их перемещения из полклиники/частной клиники в лабораторию, обработка в лаборатории квалифицированным персоналом, передача данных пациенту, передача данных лечащему врачу. С учётом развития технологий передачи больших массивов данных, при наличии высокочувствительных и селективных сенсоров цепочка могла бы сократиться до нанесения анализа на сенсор, получения результатов
НАНОСИСТЕМЫ
анализа и одновременной демонстрации результатов пациенту и отправки данных врачу. Причем эти пункты могли бы быть выполнены в течение нескольких минут.
Исходя из вышеизложенного можно определить основные требования к биосенсорам, а именно требуется создать биосенсоры, позволяющие быстро, с минимальной подготовкой оператора, на месте, недорого и с высокой точностью проводить измерения в среде физиологических жидкостей человека.
Принимая во внимание вышеуказанные требования к биосенсору, одним из наиболее перспективных материалов является
восстановленный оксид графена, получаемый путем восстановления суспензий, пленок или порошков оксида графена. Благодаря наличию функциональных групп и высокой проводимости оксид графена может быть успешно использован как для формирования чувствительного слоя, так и трансдьюсера [1]. Преимуществом оксида графена является его хорошая диспергируемость, позволяющая производить нанесение на различные подложки посредством технологичных жидкостных методов, в частности капельного нанесения [2], центрифугирования [3] или аэрозольного осаждения [4]. Восстановление оксида графена должно выполняться с сохранением части функциональных групп, которые впоследствие могут быть использованы для иммобилизации биочувствительных агентов. [5].
Можно выделить несколько механизмов восстановления оксида графена: термический [6], химический [7] и фотохимический, реализуемый с помощью УФ излучения [8], а также методы, основанные на применении лазеров [9].
В данной работе показана возможность формирования пленок оксида графена с дальнейшим локальным восстановлением данных пленок с помощью лазерного излучения. Также показана возможность контролируемого восстановления оксида графена до состояния, при котором с одной стороны пленка восстановленного оксида графена становится проводящей, а с другой стороны в ней наблюдается некоторое количество функциональных
групп. Показана возможность связывания коротких ДНК-олигонуклеотидов (аптамеров) с восстановленным оксидом графена через модифицированную EDC/HNS реакцию. Преимуществами аптамеров, помимо высокой чувствительности и афинности по сравнению с ближайшими конкурентами — антителами: более высокая стабильность, гораздо более простой и более дешевый синтез [10-14]. Продемонстрирован отклик полученных структур на целевой и референсный белки.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве подложки, для нанесения пленок оксида графена, использовался полиэтилентерефталат (ПЭТ) с толщиной 175 мкм и латеральным размерами подложек 40x40 мм. Выбор ПЭТ обусловлен высокой температурой плавления, значительно превышающей 250°С и позволяющей производить термическое восстановление, и приемлемыми механическими характеристиками, при невысокой себестоимости. Подготовка подложек к нанесению оксида графена заключалась в механической очистке в 2-пропаноле (ЭКОС-1, ОСЧ, ТУ 2631-06444493179-01).
Водная суспензия оксида графена (4.7 мг/ мл), полученная по усовершенствованному методу Хаммерса (ООО «МИП Графен», Российская Федерация) [15], разбавлялась деионизованно водой до концентрации 1.5 мг/мл и наносилась методом спин-коатинга на поверхность ПЭТ в несколько итераций. Количество итераций выбиралось согласно требуемой толщине пленок и находилось в диапазоне от 5 до 15-ти. Сушка пленок ОГ осуществлялась при температуре 110° С в течение 20 минут. Толщина полученных пленок составляла порядка 100 нм (согласно данным атомно-силовой микроскопии).
Локальное восстановление пленки оксида графена осуществлялось посредством автоматизированной установки, включающей диодный лазер с длиной волны 445 нм и моторизованный столик для образцов [16]. Управление мощностью излучения в диапазоне в диапазоне 10-400 мВт осуществлялась широтно-импульсной модуляции с частотой 30 МГц. Ширина импульсов составляла от 1 до
НАНОСИСТЕМЫ
20 мкс. Время обработки в точке составляло 30 мс (размер лазерного пучка составлял порядка 1.5-103 мкм2).
