CC BY
9
4. Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганнческих пести- 7. Deutsch /. А. // Science. — 1971. — Vol. 74. — Р 788— цидов. — М., 1977. 794.
5. Марцонь Л. В., Шепельская Н. Р.// Гиг. и сан.— 8. Oliverio А. // Progr. Neurobiol. — 1974. — Vol. 9. — 1980. —№ Т. — С. 46—47. Р. 191—215.
6. Селиванова А. Т., Голиков С. //. Холииергические механизмы высшей нервной деятельности. — Л., 1975. Поступила 18.11.86
УДК 615.917:547.2б1].015.5.07: [616.36-008.931:577.152.11-02:613.13
10. А. Трифонов, А. А. Турдыев, Л. А. Тиунов, В. А. Воронин,
С. В. Волошин, Е. К. Прус
СВЯЗЬ СЕЗОННОЙ ГИБЕЛИ КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ МЕТАНОЛОМ С ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ
Институт биохимии АН Узбекской ССР, Ташкент
Известно, что метанол, широко используемый в ряде производств химической промышленности, является сильным нервно-сосудистым ядом с резко выраженным кумулятивным действием. В связи с ритмическим характером течения физиологических процессов реакция организма на интоксикацию метанолом в разные сезоны года, вероятно, может быть различной, что необходимо учитывать при регламентировании уровней воздействия этого ксенобиотика.
Целью настоящей работы явилось хронобиологическое исследование влияния метанола в различных дозах на целостный организм и энергетическую активность митохондрий печени крыс.
Объектом исследования служили нелинейные белые крысы-самцы массой 160—180 г. Животные содержались на стандартном рационе при естественном освещении в клетках типа «Зообокс-2» (ВНР). Крысам одной группы метанол в виде 50 % водного раствора вводили внутри-желудочно при помощи зонда в дозах от 2379 до 15 860 мг/кг (в расчете на абсолютный спирт). На каждую дозу брали по 10 крыс. Затравку проводили в 8—9 ч. Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 сут с момента затравки. Интоксикацию проводили в середине каждого сезона года. Полученные данные обрабатывали методами пробит-анализа и вариационной статистики с помощью критерия Стыодента. При построении графиков смертности использовали метод наименьших квадратов. Зависимость между сезонной гибелью животных при отравлении метанолом и колебаниями факторов окружающей среды определяли методом ранговой корреляции.
Крыс другой группы в различные сезона года подвергали воздействию метанола в дозах 2385 и 7155 мг/кг и декапитировали через 1 ч после интоксикации. Митохондрии печени выделяли методом дифференциального центрифугирования [16]. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовой реакцией [3]. Регистрацию признаков окислительного фосфорилирования митохондрий печени осуществляли полярографическим методом [6]. Определяли также активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [18] и аденозинтрифосфатазы (АТФазы) митохондрий печени [7, 15]. Комплексную оценку физиологического состояния митохондрий печени крыс проводили по методу нормированных коэффициентов связи с использованием 5 % уровня значимости критерия Стыодента [10]. Данный метод позволяет, регистрируя в одной системе отсчета признаки окислительного фосфорилиро-вання, а также активность СДГ и АТФазы, выявить уровень энергетической активности митохондрий печени.
Методом пробит-анализа по кривым доза — эффект найдены значения параметров токсичности метанола для различных сезонов года.
Среднегодовая величина ЬО!б для крыс оказалась равной 9034±771 мг/кг (п = 120). Максимальные значения Ь016 зарегистрированы в весенний (10 737±180 мг/кг; п = 30) и осенний (9468 =Ь 138 мг/кг; п = 30) сезоны го-
да. В эти периоды гибель крыс была наименьшей. Минимальные значения Ь01б отмечены в зимний (7026± ±187 мг/кг; п = 30) и летний (8905±238 мг/кг; п = 30) сезоны, когда гибель животных была наибольшей. Амплитуда колебаний величины ЬО^ достигает 52,8 % от показателей гибели в зимний сезон (/?<0,05; п = 58).
