CC BY
72
УДК 616.9:616.61-002.151-06
Э.М. МИНГАЗОВА1, Т.А. ХАБЕЛОВА1, Д.А. ВАЛИШИН1, Ю.В. ВАХИТОВА2, О.И. КУТУЕВ1, Л.Р. ШАЙХУЛЛИНА1
башкирский государственный медицинский университет, 450000, г. Уфа, ул. Ленина, д. 3 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 71
Связь полиморфизмов генов цитокинов (TNFA, ¡L1B, IL1RN) и индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2A) с развитием осложнений у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом
Мингазова Эльвира Миноксановна — аспирант кафедры инфекционных болезней с курсом ИПО, тел. (347) 250-59-58, e-mail: [email protected]
Хабелова Тамара Александровна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней с курсом ИПО, тел. (347) 250-18-83, e-mail: [email protected]
Валишин Дамир Асхатович — доктор медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней с курсом ИПО, тел. (347) 250-18-83, e-mail: [email protected]
Вахитова Юлия Венеровна — доктор биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной фармакологии и иммунологии, тел. (347) 235-60-88, e-mail: [email protected]
Кутуев Олег Ильдерханович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней с курсом ИПО, тел. (347) 250-18-99, e-mail: [email protected]
Шайхуллина Лиана Робертовна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней с курсом ИПО, тел. (347) 250-18-80, e-mail: [email protected]
С целью выявления ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота с предрасположенностью к развитию инфекционно-токсического шока (ИТШ), ДВС-синдрома и острой почечной недостаточности (ОПН) у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведен анализ полиморфныхлокусов -308G>A гена TNFA, -511C>T, 3953C>T гена IL1B, VNTR во 2-м интроне гена IL1RN и (CCTTT)n гена NOS2A.
У больных ГЛПС, осложненной ИТШ, отмечено увеличение частоты аллеля TNF*A (p=0,01; OR=2,13; 95%CI 1,15-3,91). Риск развития ИТШ также повышен у носителей генотипа IL1B*C/*T локуса -511C>T гена IL1B (p=0,03; OR=2,78; 95%CI 1,10-7,38) и сочетания генотипов C/T-I/I (IL1B*-511C>T — IL1RN*VNTR) (p=0,02, OR=2,67; 95%C11,15-6,13). У больных с ИТШ наблюдалось увеличение частоты генотипа NOS2A*14/*16 (p=0,04; OR=4,01; 95%CI 1,49-10,85). Вероятность развития ДВС-синдрома была выше у пациентов с комбинацией генотипов T/T-C/Tполиморфных локусов -511С>Т, 3953С>Т гена IL1B (p=0,009; OR=6,4; CI 95% 1,45-21,3). У больных с ОПН преобладали аллель NOS2A*11 (p=0,005; OR=2,85; 95%CI 1,28-6,25) и генотип NOS2A*11/*14 (p=0,005; OR=5,17; 95%CI 1,97-13,57).
Ключевые слова: полиморфизм, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, инфекционно-токсический шок, острая почечная недостаточность, ДВС-синдром.