Для формирования биочувствительного слоя использовались аминомодифицированные тромбиновые аптамеры AmTBA c нуклеотидной последовательностью
(5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3 '). Аптамеры были синтезированы с использованием стандартной химии фосфорамидитов и очищали жидкостной хроматографией (Апто-Фарм, ООО, Россия). Аминогруппа вводилась в виде модифицированного тиминового остатка на 5'-конце последовательности ДНК. Связывание аптамеров с карбоксильными группами, содержащимися в восстановленном оксиде графена, проводилось с использованием коммерчески доступного электрофильного активатора EDC (1-этил-3- (3-диметиламинопропил)-карбодиимида (Sigma-Aldrich, США). Реакцию проводили в 100 мМ буферном растворе MES (2-(Ы-морфолино) этансульфоновой кислоты, Sigma-Aldrich, США), рН = 6.0, с добавлением 25% этанола, при комнатной температуре в атмосфере инертного газа. Конечная концентрация аптамера в реакции конъюгации составила 50 мкМ. Связывание происходило в течение 1 часа, после чего раствор собирали, центрифугировали и анализировали с помощью ВЭЖХ.
Измерения ВЭЖХ проводили на приборе Agilent Technologies 1200 с хроматографической колонкой DNA PAC 100 (диаметр частиц 4*250 мм и 13 мкм, Thermo Scientific, США). Подвижные фазы были следующими: A: 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH = 7.5, 5% ацетонитрил; В: 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН = 7.5, 1 М NaCl, 5% ацетонитрил. Градиентная программа включала два этапа: 0-1 мин - 30% B, 1-20 мин 30-50% B. Температура колонки была 60°С, скорость потока была 1 мл/мин. Детекция проводилась по поглощению при длине волны 254 нм.
Спектры комбинационного рассеяния были получены на комбинированном АСМ/Раман комплексе Centaur U HR (NanoScanTechnology Ltd, Российская Федерация).
Фурье-ИК спектроскопия проводилась на
FTIR-спектрометре Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) методом нарушенного полного внутреннего отражения.
Топография поверхности пленок
оксида графена была получена с помощью сканирующего зондового микроскопа Solver P47-Pro (НТ-МДТ, Россия).
В качестве таргетного белка использовался тромбин, в качестве белка сравнения использовался альбумин. Регистрация отклика биосенсоров на воздействие белков осуществлялось с помощью измерителя параметров сенсоров ИПС-16 (Pracktic NC Ltd., Российская Федерация).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. АСМ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПЛЕНОК ОКСИДА ГРАФЕНА
При этом толщина полученных пленок контролировалась с помощью атомно-силовой микроскопии и спектрофотомерии. За счет построения корреляции между данными спектрофотомерии в дальнейшем можно проводить быстрый контроль толщины нанесенных пленок. Исходя из данных атомно-силовой микроскопии и оптического коэффициента пропускания была построена зависимость, приведенная на Рис. 1.
Толщина получаемых пленок определялась с помощью атомно-силовой микроскопии по следующей методике: с подложки торцом другой ПЭТ подложки частично удалялась пленка оксида графена с тем, чтобы между подложкой и
Рис. 1. Зависимость толщины сформированных пленок и оптического коэффициента пропускания от количества итераций нанесения.
НАНОСИСТЕМЫ
Рис. 2. Топография пленки оксида графена (а) и изображение границы пленки оксида графена и ПЭТ подложки в режиме фазового контраста.
пленкой образовалась ступенька, высота которой определялась по топографии поверхности (Рис. 2). Морфология поверхности пленки вполне типична для оксида графена и аналогична морфологии пленок, представленных в работах
[17].
Исходя из полученных данных можно отметить наличие порогового числа нанесений — 10 шт, при котором достигается максимальная толщина пленки. Предполагается, что данный эффект связан с тем, что при нанесении пленка не успевает полностью высохнуть, из-за чего адгезия верхних слоев пленки оказывается меньше центробежной силы для данной концентрации раствора и скорости вращения подложки.