Среднегодовая величина ЬО50 для крыс составила 10 581±690 мг/кг (п = 120). Уровень данного параметра также претерпевает сезонные колебания. Максимумы значений ЬО50 приходятся на весенний (11 736 =±= 158 мг/кг; /г = 30) и осенний (11 451 ±201 мг/кг; /1 = 30), а минимумы — на зимний (8683±207 мг/кг; п = 30) и летний (10 452±218 мг/кг; я = 30) сезоны года. Амплитуда колебаний величины ЬО50 достигает 35,2 % (р<0,05; п 1= 58).
Среднегодовая величина Ь084 для крыс равна 12 428± 625 мг/кг (п = 120). Максимальные значения Ь084 отмечены в осенний (13 481 ±162 мг/кг; п = 30) и весенний (13 2431+= 141 мг/кг; п = 30), минимальные — в зимний (10 729±243 мг/кг; п = 30) и летний (12 260± ±158 мг/кг; д = 30) сезоны. Амплитуда колебаний величины ЬЭ84 достигает 25,7 % (р<0,05; п = 58).
Как видно из приведенный данных, амплитуда сезонных колебаний величины ЬЭ84 в 2 раза меньше аналогичного показателя Ь016 (р<0,05; п = 58), что свидетельствует о сглаживании сезонного ритма гибели крыс при возрастании дозы метанола.
Особый интерес представляет изучение влияния геофизических факторов на вероятность летальных исходов у животных при отравлении метанолом [1]. Установлено, что сезонные колебания уровня гибели крыс при отравлении метанолом в дозах от 7137 до 12 688 мг/кг имеют отрицательную корреляцию с показателями атмосферного давления (г = —0,4; р<0,05; п — 28), влажности (г =—0,2; р>0,05; п = 28) и положительную — с показателем температуры воздуха (г = +0,4; /?<£),05; пм= 28). Таким образом, достоверное влияние на гибель крыс при отравлении метанолом оказывают температура воздуха и атмосферное давление.
Уровень энергетической активности митохондрий печени интакткых крыс претерпевает сезонные колебания • с увеличением в летний и зимний сезоны и ее снижением в весенний и осенний сезоны года (см. рисунок). Сезонная амплитуда энергетической активности митохондрий печени интактных крыс достигает 99 % (весна — лето; р<0,05; п == 18). Отравление крыс метанолом в дозах 2385 и 7155 мг/кг увеличивает сезонную амплитуду энергетической активности митохондрий печени на 9 % (р<0,05; п = 14) и 15,2 % (р<0,05; п = 14) соответственно. Наибольшее снижение энергетической активности митохондрий печени крыс происходит при воздействии метанолом в дозе 7155 мг/кг в зимний период года и достигает 47 % (Р<0,05; п — 14).
Рассматривая возможные механизмы сезонной гибели крыс при отравлении метанолом, можно отметить, что на-
Сезонные уровни энергетической активности митохондрий
печени крыс после интоксикации метанолом.
По оси абсцисс — сезоны года; В — весна, Л — лето, О — осень, 3 — зима; по оси ординат — нормированный коэффициент связи. 1 — контроль; 2 — 2385 мг/кг; <3 — 7155 мг/кг. В скобках — максимальные отличия (в %) от контроля.
именъшее значение в его окислении имеет алкогольде-гидрогеназа, а основную роль в его метаболизме играют каталаза и цитохром Р-450, а также дегидрогеназные системы митохондрий [2, 8, 17]. Энергетическим субстратом для этих реакций служит ЫАОРН, эффективными поставщиками которого являются пентозный цикл и митохондрии.