E.M. MINGAZOVA1, T.A. KHABELOVA1, D.A. VALISHIN1, Yu.V. VAKHITOVA2, O.I. KUTUEV1, L.R. SHAYKHULLINA1
1Bashkir Medical University, 3 Lenin St., Ufa, Russian Federation, 450000
institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center of RAS, 69 Oktyabrya Pr., Ufa,
Russian Federation, 450054
Relation of polymorphism in cytokines genes (TNFA, ¡LIB, IL1RN) and inducible nitric oxide synthase (NOS2A) with the development of complications in patients with hemorrhagic fever with renal syndrom
'3 (88) апрель 2015 г. Том 1
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 87
Mingazova E.M. — postgraduate student of the Department of Infection Diseases with Course IAS, tel. (347) 250-59-58, e-mail: [email protected]
Khabelova TA — Cand. Med. Sc., Docent of the Department of Infection Diseases with Course IAS, tel. (347) 250-18-83, e-mail: [email protected]
Valishin DA — D. Med. Sc, Professor of the Department of Infection Diseases with Course IAS, tel. (347) 250-18-83, e-mail: [email protected] Vakhitova Yu.V. — D. Biol. Sc., Head of the Laboratory of Molecular Pharmacology and Immunology, tel. (347) 235-60-88, e-mail: [email protected]
Kutuev O.I. — Cand. Med. Sc., Docent of the Department of Infection Diseases with Course IAS, tel. (347) 250-18-99, e-mail: [email protected] Shaykhullina L.R. — Cand. Med. Sc., Docent of the Department of Infection Diseases with Course IAS, tel. (347) 250-18-80, e-mail: [email protected]
To investigate the association polymorphic variants in genes of cytokines with endotoxic shock, hemorrhagic syndrome, renal failure for patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. The polymorphic regions -308G>A of the TNFA gene, -511C>T, 3953C>T of the IL1B gene, IL1RN intron 2 VNTR polymorphism, (CCTTT)n polymorphism of the NOS2A gene were analysed by polymerase chain reaction.
The risk of developing endotoxic shock was increased of carriers allele TNFA*А (p=0,01; OR=2,13; 95%CI 1,15-3,91). Individuals carrying genotype IL1B*C/*T (-511C>T) and C/T-I/I (IL1B*-511C>T — IL1RN*VNTR) haplotype exhibited more than double risk of developing endotoxic shock (p=0,03; OR=2,78; 95%C11,10-7,38 andp=0,02: OR=2,67; 95%C11,15-6,13 respectively). Also, genotype NOS2A*14/*16 was higher in patients with endotoxic shock (p=0,04; OR=4,01; 95%C1 1,49-10,85). The relative risk (OR) of developing hemorrhagic syndrome for carriers T/T-C/T haplotype of IL1B (-511C>T, 3953C>T) was 6,4 (p=0,009; 95%CI 1,45-21,3). The allele NOS2A*11 (p=0,005; OR=2,85; 95%C11,28-6,25) andNOS2A*11/*14 genotype (p=0,005; OR=5,17; 95%C11,97-13,57) were increased in patients with renal failure.
Key words: polymorphism, hemorrhagic fever with renal syndrome, endotoxic shock, hemorrhagic syndrome, renal failure.
Важная роль в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) принадлежит иммунопатологическим механизмам, в ауторегуля-ции иммунного ответа и его интеграции с функциями всех систем организма — цитокинам [1]. Зависимость выработки цитокинов от стимулирующих воздействий генетически детерминирована. Полиморфные варианты в генах цитокинов, изменяя уровень экспрессии, влияют на продукцию и функциональную активность белков цитокиновой сети.
Гены TNF-a (TNFA) расположены в пределах HLA класса III хромосомы 6 в области 6q2l.3. Полиморфный локус -308G>A гена TNFA ассоциирован с повышенной экспрессией гена in vitro [2]. В семейство IL-1 объединены три полипептида с высокой степенью гомологии, но разными биологическими свойствами: IL-la, iL-ip и их рецепторный антагонист — IL-1Ra. Гены, кодирующие белки семейства IL-1, картрированы на длинном плече хромосомы 2 (2q13-q21). В гене IL1B известно два однонуклео-тидных полиморфизма: в промоторной части в положении -511 (-511С>Т) и в 5-м экзоне (3953С>Т), где аллели -511Т и 3953Т ассоциированы с более высокой продукцией цитокина. [3]. В гене IL1RN определен минисателлитный полиморфизм — вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов (VNTR) во 2-м интроне, который предполагает существование пяти аллелей, имеющих определенное число повторов [4]. Наиболее часто встречаются аллель IL1RN*1, содержащий 4 повтора (73,6 % населения), и аллель IL1RN*2, содержащий 2 повтора (21,4 %) [5].