Из полученных данных можно отметить, что толщина пленки и оптический коэффициент пропускания имеют линейную зависимость от числа итераций нанесения и обратно пропорциональны друг другу. Максимальная толщина пленки достигается при 10 итерациях нанесения и составляет 90 нм. При этом оптический коэффициент пропускания составляет порядка 10±2%, что использовалось при дальнейшей подготовке образцов. 3.2. Исследование особенностей восстановления пленок оксида графена Плёнки оксида графена наибольшей толщины были использованы для исследования особенностей восстановления лазерным излучением. Пленки подвергались обработке лазером с параметрами флюенса от 15.2 до 59.4 Дж/см2. Предположение состояло в том, что при небольших значениях флюенса будет наблюдаться слабое восстановление оксида графена, при котором, однако, будут сформированы проводящие каналы, при наличии, тем не менее, остаточного количества
'Л.""3
0.1 -{-1-1-1-1---1-.-1-.-1- о.о
10 20 10 40 50 «0
Ниепсе (,Ист!)
Рис. 3. Зависимость соотношений интенсивности О, G и 2О рамановских пиков и сопротивления восстановленных
областей от флюенса лазера. функциональных групп, которого будет достаточно для связывания с аптамерами. Из полученных результатов (Рис. 3) можно заметить, что отношение 10/1с уменьшается до ~ 0.4 с увеличением флюенса до ~ 37 Дж/м2, что означает, что происходит удаление дефектов структуры, в первую очередь за счет удаления кислородсодержащих функциональных групп. При флюенсе более 60 Дж/см2 наблюдалось разрушение пленки с частичной абляцией подложки. Максимальная степень графитизации согласно данным КР-спектроскопии достигается при флюенсе 48.3 Дж/см2, что следует из соотношений 1£)/1с и 12£)/1 но с учетом того, что сопротивление и соотношение 1В/1С и 1Ю/1С существенно не меняются в диапазоне от 35 до 50 Дж/см2, то предполагается, что полученная энергия достаточна для нагрева пленки оксида графена на всю толщину. Увеличение отношения 12О/1с говорит нам о структурировании восстановленного оксида графена из-за присутствия турбостратного графита, состоящего из нескольких графеновых чешуек, которые имеют произвольную ориентацию в слое. Интересно отметить, что наблюдается значительная корреляция между графиком изменения сопротивления этих восстановленных областей и отношением 1П/ 1С, что предполагает квазилинейный характер распределения энергии в пленке оксида графена.
Исходя из данных спектроскопии комбинационного рассеяния можно
НАНОСИСТЕМЫ
сделать вывод, что наибольшее количество функциональных групп (т.е. дефектов структуры) наблюдается при значениях флюенса порядка 15-25 Дж/см2, при которых, однако, восстановленный оксид графена является проводящим. Значение флюенса 25 Дж/см2 было использовано в дальнейшей работе по формированию сенсорных структур исходя из несколько лучшей проводимости и стабильности работы лазера.
3.3. иммобилизация аптамеров
Для исследования особенностей связывания ДНК-нуклеотидов с восстановленным оксидом графена использовался хорошо изученный аптамер, обладающий афинностью к тромбину
[18] с амино-модификацией (Ат-ТВА). Нуклеотидная последовательность данного аптамера: 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3 '. Как было показано, ТВА распознает тромбин с очень высокой аффинностью с помощью его ТТ-петель, а структура ядра б-квадруплекса стабилизирует точное расположение петель
[19]. В данном случае применялась 5'-амино-тимидиновая модификация аптамера (Ат-ТВА), вследствие того, что добавление нуклеотидных остатков и функциональных групп на 5'-конце ТВА не меняет структуру аптамера, связывающего тромбин, и не влияет на связывание с целевым белком [20]. Аминогруппа Ат-ТВА необходима для осуществления ковалентного связывания карбоксильными группами восстановленной пленки оксида графена, предварительно активированной карбодиимидом (EDC).
