CC BY
105
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616-007-053.1-092:612.112.94.015.2:612.6]-078.33
Л.А. Гордеева1, О.А. Глушкова1, Е.Н. Воронина2, И.В. Шаталина1, А.Е. Шутров14,
О.С. Попова1, Ю.В. гареева34, ТА. Симонова5, И.М. Сутулина46, М.л. Филипенко2,
А.Н. глушков1
АССОЦИАЦИИ МАТЕРИНСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ (IL1B, IL1RN, TNF, IL4, IL6) с ВРОЖденнЫМИ ПОРОКАМИ РАзВИтИЯ У ПлОЦА И
новорожденного
1ФГБУН Институт экологии человека СО РАН, 650065, г. Кемерово; 2ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО Ран, 630090, г Новосибирск; 3МБУЗ гКБ № 3 им. М.А. Подгорбунского, родильный дом № 1, 650099, г. Кемерово; 4гБОУ ВПО КемПМА МЗ РФ, 650029, г Кемерово; 5ООО Клиника женского здоровья, 650055, г Кемерово;6МБУЗ ДПКБ № 5, 650065, г Кемерово
На рассмотрение выносится идея о том, что полиморфные варианты материнских генов цитокинов IL1B (rs1143634), IL1RN (VNTR интрон 2), TNF (rs1800629), IL6 (rs1800795) и IL4 (VNTR интрон 3) опосредованно вовлечены в патогенез врожденной аномалии развития у ребенка. В связи с этим изучали распределение частот аллелей и генотипов генов IL1B, IL1RN, TNF, IL6 и IL4, а также их сочетаний у женщин с врожденным пороком развития у плода и новорожденного (ВПРПН; n = 279) и у женщин с физиологическим течением беременности (n = 430), проживающих в Кемеровской области и принадлежащих к русской этнической группе. Результыты нашего исследования показали, что аллель (-308)A и генотип AA гена TNF у женщин могут в 3,2 и 14,3 раза (p = 0,004 и p = 0,013 соответственно) повышать вероятность развития врожденной аномалии ЦНС у ребенка. Ассоциации материнских полиморфных вариантов генов IL1B, IL1RN, IL4 и IL6 с ВПРПН отсутствовали.
Ключевые слова: врожденный порок развития, цитокины, генетический полиморфизм, ассоциация
L.A. Gordeeva1, O.A. Glushkova1, E.N. Voronina2, I.V Shatalina1, A.E. Shutrov1,4, O.S. Popova1, Yu.V Gareeva34, T.A. Simonova5, I.M. Sutulina4,6, M.L. Filipenko2, A.N. Glushkov1
ASSOCIATION OF MATERNAL POLYMORPHISMS OF CYTOKINE GENE (IL1B, IL1RN, TNF, IL4, IL6) WITH CONGENITAL MALFORMATIONS IN FETUS AND NEWBORN
institute of Human Ecology SB RAS, 650065, Kemerovo, Russia; institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, 630090, Novosibirsk; 3M.A. Podgorbusky municipal clinical hospital N 3, 650099, kemerovo; 4kemerovo State Medical Academy (kemSMA), 650029, kemerovo; 5women’s health clinic, 650055, kemerovo; 6children’s municipal clinical hospital N 5, 650065, kemerovo
It is supposed that maternal cytokine IL1B (rs1143634), IL1RN (VNTR intron 2), TNF (rs1800629), IL6 (rs1800795) and IL4 (VNTR intron 3) genes indirectly may be involved in the pathogenesis of congenital malformations in the offspring’s. We studied the distribution of frequencies of alleles and genotypes IL1B, IL1RN, TNF, IL6 and IL4 of genes, as well as their combinations in women with congenital malformation of the fetus and newborn (n = 279) and in women with physiological pregnancy (n = 430) living in the Kemerovo region and belonging to the Russian ethnic group. Our study showed that the allele (-308)A and the genotype AA of TNF gene in women at 3,2 and 14,3 times (p = 0,004 and p = 0,013, respectively) may be increase the risk of congenital anomalies of the central nervous system in the offspring. The associations of maternal IL1B, IL1RN, IL4 and IL6 genetics polymorphisms with congenital malformation of the offspring were not identified.