Большое значение в ранних иммунных реакциях у больных ГЛПС занимает повышенная секреция эндотелием оксида азота — молекулы с противовирусной активностью. Оксид азота (NO) синтезируется клетками из аминокислоты L-аргинина под влиянием фермента NO-синтазы [6]. В настоящее время идентифицированы три изоформы NO-синтазы (NOS): нейрональная (nNOS/NOS1), эндотелиаль-ная (eNOS/NOS3) и индуцибельная или макрофа-гальная (iNOS/NOS2). Семейство NOS2 в свою очередь включает три вида NO-синтаз: NOS2A, NOS2B
и NOS2C. Гены NOS2B и NOS2C расположены на хромосоме 17 в регионе 17p13.1-q25, а ген NOS2A — в регионе 17cen-q11.2 [7].
Под влиянием NOSl и NOS3 происходит непрерывный регулируемый, но малоинтенсивный синтез NO в ответ на рецепторную и физическую стимуляцию. NOS2 появляется в клетках после индукции их бактериальными эндотоксинами и некоторыми медиаторами воспаления, в частности цитокинами (IL-1, IL-2, INF-g, TNF и др.). Под влиянием NOS2 образуются высокие концентрации NO, оказывающие цитотоксическое действие [6].
В промоторном регионе гена NOS2A идентифицирован высокополиморфный сайт c варьирую-щем числом микросателитных тандемных пятинукле-отидных повторов (CCTTT)n, которые влияют на транскрипцию гена NOS2A, — увеличение числа повторов приводит к повышению транскрипционной активности гена [8].
Цель исследования — выявить ассоциацию полиморфных вариантов генов цитокинов (TNFA, IL1B, IL1RN) и индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2A) с предрасположенностью к развитию инфекционно-токсического шока (ИТШ), ДВС-синдрома и острой почечной недостаточности (ОПН) у больных ГЛПС.
Материал и методы
Всего обследовано 335 больных ГЛПС с серологически подтвержденным (в реакции непрямой имму-нофлюоресценции) диагнозом в возрасте от 15 до 65 лет. Среди пациентов мужчин было 293 (87,5%), женщин — 42 (12,5%).
Наиболее частым осложнением у больных был ИТШ — 30 чел. (8,9%): у 17 больных (5,1%) диагностирован ИТШ I ст., у 13 (3,9%) — ИТШ II ст., случаев декомпенсированного шока не было. ОПН наблюдалась у 20 чел. (5,9%), ДВС-синдром — у 15 чел. (4,5%).
ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции. Анализ полиморфных ДНК-локусов генов TNFA,
Таблица 1.
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -3080Л гена TNFA у больных с осложненным течением ГЛПС
Генотип, аллель Больные c ИТШ Больные без ИТШ
a pi±sp, CI % a pi±sp, CI %
*G/*G 14 46,67±9,11 (28,34-65,67) 205 67,21±2,69 (61,63-72,46)
*G/*A 12 40,0±8,94 (22,66-59,4) 84 27,54±2,56 (22,6-32,92)
*A/*A 4 13,33±6,21 (3,76-30,72) 16 5,25±1,28 (3,03-8,38)
n 30 305
X2 (P) 6,23 (0,04)
*G 40 66,67±6,09 (53,31-78,31) 494 80,98±1,59 (77,64-84,02)
*A 20 33,33±6,09 (21,69-46,69) 116 19,02±1,59 (15,98-22,36)
n 60 610
X2 (P) 6,92 (0,01)
Примечание:
п1 — количество обследованных с данным аллелем, генотипом;
— частота аллеля, генотипа; s — статистическая ошибка частоты аллеля, генотипа;
Р
п — объем выборки;
р — уровень значимости статистического критерия
Таблица 2.