Метод конъюгации с использованием EDC является чрезвычайно распространенной практикой для биоконъюгации: реакция сочетания протекает с количественным выходом. Однако, при применении этого метода для конъюгации амино-модифицированного производного
аптамера с пленкой восстановленного оксида графена, было обнаружено, что гидрофобный эффект поверхности восстановленного оксида графена играет важную роль и стандартным методом невозможно получить достаточный выход реакции. При этом было показано, что добавление 25% об. этанола к реакционной смеси улучшает выход реакции.
ВЭЖХ анализ позволяет рассчитывать
только реакционноспособные карбоксильные группы. Однако именно количество активных карбоксильных групп определяет количество конъюгированных чувствительных молекул на поверхности восстановленного оксида графена и, следовательно, оно определяет эффективность биосенсора.
Расчёты, исходящие из количества амино-модифицированного аптамера АтТВА, показали, что удельное количество карбоксильных групп достигает 29 пмоль на 1 мм2, максимальной плотности 42 Дж/см2, 32 пмоля на 1 мм2, плотности 35 Дж/см2 и 43 пмоля на 1 мм2 для пленки с минимальной флюенсом 25 Дж/см2 (Таблица).
Таким образом, наблюдается тенденция к увеличению присутствия карбоксильных функциональных групп с уменьшением флюенса лазера. Было определено, что лазерная обработка флюенсом до 25 Дж/см2 подходит для иммобилизации аптамеров и, следовательно, для создания биологического сенсора. 3.4. Исследование особенностей иммобилизации
Спектры комбинационного рассеяния от сенсорных структур до и после аптамерного взаимодействия представлены на Рис. 4. В этих спектрах мы можем наблюдать полосы V (~1350 см-1), С (~1600 см-1) и 2О (~2700 см-1). соответственно. Известно, что О-полоса возникает благодаря симметрии А^ и происходит от фононных граничных фононов. Зона V обычно приписывается различным дефектам в решетке графита. Полоса С представляет собой рассеяние первого порядка, связанное с симметрией E2g, и соответствует зоне Бриллюэна кристаллических решеток sp2 в графите [21].
Таблица
Результаты коньюгации аптамеров.
Флюенс лазера, Дж/см2 Процент изменения конценрации AmTBA, % Количественное изменение количества AmTBA,нмоль Удельное количество реакционно-способных карбоксильных групп на единицу площади, 1012/нм2
25 32 3.2 43
35 29 2.9 32
42 26 2.6 29
НАНОСИСТЕМЫ
500 1000 1500 2000 2500 300« 3500 4000
Рис. 4. Романовские спектры на восстановленной поверхности оксида графена до и после аптамерного взаимодействия.
Более высокое отношение 10/1с в восстановленном оксиде графена указывает на большую плотность дефектов [22, 23], включая функциональные группы. Согласно известным публикациям для бездефектного графена должен наблюдаться узкий 20 пик высокой интенсивности, тогда как широкий 20 пик низкой относительно О и О пиков интенсивности указывает на большее количество дефектов в структуре оксида графена [24]. Из Рис. 5 и информации о природе рамановских пиков можно сделать следующие наблюдения и выводы. В спектрах комбинационного рассеяния, полученных от пленок с иммобилизованными аптамерами, есть 2 основных особенности: изменение отношения 1П/1С (от 0.98-0.99 до иммобилизации и 0.86 - 1.13 после) и уменьшение интенсивности 20 пиков. Указанные эффекты, возникают вследствие увеличения числа дефектов из-за присутствия конъюгатов «аптамер-восстановленный оксид графена» и близки к эффектам, описанным в работах [25, 26]. Авторы
ИГшаЯдгдЖ |л.„]
Рис. 5. ИК-Фурье спектры биосенсора в области восстановленного оксида с нанесенным аптамеров и без такового.
[26] связывают этот эффект со взаимодействием полиэтиленимина (ПЭИ) с оксидом графена. В данном случае такое сравнение является законным из-за низкой скорости восстановления оксида графена, который, таким образом, содержит различные функциональные группы. На основании вышеупомянутой информации можно отметить, что имеется косвенное подтверждение ковалентного связывания аптамеров с восстановленным оксидом графена, что также подтверждается с помощью ИК-Фурье спектроскопии (Рис. 5).