key words: congenital malformation, cytokine, polymorphism, gene, association
Врожденные пороки развития у плода и новорожденного (ВПРПН) являются многофакторным заболеванием, обусловленным генетическими и тератогенными причинами. Под тератогенными причинами подразумевается неблагоприятное воздействие на организм беременной женщины экзо- и эндогенных факторов, таких как проживание на экологически загрязненной территории, работа на канцерогенно-опасном производстве, никотиновая, алкогольная и наркотическая интоксикация, хроническое течение инфекций, передаваемых половым путем, соматическая патология и т. д. Влияние данного комплекса повреждающих факторов имеет наибольшее значение в критический период развития тканей и органов
* Гордеева Людмила Александровна - канд. биол. наук, тел. (3842) 54-59-52
эмбриона (между 16-ми и 75-ми сутками беременности) [1-3]. Между тем истинная причина порока чаще остается неизвестной. В последние годы сложилось мнение о том, что ВПРПН необходимо в первую очередь рассматривать как следствие разных нарушений здоровья родителей [1].
Во время беременности цитокины образуют важную коммуникационную сеть между матерью и плодом. Согласно теории иммунотрофизма Томаса Вегмана (1987), оплодотворенная яйцеклетка защищает саму себя, формируя пара- и аутокринное окружение противовоспалительных цитокинов, вырабатываемых Т-хелперами 2-го типа (ТЬ2-цитокины: например, интерлейкин (IL)-4, IL-6, IL-10 и др.), которые, доминируя, блокируют провоспалительную активность цитокинов Т-хелперами 1-го типа (ТЫ-цитокины: IL-1, фактор некроза опухоли a (TNFa) и др.) не только на локальном (децидуальные лимфоциты), но и на системном (перифери-
- 298 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
Т аблица 1
Распределение женщин по подгруппам в зависимости от врожденной аномалии развития у ребенка
Возраст, годы Пре-
Подгруппа n M ± SD min-max рыьанис беременности, n Врожденная аномалия
ССС 65 26,1 ± 5,2 19-42 4 Дефект межжелудочковой и/или предсердной перегородки, аномалии магистральных сосудов, тетрада Фалло
ЦНС 49 25,1 ± 5,41 17-42 19 Г идроцефалия, синдром Арнольда-Киари, анэнцефалия, spina bifida, экзен-цефалия (Q00-Q07)
МВС 48 24,6 ± 4,56 16-36 1 Врожденный гидронефроз, дисплазия почек (одно/двусторонняя), пиелоэктазия, поликистоз почек
КМС 29 26,6 ± 5,32 18-35 5 Полидактилия, укорочения трубчатых костей, отсутствие предплечья и кисти, вальгусные стопы
ПС 19 26,6 ± 6,71 18-39 - Гастрошизис, атрезия пищевода
ВПР губы и/ или неба 11 26,0 ± 5,4 20-38 - Расщелина неба, расщелина верхней губы, расщелина губы и неба (Q35-Q37)
ПО 5 27,4 ± 5,85 20-33 - Кистозная аномалия развития яичника, гипоспадия
МВПР 53 25, ± 4,97 17-39 15 Сочетание двух, трех видов врожденных
аномалий
Примечание. Здесь и в табл. 4: ССС - сердечно-сосудистая система (Q20-Q28); МВС - мочевыделительная система (Q60-Q64); КМС - костно-мышечная система (Q65-Q79); ПС - пищеварительная система (Q38-Q45); МВПР - множественные ВПР; ПО - врожденные аномалии развития половых органов (Q50-Q56).
ческие лимфоциты) уровне [4, 5]. Тем самым при физиологической беременности возникает колеблющееся равновесие между материнской выработкой Thl- и ТЬ2-цитокинов, которое может смещаться в любом направлении. Сдвиг цитоки-нового баланса в сторону высокой выработки №2-цитокинов может спровоцировать повышенную чувствительность матери к развитию аутоиммунных процессов и обострение хронического течения половых инфекций. Перевес в сторону Thl-медиируемого иммунного ответа может вызвать повреждение ткани трофобласта и подвергнуть риску выживаемость плода [6, 7]. Следовательно, генетически детерминированная иммунная несостоятельность на границе мать-плацента-плод может приводить к высокой проницаемости плаценты для тератогенов и способствовать аномальному развитию эмбриона (плода).