Говоря об энергетическом вкладе пентозного цикла в реакции детоксикации метанола, следует отметить, что активности дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) и 6-фосфоглюконата, ответственных за производство ЫАБРН, подвержены сезонным колебаниям с максимумом в летне-осенний и минимумом в зимне-весенний периоды [4]. Содержание кортикостерона в крови наиболее высоко в весенний и осенний сезоны года и снижено в летний и
ф * г *
зимний сезоны [4]. Можно предположить, что низкий уровень содержания кортикостерона летом и зимой способствует повышенной гибели животных в эти периоды, так как снижение уровня этого гормона приводит к угнетению активности дегидрогеназы Г-6-Ф и уменьшению продукции МАЭРН. Кроме того, фазовый сдвиг сезонных колебаний активности обеих дегидрогеназ относительно сезонного ритма секреции кортикостерона позволяет предположить, что функцию метронома в отношении этих ферментов выполняет также инсулярный аппарат поджелудочной железы [4]. Инсулин оказывает стимулирующее влияние на синтез апофермента дегидрогеназы Г-6-Ф в то время как глюкокортикостероиды оказывают противоположное действие [19].
При действии метанола в дозе 18 мл/кг у крыс через 24 ч истощается запас гликогена в печени [9], при этом содержание Г-6-Ф в клетке падает и генерация восстановленных эквивалентов (ЫАОРН и ЫАОН) происходит преимущественно в митохондриях [21, 22].
Известно, что наибольшим компенсаторным резервом окислительного фосфорилирования и максимальной устойчивостью к различным патологическим воздействиям обладают митохондрии с наименьшим уровнем энергетической активности, так как они способны увеличивать уровень производства энергии в ответ на запросы со стороны энергозависимых систем [10]. После использования компенсаторного резерва активность митохондрий снижается. Таким образом, можно предположить, что повышенная гибель крыс летом и зимой обусловлена низким уровнем компенсаторного резерва окислительного фосфорилирования митохондрий печени в эти периоды. Сглаживание сезонного ритма гибели крыс при увеличении дозы метанола, вероятно, связано с постепенным использованием компенсаторного резерва митохондрий печени и последующим угнетением их активности. Следует отметить, что именно энергетический обмен организма, за который преимущественно отвечают митохондрии, играет роль клеточных часов [12]. Увеличение амплитуды сезонного ритма энергетической активности митохондрий печени при отрав-
лении метанолом в дозе 2385 мг/кг является начальным этапом снижения компенсаторного резерва митохондрий печени и предпосылкой к десиихронозу циркадной системы организма [4].
Нарушение сезонного ритма гибели крыс может также происходить в результате ингибирования формальдегидом (метаболит метанола) переноса катионов через митохонд-риальные мембраны [11], которые принимают непосредственное участие в возникновении биологических ритмов [20].
Следует подчеркнуть, что одним из пусковых механизмов нарушения ритмичного процесса гибели крыс при отравлении метанолом, вероятно, является непосредственное влияние этого ксенобиотика на дыхательную цепь митохондрий.
Ранее нами установлено, что метанол в дозе 9500 мг/кг через 1 ч после воздействия вызывает низкоэнергетический сдвиг и ослабление энергетической регуляции митохондрий печени крыс [5]. Известно, что действие метанола на митохондрии направлено на ингибироваиие переноса электронов на уровне NADH-дегидрогеиазы [11]. В результате происходит нарушение обратной трансгидрогеиазной реакции и изоцитратиого челночного механизма [13], что приводит к снижению фонда NADPH в цитозоле и угнетению процесса детоксикации метанола в системе NADPH-завн-симых микросомальных оксидаз.
Литература
1. Акоев И. Г. // Экспериментальные исследования по космической биофизике. — Пущино, 1976. — С. 7—30.
2. Ахрем А. А., Метелица Д. И., Попова Е. М., С кур ко М. Е. И Изв. АН БССР, серия хим. наук. — 1977. — № 6.— С. 106—107.
3. Бэйли Д. Методы химии белков: Пер. с англ. — М., 1965.
4. Виноградов В. В.// Журн. общ. биол.— 1982. — Т. 43.— № 2.— С. 197—204.