Из Рис. 5 можно сделать вывод о наличии нескольких характерных пиков, которые относятся к гидроксильным, карбоксильным, карбонильным и эпокси-группам. Широкий пик при ~ 3400 см-1 связан с валентными колебаниями О-Н, то есть с присутствием гидроксильных групп [27]. Следует отметить, что этот пик четко наблюдается только в чувствительной области после реакции иммобилизации. Небольшие пики на 2847 см-1 (симметричный) и 2917 см-1 (асимметричный) представляют собой полосу поглощения —СН которая делится на две подзоны и относится к алкильным фрагментам (в результате восстановления СООН до -СН) [28]. Относительно интенсивный пик при ~ 1720 см-1 в случае восстановленного оксида графена в области контакта следует отнести на счет присутствия карбоксильных групп, что означает, что восстановление при малых значениях флюенса не удаляет все функциональные группы. С другой стороны, значительное снижение интенсивности этого пика после иммобилизации аптамеров означает, что происходит реакция между аптамером и карбоксильной группой. Такая же ситуация описана в работе [29] для полиэтиленгликоль амина, конъюгированного с оксидом графена. Согласно [30] пик при ~ 1720 см-1 следует отнести к С = О карбоксильной и карбонильной группам, пик при 1640 см-1 можно отнести к колебаниям неокисляющихся графитовых доменов. Широкая полоса около 1080 см-1 появляется из-за присутствия гидроксильных групп [31].
Из ИК-спектров можно сделать вывод, что после восстановления оксида графена. ряд функциональных групп все еще остается в пленке. Более того, после иммобилизации
НАНОСИСТЕМЫ
2000 4000
6000 8000 Time (s)
10000 12000
400-,
350
300-
2 250-
200-
150-
10 цМ
2000 4000 6000 8000 10000 12000 Time (s)
b
Рис. 6. Отклик сенсорных структур на тромбин (а) и альбумин (b).
аптамеров интенсивности
наблюдается уменьшение
карбоксильного пика, что означает взаимодействие аптамеров с данными группами.
3.5. Исследование отклика сенсоров
Проведено экспонирование биосенсоров тромбином (целевой белок) и альбумином (эталонный белок). При экспонировании сенсоров тромбином в концентрациях 0.1 — 5 мкМ (Рис. 6а) и альбумином в концентрациях 1 — 50 мкМ (рис. 6Ь) наблюдалась значительная разница в отклике сенсоров: направление и величина отклика значительно отличаются для тромбина и альбумина.
Из Рис. 6 видно, что при экспонировании тромбином наблюдается различная
интенсивность отклика для различных концентраций, тогда как в случае альбумина нет заметного различия в отклике даже при концентрациях, отличающихся друг от друга на 2 порядка и на порядок больших, чем для тромбина. Последнее говорит о том, что альбумин неспецифично взаимодействует с аптамерами, тогда как в случае тромбина наблюдается именно избирательное взаимодействие аптамера с тромбином. Кроме того, из Рис 6а видно, что после достижения максимума сопротивления (для каждой из концентрации) наблюдаются колебания сопротивления с тенденцией к возврату к исходному сопротивлению, что предположительно происходит из-за десорбции отдельных белков. В случае альбумина характер и величина отклика меняются незначительно, вне зависимости от концентрации белка, что скорее всего говорит о неспецифическом взаимодействии
альбумина с аптамерами, т.к. в противном случае (взаимодействие альбумина непосредственно с поверхностью восстановленного оксида графена) сопротивление сенсора не должно возвращаться к исходному значению из-за сильной связи восстановленного оксида графена с альбумином, как наблюдалось в работе [32]. Предел обнаружения разработанного датчика на тромбине находится в диапазоне от 1 до 5 мкМ.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Паказана возможность формирования и контролируемого восстановления пленок оксида графена с помощью лазерного излучения. Показана также возможность связывания коротких ДНК-олигонуклеотидов (аптамеров) с восстановленным оксидом графена через карбоксильные группы, входящие в состав последнего. Оптимальным диапазоном значений флюенса при восстановлении оксида графена является 15-25 Дж/см2. Оптимальное связывание аптамеров достигается при минимальных значениях флюенса. Показан отклик сенсоров на целевой и референсный белок, причем наблюдаются заметные отличия в отклике на тромбин и альбумин с минимальной детектируемой концентрацией первого 1 мкМ.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министфства образования и науки Российской Федерации № 14.574.21.0182 (уникальный идентификатор RFMEFI57417X0182)
ЛИТЕРАТУРА
1. Celik N, Balachandran W, Manivannan N. Graphene-based biosensors: methods, analysis
HAHOCMCTEMbl
and future perspectives. IET Circuits Devices Syst,
2015, 9:434-445.