В настоящее время выявлен полиморфизм генов многих цитокинов. Установлено влияние отдельных аллельных вариантов генов цитокинов на скорость транскрипции, стабильность или качество мРНК, а также активность белковых продуктов их экспрессии [8, 9]. В связи с этим на рассмотрение выносится идея о том, что полиморфизмы материнских генов цитокинов (IL1B, IL1RN, TNF, IL6, IL4) опосредованно вовлечены в патогенез врожденной аномалии развития у ребенка. Поэтому целью настоящей работы стало изучение ассоциаций материнских полиморфизмов генов IL1B (rsl 143634), IL1RN (VNTR интрон 2), TNF (rs1800629), IL4 (VNTR интрон 3) и IL6 (rs18o0795) и их сочетаний с ВПРПН.
Материалы и методы. выборки. Обследованы образцы ДНК 709 женщин репродуктивного возраста с 2003-2011 г, проживающих в Кемеровской области и принадлежащих к русской этнической группе.
В группу сравнения (контроль) вошли образцы ДНК 430 женщин, у которых во время настоящей и предыдущих беременностей отсутствовали спонтанные выкидыши и врожденные аномалии развития у плода (ребенка). Из них на момент обследования 280 (65%) женщин были с физиологическим течением беременности в сроки 15-35 нед, а 150 (35%) - ро-
женицы условно здорового ребенка. Средний возраст обследуемых женщин 26,6 ± 5,55 (SD) года.
В исследуемую группу (группа ВПРПН) включили образцы ДНК 279 женщин. Из них на момент обследования 189 (67,7%) женщин были беременными (15-35 нед) и вынашивали плод, у которого с помощью ультразвукового исследования был установлен врожденный порок развития, подтверждающийся при повторных исследованиях, а 90 (32,3%) - роженицы с диагнозом у новорожденного "врожденный порок развития" (ВПР). Постановку клинического диагноза проводили врачи-неонатологи МБУЗ ДГКБ № 5, Кемерово. Средний возраст женщин в группе составил 25,6 года. Для выявления генотипов, ассоциированных с определенными пороками, внутри исследуемой группы выделили подгруппы в зависимости от типа врожденной аномалии развития у ребенка (табл. 1). Распределение ВПРПН по типу на подгруппы проводили в соответствии с МКБ-10 (Q00-Q99).
Все изучаемые подгруппы женщин по возрасту статистически значимо не отличались от группы контроля (р > 0,05).
Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с требованиями 9-го федерального закона «О персональных данных» № 15253 от 27.07.06.
Генотипирование. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили с помощью метода фенолхлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом [10], образцы ДНК хранили при -20°С.
В работе исследовали полиморфизмы G(-308)A гена TNF (rs1800629), T(+3953)C гена IL1B (rs1143634), G(-174) С гена IL6 (rs1800795), содержащие однонуклеотидные замены (SNP), и минисателлитные маркеры, характеризующиеся различным количеством тандемных повторов (VNTR), в ин-троне 2 гена IL1RN и интроне 3 гена IL4. Тест-системы для молекулярно-генетического анализа данных полиморфизмов разработаны в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).