5. Иванов В. И., Шиндер Е. А., Трифонов Ю. А., Турды-ев А. А. II Цитологические механизмы гистогенезов. — Ташкент, 1983.— С. 80—81.
6. Кондрашова М. Н., Николаева Л. В., Чистяков В. В Калинченко Л. П. // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом.—М.,
1973. —С. 50—59.
7. Мансурова И. Д. Биохимия печени при болезни Боткина и боткинских циррозах. — Душанбе, 1964.
8. Метелица Д. ИПопов Е. М. // Биохимия. — 1979.— Т. 44. — № П. —С. 1923—1935.
9. Микулич С. Г. Изменение клеточного метаболизма в тканях печени и мозга при интоксикации метиловым спиртом в эксперименте: Автореф. дис... канд. биол. наук. — Киев, 1974.
10. Мотлох Ii. //.//Межсистемные взаимодействия при радиационном поражении. — Пущино, 1978. — С. 61 — 68.
11. Ротенберг Ю. С.// Бюл. экспер. биол. — 1982. — № 9.— С. 42—45.
12. Сельков Е. Е. // Временная организация энергетического обмена и физиологическое состояние организма. — М., 1978. — С. 15—32.
13. Скулачев В. П. Трансформация энергии в биомембранах. — М., 1972.
14. Степанова С. И. // Проблемы временной организации живых систем.—М.. 1979. — С. 37—62.
15. Ту раку лов Я. X., Кургульцева Л. И., Гагельганс А. И.//Биохимия. —'1967.—Т. 32. — № 1. —С. 106— 109.
16. Хогебум Д., Шнейдер В. // Нуклеиновые кислоты: Пер. с англ. — М., 1957.
17. Dalvi R. R., Townsend W. // Chem. pharm. Bull. — 1976. —Vol. 24, № 9. — P. 2128—2131.
18. Kitig Т. £.// Meth. Enzymol. — 1967. — Vol. 10. — P. 322.
19. Sie H. G., Hablanian A.// Biochem. J. — 1965. —VoL 97, № 1. — P. 32—41..
20. Sweeney В. M. //Int. J. Cronobiol. — 1974. — No 2. — P. 25—33.
21. Thyrtnan R. G., Scholz R.//Euvop. J. Biocliein. 1969. —Vol. 10, № 3. —P. 459—467.
Vol. 2, 22. Williamson J. R., Ohkawa /(.. Meijer /1. /.//Alcohol
and Aldehyde Metabolising System. — New York, 1974.— — P. 365—383.
Поступила 24.10.80
УДК 615.9:628.32: [547.567 + 547.665]-07:616.151.5
Б. Т. Мазаев, В. Е. Василенко, А. П. Андрианов
ОПЫТ ИЗУЧЕНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
I ММИ им. И. М. Сеченова
Объектом гигиенического нормирования являлись производные хинондиазида и индена, присутствующие в сточных водах производства офсетных печатных форм. Аналоги изучавшихся соединений, по данным литературы, обладают как противогеморрагической активностью (витамин К и его синтетический заменитель викасол), так и антикоагу-лянтной (зооцид ратиндан). В связи с этим одной из задач подострого токсикологического эксперимента явилось установление характера и степени влияния ортонафто-хинондиазида и ннденкарбоновой кислоты (ИКК) на свертывающую систему крови. В качестве метода исследования был избран анализ тромбоэластограммы (ТЭГ), записанной на отечественном приборе гемокоагулографе ГКГМ1-03. Расшифровка ТЭГ производилась по общепринятой методике [11]. Данный метод считается одним из наиболее чувствительных при оценке состояния гемостаза в токсикологических исследованиях [5]. По данным Коваленко И. И. [6], результаты анализа показателей ТЭГ согласуются с данными исследования системы гемостаза традиционными методиками (протромбиновое и тромбиновое время, определение фибриногена в крови, общее время свертывания и т. д.).