2. Xiaoning Tang, Xiansheng Zhang, Huiping Zhang, Xingmin Zhuang and Xiong Yan. Facile dip-coating process towards multifunctional nonwovens: Robust noise reduction, abrasion resistance and antistatic electricity. Textile Research Journal, 2018, 88(22):2568-2578.
3. Kymakis E, Stratakis E, Stylianakis MM, Koudoumas E, Fotakis C. Spin coated graphene films as the transparent electrode in organic photovoltaic devices. Thin Solid Films, 2011, 520:1238-1241.
4. HongFei Shi, Can Wang, ZhiPei Sun,YueLiang Zhou, KuiJuan Jin, GuoZhen Yang. Transparent conductive reduced graphene oxide thin films produced by spray coating. Science China Physics, Mechanics & Astronomy, 2015, 58(1):1-5
5. Zhang Y-L, Guo L, Xia H, Chen Q-D, Feng J, Sun H-B. Photoreduction of Graphene Oxides: Methods, Properties, and Applications. Advanced Optical Materials, 2013, 2(1):10-28.
6. McAllister MJ et al. Single Sheet Functionalized Graphene by Oxidation and Thermal Expansion of Graphite. Chem. Matter, 2007, 19:4396-4404.
7. Stankovich S et al. Synthesis of graphene-based nanosheets via chemical reduction of exfoliated graphite oxide. Carbon, 2007, 45(7):1558-1565.
8. Rabchinskii MK, Shnitov VV, Dideikin AT, Aleksenskii AE, Vul' SP, Baidakova MV, Pronin II, Kirilenko DA, Brunkov PN, Weise J, Molodtsov SL. Nanoscale Perforation of Graphene Oxide during Photoreduction Process in the Argon Atmosphere. The Journal of Physical Chemistry C,
2016, 120(49):28261-28269.
9. Gengler RYN, Badali DS, Zhang D, Dimos K, Spyrou K, Gournis D, Miller RJD. Revealing the ultrafast process behind the photoreduction of graphene oxide. Nature Communications, 2013, 4(1).
10. Rothlisberger P, Gasse C, Hollenstein M. Nucleic Acid Aptamers: Emerging Applications in Medical Imaging, Nanotechnology, Neurosciences, and Drug Delivery. Int J Mol Sci.,
2017, 18(11):E2430.
11. Park KS. Nucleic acid aptamer-based methods for diagnosis of infections. Biosens Bioelectron.,
2018, 102:179-188.
12. Shigdar S et al. Aptamers as theranostic
agents: modifications, serum stability and functionalization. Sensors (Basel), 2013, 13(10):13624-13637.
13. Pu F, Ren J, QuX. Nucleobases, nucleosides, and nucleotides: versatile biomolecules for generating functional nanomaterials. Chem Soc Rev., 2018, 47(4):1285-1306.
14. Hughes RA, Ellington AD. Synthetic DNA Synthesis and Assembly: Putting the Synthetic in Synthetic Biology. Cold Spring Harb Perspect Biol., 2017, 9(1):023812.
15. Alexandrov GN, Smagulova SA, Kapitonov AN, Vasil'eva FD, Kurkina II, Vinokurov PV, Timofeev VB, Antonova IV. Thin partially reduced oxide-graphene films: Structural, optical, and electrical properties. Nanotechnologies in Russia, 2014, 9(7-8):363368.