Генотипирование TNF (rs1800629) проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Каждый образец амплифицировали с использованием пары специфических праймеров (5’-TTCCGAGGGGGGTCTTCTG-3’ и 5’-GTTCTATCTTTTTCCTGCATCCTGT-3’) и двух зондов (5’-FAM-CCCGTCCT CATGCCC-RT Q-3’ и 5’-R6G-CCCGTCCCCATGCCC-FQ-3’), несущих гаситель на 3’-конце и разные флюоресцентные красители (FAM и R6G) на 5’-конце. Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл, смесь содержала 40-100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200 нМ Taqman-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ dNTP, амплификационный буфер, термостабильную Taq-полимеразу - 0,5 ед. акт./реакц. Амплификацию проводили с помощью амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) в следующих условиях: начальная денатурация 3' при 96°С; затем 40 циклов, включающих денатурацию при 96°С - 8'', отжиг праймеров и последующую
- 299 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
Характеристика полиморфизмов генов IL1B, IL1RN, IL4, IL6 и их техники скрининга Таблица 2
Характеристика IL1RN IL1B (rs1143634) IL4 IL6 (rs1800795)
Тип полиморфизма VNTR 86 н. п. Одинарная замена C/T VNTR 70 н. п. Одинарная замена G/C
Участок полиморфизма Интрон 2 Экзон 5 (+3953) Интрон 3 промотор (-174)
ПЦР-праймеры 5’-CCCACTC-ATGGCCTT-GTTC-3’ и 5’-GGCTCAAT-GGGTACCACATC-3’ 5’-TCCCTA-CTGGTGTTGT-CATCAG-3’ и 5’-cTTGGGTGGA-CATGGT CCTG-3’ 5’-GGCTACTG-TGTG GTAAATAG-3’ и 5’-CCTACAACCGAT CT-GTCAGG-3’ 5’-CTTTTCCCCC-TAGTTGTGTCTTTC-3’ и 5’-TCATAGCT-GGGCT CCTGGAG-3’
Денатурация 95°С, 3' 95°c, 3' 95°C, 3' 95°C, 3'
Отжиг праймеров и последующая элонгация 68°C, 5'' 62°C, 5'' 60°C , 5'' 66°C, 5''
Синтез 72°C, 3' 72°C, 3' 72°C, 3' 72°C, 3'
Количество циклов 38 38 38 38
Рестрикция Нет Есть (Taq I) Нет Ксть (Taq I)
Электрофорез 1,5% агароза 8% ПААГ 1,5% агароза 8% ПААГ
Аллели (н. п.) *2:438 *4:524 *1:610 *3:696 C:440+ 110T: 550 2R:255 3R:325 G: 208 + 58 C: 185 + 23 + 58
Примечание. ПААГ - полиакриламидный гель.
элонгацию при 60°С - 35" (каждый шаг сопровождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующим интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G).
Полиморфизмгенов _й/КА(У№ГОинтрона2) и IL4 (VNTR интрона 3) изучали с помощью электрофореза продуктов ПЦР (структуры праймеров приведены в табл. 2). Аллели VNTR в гене IL1RN обозначали следующим образом: аллель IL1RN*1 содержал четыре тандемных повтора по 86 н. п.; аллель IL1RN*2 - два тандемных повтора; аллель IL1RN*3
- пять тандемных повтора; аллель IL1RN*4 - три тандемных повтора. Аллели VNTR в гене IL4 обозначали как 2R
- два тандемных повтора по 70 н. п., 3R - три тандемных повтора.
Типирование SNP полиморфизмов генов IL1B (rsl 143634) и IL6 (rs1800795) проводили с помощью сайт-специфической рестрикции ферментом TaqI (ООО «СибЭнзим», Новосибирск) продуктов ПЦР с последующей детекцией в электрофорезе.
Детальное описание условий типирования полиморфных вариантов генов IL1B, IL1RN, IL4 и IL6 приведено в табл. 2.
Статистическая обработка данных. Проверку гипотезы о равенстве генеральных средних при исследовании возрастных данных в изучаемых группах оценивали с помощью Н-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых выборок. В этом случае и при использовании других критериев нулевую гипотезу отвергали приp < 0,05 (ППП STATISTIKA
6.0, номер серии 31415926535897).
Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов, а также соответствие распределения наблюдаемых частот генотипов исследуемых генов теоретически ожидаемым по равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию %2. Вычисление проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl). Результаты анализа распределения частот генотипов и аллелей IL1B, IL1RN, TNF, IL4, IL6 у женщин изучаемых групп показали их соответствие ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга (р > 0,05).
Попарное сравнение частот аллелей и генотипов IL1B, IL1RN, TNF, IL6, IL4 и их сочетаний в изучаемых группах проводили при помощи четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации при числе степеней свободы, равном 1, а также двустороннего
точного теста Фишера, если значение, хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности, было меньше 5 (ППП STATISTIKA
6.0, номер серии 31415926535897). Ко всем экспериментально установленным значениям уровня значимости применяли поправку Бонферрони с целью исключения статистических ошибок при множественных сравнениях. Отличия между группами считали статистически значимыми, если экспериментально установленные значения уровня значимости были меньше уровня значимости по Бонферрони: р <0,05/m , где m - количество независимых статистических тестов на уровне значимости а.
Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины отношения шансов (OR - Odds Ration) : OR = (a ■ d)/(b • c), где a - частота аллеля (генотипа) в выборке женщин с ВПРПН; b - частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке; c - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке женщин с ВПРПН; d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контроле. Для OR рассчитывали доверительный интервал (CI) при 95% уровне значимости. Ассоциацию считали отрицательной, если OR было меньше 1; нейтральной (отсутствующей), если OR было равно 1; положительной, если OR было больше 1. Коэффициент OR высчитывали только для значимых по Бонферрони экспериментальных результатов.
Результаты. Для исследования нами были выбраны полиморфные варианты генов IL1B (rs1143634), IL1RN (VNTR интрон 2), TNF (rs1800629), IL4 (VNTR интрон 3) и IL6 (rs1800795), которые по ряду исследований влияют на продукцию соответствующих цитокинов. Методом «случайконтроль» изучали ассоциацию материнских аллелей и генотипов данных полиморфных локусов с ВПРПН. Данные исследования представлены в табл. 3.
Как оказалось, для большинства изучаемых материнских полиморфных вариантов генов цитокинов какие-либо значимые ассоциации с ВПРПН отсутствовали. Лишь только материнский полиморфизм гена TNF (rs1800629) отдельно имел значимые ассоциации с ВПРПН. Так, аллель (-308)A и генотип AA гена TNF значимо чаще встречались у женщин группы ВПРПН (17,8% против 11,3% в контроле для аллеля A; х2 = 9,99; р = 0,008; и 4,9% против 0,8% в контроле для генотипа AA; %2 = 8,68; р = 0,016). У женщин с аллелем (-308) A и генотипом AA гена TNF шансы формирования ВПРПН были равны 1,7 (CI 95%: 1,21-2,39) и 6,3 (CI 95%: 1,64-28,32) раза соответственно. Напротив, аллель (-308)G значимо чаще
- 300 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
Таблица 3
Частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфных локусов генов IL1B, IL1RN, TNFa, IL4, IL6 у женщин с физиологическим течением беременности и женщин с вПрПн
Группа женщин IL1B (rs1143634)
генотип аллель
TT CT CC T C
Контроль 22 (5,1) 160 (37,0) 250 (57,9) 204 (23,6) 660 (76,4)
ВПРПН 19 (6,6) 90(31,6) 176 (61,8) 128 (22,4) 442 (77,6)
Р 0,4691 0,1554 0,3377 0,6574
Группа женщин IL1RN (VNTR, интрон 2) Генотип Аллель
*1/*1 *1/*2 *2/*2 *1/*3 *2/*3 *1 *2 *3
Контроль 208 (48,8) 171 (40,1) 30 (7,0) 15 (3,5) 2 (0,6) 602 (70,7) 233 (27,3) 17 (2,0)
ВПРПН 134 (47,7) 118 (42,0) 20 (7,1) 4 (1,4) 5 (1,8) 390 (69,4) 163 (29,0) 9 (1,6)
p 0,8260 0,6803 0,9110 0,1470 0,1824 0,6540 0,5364 0,7359
Группа жен- TNFa (rs1800629)
щин Генотип Аллель
АА GA GG A G
Контроль 3 (0,8) 77 (20,9) 288 (78,3) 83 (11,3) 653 (88,7)
ВПРПН 12 (4,9) 63 (25,8) 169 (69,3) 87 (17,8) 401 (82,2)
p 0,0032 cor 0,016 0,1986 0,0159 cor 0,079 0,0016 cor 0,008
Группа жен- IL4 (VNTR, интрон 3)
щин Генотип Аллель
2R/2R 2R/3R 3R/3R 2R 3R
Контроль 27 (6,2) 144 (33,2) 263 (60,6) 198 (22,8) 670 (77,2)
ВПРПН 19 (6,6) 106 (37,1) 161 (56,3) 144 (25,2) 428 (74,8)
p 0,9434 0,3217 0,2840 0,3330
Группа жен- IL6 (rs1800795)
щин Генотип Аллель
cc GC GG C G
Контроль 105 (24,5) 213 (49,6) 111 (25,9) 423 (49,3) 435 (50,7)
ВПРПН 57 (20,0) 136 (47,9) 91 (32,0) 250 (44,0) 318 (56,0)
Р 0,1995 0,7006 0,7193 0,0570
Примечание. Здесь и в табл. 4: в скобках указана доля генотипов и аллелей (в %) от общего числа обследованных в данной группе.