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -511C>T гена IL1B у больных с осложненным течением ГЛПС
Генотип, аллель Больные c ИТШ Больные без ИТШ
ni Pi±sp/ CI % ni Pi±sp/ CI %
*C/*C 6 20,0±7,30 (7,71-38,57) 99 32,46±2,68 (27,26-38,03)
*C/*T 23 76,67±7,72 (57,72-90,07) 165 54,10±2,85 (48,33-59,79)
*T/*T 1 3,33±3,28 (0,08-17,22) 41 13,44±1,95 (9,82-17,79)
n 30 305
X2 (P) 6,05 (0,04)
*C 35 58,33±6,36 (44,88-70,93) 363 59,51±1,99 (55,49-63,43)
*T 25 41,67±6,36 (29,07-55,12) 247 40,49±1,99 (36,57-44,51)
n 60 610
X2 (P) 0,03 (0,89)
IL1B, IL1RN, NOS2A проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием локусспецифичных олигону-клеотидных праймеров [5, 7, 9]. Рестрикцию полиморфных локу-сов -308G>A гена TNFA, -511C>T, 3953C>T гена IL1B осуществляли эндонуклеазами Bsp19I, Ama87I, TaqI («Сибэнзим») в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Продукты амплификации и рестрикции разделяли при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле в 1xTBE-буфере. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в проходящем УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе UVP Epichemi3 Darkroom. Детекцию пятинуклеотидных повторов (CCTTT)n гена NOS2A проводили с использованием программного обеспечения LabWorksTM version 4.6 с использованием маркерар BR322DNA/BsurI.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ: Statistica 6,0 (StatSoft), RxC (Rows and Columns), MS Excel (Microsoft). При попарном сравнении выборок по частоте одного фенотипа использовали точный критерий Фишера. Дос-товерность различий в частотах встречаемости изученных признаков между группами больных определяли по критерию x2 с коррекцией Йейтса. Силу ассоциаций оценивали по отношению шансов (odds ratio — OR) [10].
Результаты и обсуждение
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -308G>A гена TNFA у больных ГЛПС в зависимости от развития осложнений (ИТШ, ОПН, ДВС-синдром) выявлены статистически значимые различия между группами больных с ИТШ и без ИТШ (х2 = 6,92; р=0,01 и х2=6,23; р=0,04 соответственно) (табл. 1). У больных с ИТШ отмечено увеличение частоты аллеля Т^*А — 33,33% против 19,02% у пациентов без данного осложнения (р=0,01; ОЯ=2,13; 95%С1 1,15-3,91). Генотип TNF*G/*G у больных с ИТШ наблюдался реже — 46,67%, чем у пациентов с не-осложненным течением ГЛПС — 67,21% (р=0,04; 0я=0,42; 95%С1 0,19-0,96). Частота генотипа TNF*A/*A была выше у больных с ИТШ — 13,33%, чем у пациентов без ИТШ — 5,25% (р>0,05).
'3 (88) апрель 2015 г. Том 1
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 89
При анализе полиморфного локуса -511С>Т гена К1В выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов между группами больных с ИТШ и без ИТШ (х2=6,05; р=0,04) (табл. 2). У пациентов с ИТШ отмечено увеличение частоты генотипа К1В*С/*Т — 76,67% по сравнению с больными без ИТШ — 54,10% (р=0,03; 0Я=2,78; 95%С1 1,10-7,38).
Выявлены статистически значимые различия в распределении частот комбинаций полиморфных локусов -511С>Т и 3953С>Т гена К1В у больных с ДВС-синдромом и пациентов с неосложненным ДВС-синдромом течением ГЛПС (х2 = 14,5; р=0,05). У больных с манифестацией ДвС-синдрома частота сочетания генотипов Т/Т-С/Т оказалась выше — 20,0%, чем у пациентов без данного осложнения — 3,12% (х2 = 6,88; р=0,009).
-308G>A полиморфизм гена TNFA является функционально значимым, влияющим как на базальную, так и на индуцированную экспрессию гена. Установлено, что аллель TNF*A является более мощным активатором транскрипции, чем аллель TNF*G. На линиях В-клеток человека показано, что присутствие аллеля TNF*A ассоциировано с повышением продукции цитокина в два раза по сравнению с аллелем TNF*G [2]. Аллельный вариант -511Т гена К1В характеризуется повышенной продукцией К-1в [9].