16. Struchkov NS, Kondrashov VA, Rozanov RY, Nevolin VK. Research and development of the method of graphene oxide thin films local reduction by modulated laser irradiation. 18th Russian Youth Conference on Physics of Semiconductors and Nanostructures, Opto- and Nanoelectronics, 2016, Peter Great St Petersburg Polytechn Univ, St Petersburg, RUSSIA, 2016, vol. 816, BRISTOL: Iop Publishing Ltd, 2017.
17. Yamaguchi H, Eda G, Mattevi C et al. Highly uniform 300 mm wafer-scale deposition of single and multilayered chemically derived graphene thin films. ACS Nano, 2010, 4:524-528.
18. Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 1992, 355(6360):564-566.
19. Pica A, Krauss RI, Merlino A, Nagatoishi S, Sugimoto N, Sica F. Dissecting the contribution of thrombin exosite I in the recognition of thrombin binding aptamer. FEBS J., 2013, 280:6581-6588.
20. Musumeci D, Oliviero G, Roviello GN, Bucci EM, Piccialli G. G-quadruplex-forming oligonucleotide conjugated to magnetic nanoparticles: synthesis, characterization, and enzymatic stability assays. Bioconjug Chem., 2012, 23(3):382—391.
21. Yang D. et al. Chemical analysis of graphene oxide flms afer heat and chemical treatments by X-ray photoelectron and microRaman spectroscopy. Carbon, 2009, 47:145-152.
НАНОСИСТЕМЫ
22. Ferrari AC et al. Raman spectrum of graphene and graphene layers. Phys. Rev. Lett., 2007, 97:187401-187404.
23. Kotakoski J et al. From point defects in graphene to two-dimensional amorphous carbon. Phys. Rev. Lett., 2011, 106:105505-105508.
24. Malard LM, Pimenta MA, Dresselhaus G, Dresselhaus MS. Raman spectroscopy in graphene. Phys. Rep., 2009, 473:51-88.
25. Kurapati R, Bonachera F, Russier J et al. Covalent chemical functionalization enhances the biodegradation of graphene oxide. 2D Mater., 2018, 5:015020.
26. Rodriguez-Silva AA, Movil-Cabrera O, Oliveira dos Anjos CT, Staser JA. Supercapacitor-Based Biosensor for Low Density Lipoprotein Detection. Journal of The Electrochemical Society, 2016, 163(6):B256-B263.
27. Lee D, Cho H, Han D, Chand R, Yoon T, Kim Y. J. Mater. Chem. B, 2017, DOI: 10.1039/ C6TB03357A.
28. Bhavana Gupta, Niranjan Kumar, Kalpataru Panda et al. Role of oxygen functional groups in reduced graphene oxide for lubrication. Scientific Reports, 7:45030. DOI: 10.1038/srep45030.
29. Eluyemi MS, Eleruja MA, Adedeji AV et al. Synthesis and Characterization of Graphene Oxide and Reduced Graphene Oxide Thin Films Deposited by Spray Pyrolysis Method. Graphene, 2016, 5(03):143-154.
Комаров Иван Александрович
к.т.н, вед. инженер
Центр «Композиты России» МГТУ им Н.Э. Баумана Москва 105005, Российская Федерация ikomarov@emtc.ru Антипова Ольга Михайловна
аспирант
МГУ им. М.В. Ломоносова
Москва 119991, Российская Федерация.
antipovachem@gmail.com
Стручков Николай Сергеевич
аспирант
Национальный исследовательский университет «МИЭТ»
Москва 124498, Зеленоград, Россия struchkov.nikolaj@gmail.com Калинников Александр Николаевич
зам. директора
Центр «Композиты России» МГТУ им Н.Э. Баумана Москва 105005, Россия alexandr.kalinnikov@emtc.ru Щербин Cергей Николаевич
нач. отдела
Центр «Композиты России» МГТУ им Н.Э. Баумана Москва 105005, Россия sshcherbin@emtc.ru Селезнев Вячеслав Александрович
рук. департамента
Центр «Композиты России» МГТУ им Н.Э. Баумана Москва 105005, Россия vseleznev@emtc.ru.