В процессе эксперимента у контрольных белых крыс были выявлены изменения временных показателей ТЭГ относительно показателей фона. Чередование направленности этих изменений позволяет расценить их как проявления гипер-гипокоагуляционного синдрома — ГГКС (рис. 1). Тромбогеморрагический синдром, характеризующийся чередованием тромботических и геморрагических проявлений одного и того же процесса активации коагуляции, описан в 1962 г. М. С. Мачабели [9]. В настоящее время общепризнан неспецифический, универсальный характер ГГКС, описание которого имеется в работах ряда авторов [2, 8, 10]. Существующие различия в терминологии (тромбогеморрагический синдром, синдром потребления факторов свертывания, диссеминированное или локальное внутрисо-судистое свертывание) не меняют сущности данного синд-
14 12 10 8 6 4 2
%
_ \
> \ \
в
\
w
\
Фон
7
4
5
Рис. 1. Динамика изменения временных показателей ТЭГ в подостром опыте у контрольной группы животных.
По оси абсцисс — продолжительность опыта (в пед); но оси ординат—показатели ТЭГ (в мни), / — время реакции; 2 —время
коагуляции; 3 — общее время свертывания.
рома, как сложного патологического процесса, в основе которого лежит диссеминированное свертывание крови, являющееся следствием нарушения динамического равновесия свертывающей и противосвертывающей систем [3]. В. П. Балуда [1] приводит перечень патологических состояний, включающий около 50 названий (в том числе травматичные хирургические вмешательства, кровотечения и коллапс), при которых имеет место локальное или рассеянное внутрисосудистое свертывание.
В патогенезе ГГКС главная роль отводится активированному тромбопластину, который содержится во всех тканях организма. Выброс его в кровоток, вызывающий гиперкоагуляцию, происходит при повреждении сосудистой стенки, разрушении лейкоцитов, эритроцитов, при возбуждении парасимпатических и симпатических отделов нервной системы при различных патологических состояниях. Возникающая гиперкоагуляция сменяется фазой вторичной гипокоагуляции, которая обусловлена многими причинами: потреблением факторов свертывания, повышением антико-агуляциониой активности крови за счет деградации фибрина, образованием комплексных соединений гепарина с фибриногеном и др. [7]. Клинические фазы ГГКС выражаются в чередовании тромботических и геморрагических проявлен и и.
При интоксикации различными химическими соединениями как в эксперименте, так и в клинике, как правило, развиваются нарушения свертывания крови, которые могут быть отнесены к ГГКС. Характерно, что нарушения гемостаза нередко фиксируются раньше других клинических проявлений [4, 5]. Считается, что выявление ГГКС как неспецифической реакции организма подопытных животных на интоксикацию может служить чувствительным интегральным тестом в токсикологических исследованиях.
Причинами ГГКС у животных контрольной группы могли быть нарушения целостности сосудистой стенки и крово-потеря при взятии крови путем подъязычной венесекции.
Очевидно, в условиях нашего эксперимента изменения показателей ТЭГ у животных опытных групп являются следствием наложения аналогичных клинических проявлений ГГКС как реакции на повреждение сосудистой стенки и кровопотерю и специфического действия изучаемых веществ на систему гемостаза. Дифференцировка этих реакций в данных условиях весьма затруднительна. Необходимо отметить, что значимость для развития ГГКС такого воздействия, как взятие крови, определяется в первую очередь соотношением массы тела подопытных животных и степени повреждающего вмешательства. Так, для крыс взятие 3 мл крови (что составляет около 20 % объема циркулирующей крови), а также перерезка относительно крупной подъязычной вены достаточны для развития рассматриваемого синдрома. Можно предположить, что взятие такого же количества крови, например, у кроликов из ушной вены путем венепункции не вызовет выраженной реакции системы гемостаза. В этом случае изменения ТЭГ у животных опытных групп могут расцениваться только как реакция на интоксикацию.
Колебание показателен ТЭГ у крыс контрольной группы затруднило анализ и трактовку изменений систем гемостаза под действием изучавшихся веществ. Для выявления их специфического действия по показателям ТЭГ мы