Значительный подъем уровней провоспалитель-ных цитокинов в разгар болезни выполняет про-тективную функцию с реализацией всего комплекса воспалительных и иммунных реакций. Однако чрезмерное повышение уровня синтеза Т^-а и П.-1Р, вызывающих запредельную активацию ней-роэндокринной системы, избыточную продукцию оксида азота, повышение проницаемости сосудов, плазморрею, усиление коагуляции, способно оказывать и повреждающее действие с развитием клиники инфекционно-токсического шока [6]. В связи с чем можно предположить, что постоянная выработка достаточно высоких концентраций Т^-а у носителей аллеля TNF*A и К-1р у гетерозигот -511С>Т полиморфизма гена К1В неблагоприятно сказывается на течении ГЛПС.
Аллель 3953Т гена К1В так же, как и аллель -511Т, ассоциирован с высокой продукцией цитокина К-1р [3]. Сочетание аллелей 3953Т и -511Т, по-видимому, обладает взаимоусиливающим эффектом: комбинация генотипов Т/Т-С/Т полиморфных локусов гена К1В (-511С>Т, 3953С>Т) чаще определяется у больных с ДВС-синдромом.
При распределении частот комбинаций -511С>Т полиморфизма гена К1В и VNTR полиморфизма гена IL1RN у больных с осложненным и неосложненным течением ГЛПС не выявлено статистически значимых различий в исследуемых выборках (х2 = 11,03; р=0,34). Однако у пациентов с ИТШ сочетание генотипов С/Т-1/1 наблюдалось значительно чаще — 44,33%, чем у больных без ИТШ — 22,3% (р=0,02; 0Я=2,67; 95%С1 1,15-6,13). Являясь естественным специфическим ингибитором Ш-1, К-Ша, конкурируя за связывание с одними и теми же клеточными рецепторами, блокирует активирующее действие К-1р на другие клетки и таким образом «ослабляет» воспалительную реакцию [5]. Аллель IL1RN*I гена IL1RN, согласно данным литературы, не оказывает существенного влияния на экспрессию гена [9]. Можно предположить, что сочетание в организме высокой концентрации К-1р, ассоциированной с аллелем -511Т, с низкой продукцией его рецеп-
торного антагониста у гомозигот по аллелю IL1RN*I усугубляет течение инфекционного процесса.
При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локус (ССТТТ)п гена NOS2A у больных с осложненным ИТШ и неосложненным течением ГЛПС не выявлено статистически значимых различий в сравниваемых группах (х2=6,32; р=0,75 и х2=30,72; р=0,42 соответственно). Однако у больных с ИТШ отмечено увеличение частоты генотипа NOS2A*14/*16 — 10,0% по сравнению с пациентами без шока — 1,97% (р=0,04; 0Я=4,01; 95%С1 1,49-10,85).
При сравнении распределения частот аллелей и генотипов (ССТТТ)п полиморфного локус гена NOS2A в группах пациентов с осложненной ОПН и неосложненной формами ГЛПС не выявлено статистически значимых различий (х2=11,62; р=0,3 и Х2=43,42; р=0,09 соответственно). У больных с ОПН преобладал генотип NOS2A*11/*14 — 20,0% против 3,5% у больных без ОПН (р=0,005; 0Я=5,17; 95%С1 1,97-13,57). У обследованных нами пациентов с ОПН также отмечено увеличение частоты аллеля NOS2A*11 — 27,5% по сравнению с пациентами без данного осложнения — 11,75% (р=0,005; 0Я=2,85; 95%С1 1,28-6,25). ^^
Предполагается, что увеличение числа (ССТТТ) п повторов приводит к повышению транскрипционной активности гена NOS2A. В экспрессирую-щих векторах, содержащих ген NOS2A с разным числом Сс///-повторов, а также репортерный ген люциферазы, показано, что аллель (ССТТТ)9 гена NOS2A при индукции К1р увеличивает экспрессию репортерного гена в 2,3 раза, (ССТТТ) 12 — в 3,4 раза, (ССТТТ)1 и (ССТТТ)15— в 4,0 раза, (ССТТТ)17 — в 3,9 раза 48]. Таким образом, средние формы (ССТТТ)п аллелей гена NOS2A, к которым условно относится аллель NOS2A*11, также ассоциированы с достаточно высокой продукцией N0, характерной для тяжелых форм ГЛПС [7]. Помимо N0S2 источником N0 (II) при хантавирусной инфекции также являются: синтез его эндотелиальной N0-синтазой, S-нитрозотиолы и динитрозильные комплексы N0 (II) с ионами железа в клетках эндотелия [6].
Повышенный синтез макрофагальными клетками оксида азота в результате активации N0S2 при ГЛПС направлен на ограничение распространение хантавируса. В значительных концентрациях оксид азота способен выполнять не только протективную функцию, но и оказывать цитотоксический эффект на собственные клетки организма, опосредованный образованием пероксинитрита, инициируя апоптоз или некроз клеток. Избыточная секреция оксида азота приводит к гипотензии, нарушению микроциркуляции, гипоксии, метаболическим нарушениям, с последующим некрозом клеток коркового слоя почек, что может послужить причиной развития ин-фекционно-токсического шока и острой почечной недостаточности [1, 6].
Таким образом, по данным нашего исследования, маркерами повышенного риска развития инфекци-онно-токсического шока у больных ГЛПС являются: аллель TNF*A -308G>A полиморфного локуса гена TNFA, генотип *С/*Т -511С>Т полиморфного локуса гена К1В, комбинация генотипов С/Т-1/1 (К1В*-511С>Т — IL1RN*VNTR), генотип NOS2A*14/*16 (ССТТТ)п; острой почечной недостаточности — аллель NOS2A*11 и генотип NOS2A*11/*14 (ССТТТ)п; ДВС-синдрома — комбинация генотипов Т/Т-С/Т полиморфных локусов -511С>Т, 3953С>Т гена К1В.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алехин Е.К., Камилов В.Х., Хунафина Д.Х. и др. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом // Медицинский вестник Башкортостана. — 2013. — Т. 8, №5. — С. 24-31.
2. Wilson A.G., Symons J.A., McDowell T.L. et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1997. — №94. — Р. 3195-3199.
3. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека // Цитокины и воспаление. — 2005. — Т. 4, №2. — С. 24-35.
4. Witkin S.S., Gerber S. Influence of interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism on disease // Clin. Infect. Dis. — 2002. — №34. — P. 204-209.
5. Wilkinson R.J., Patel P., Llewelyn M. et al. Influence of polymorphism in the genes for the interleukin (IL)-1 receptor antagonist and IL-1P on tuberculosis // J. Exp. Med. — 1999. — № 189. — P. 1863-1873.
6. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. Актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики. — Уфа, 2006. — 238 с.
7. Warpeha K.M., Xu W., Liu L., Charles I.G. et al. Genotyping and functional analysis of the
polymorphic (CCTTT)n locus of NOS2A in diabetic retinopathy // FASEB. J. — 1999. — №13. — P. 1825-1832.
8. Bloch K.D., Wolfram J.R., Brown D.M. et al. Three Members of the Nitric Oxide Synthase II gene family (NOS2A, NOS2B, and NOS2C) colocalize to Human chromosome 17 // Genomics. — 1995. — №27. — P. 526-530.
9. Makela S., Hurme M., Ala Houhala I. et al. Polymorphism of cytokine genes in hospitalized patients with Puumala hantavirus infection // Nefrol. Dial. Transplant. — 2001. — №16. — P. 1368-1373.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М.: Ме-диаСфера, 2006. 312 с.