встречался у женщин контрольной группы, чем у женщин группы ВПРПН (см. табл. 3).
При сравнении частот аллелей и генотипов гена TNF в разных морфологических подгруппах группы ВПРПН и контрольной группе установили, что они были сопоставимыми у женщин в подгруппах ВПР сердечно-сосудистой, мочевыделительной, пищеварительной систем, ВПР губы и/или неба и множественных ВПР (табл. 4). Женщины подгруппы ВПР половых органов были исключены из такого сравнения в связи с малочисленнстью (п = 5). В то же время аллель (-308)A (28,9% против 11,3% в контроле; х2 = 17,56; p = 0,004) и генотип AA гена TNF (10,5% против 0,8% в контроле; х2 = 13,87; p = 0,013) значимо чаще встречались у женщин подгруппы ВПР ЦНС. Для материнского аллеля (-308)A и генотипа AA гена TNF значение шансов развития врожденной аномалии ЦНС составило OR = 3,2 (CI 95%: 1,79-5,77) и OR = 14,3 (CI 95%: 2,56-84,91) раза соответственно.
При сопоставлении частот комбинаций генотипов IL1B (rs1143634), IL1RN (VNTR интрон 2), TNF (rs1800629), IL4 (vNTR интрон 3) и IL6 (rs1800795) в группе ВПРПН и контроле установили, что отдельные трехчленные и двучленные
комбинации материнских генотипов генов TNF, IL1RN, IL6 и IL4 имели ассоциации с ВПРПН (табл. 5). Однако коррекция по Бонферрони показала нивелирование результатов статистической значимости для всех сочетаний материнских генотипов, представленных в табл. 5. Тем не менее нужно отметить, что у женщин группы ВПРПН сочетание аллеля -308A гена TNF и генотипа -174GG гена IL6 выявляли чаще, чем в контрольной группе.
Обсуждение. Результаты нашего исследования показали, что характер распределения частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных локусов генов IL1B, IL1RN, TNF, IL4 и IL6 у женщин изучаемых групп (см. табл. 3) в целом согласуется с результатами других авторов относительно характера их распределения у жителей Западной Сибири [8, 11-13], отдельных регионов России [14] и европейских популяций [15, 16]. Между тем ассоциации материнских полиморфных вариантов генов IL1B, IL1RN, IL4 и IL6 с ВПРПН отсутствовали.
Мы установили, что только материнский полиморфный вариант промоторного региона в позиции (-308) G^A гена TNF имел значимые ассоциации с ВПРПН. Как выяснилось, у женщин носительство аллеля (-308)A и генотипа AA гена
- 301 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
Таблица 4
Распределение частот генотипов и аллелей гена TNFa у женщин с физиологическим течением беременности и у женщин с разными морфологическими вПрПн
Группа женщин TNFa (rs1800629)
генотипы аллель
AA GA GG A G
Контроль 3 (0,8) 77 (20,9) 288 (78,3) 83 (11,3) 653 (88,7)
ССС 1 (1,7) 14 (24,6) 42 (73,7) 16 (14,0) 98 (86,0)
ЦНС 4 (10,5)* 14 (36,8) 20 (52,6) 22 (28,9)** 54 (71,1)
МВС 2 (5,0) 7 (17,5) 31 (77,5) 11 (13,7) 69 (86,3)
КМС 2 (8,0) 5 (20,0) 18 (72,0) 9 (18,0) 41 (82,0)
ПС 0 3 (15,8) 16 (84,2) 3 (7,9) 35 (92,1)
ВПР губы и/или неба 0 2 (25,0) 6(75,0) 2(12,5) 14 (87,5)
МВПР 1 (2,2) 14 (30,4) 31 (67,4) 16(17,4) 76 (82,6)
Примечание.* -p = 0,013; ** - p = 0,004.
TNF имело высокий риск формирования ВПРПН (OR = 1,7 и OR = 6,3 соответственно).
По данным литературы, у людей аллель (-308)A в промоторе гена TNF связан с увеличенной продукцией белка TNF-a клетками иммунной системы [17]. Поэтому носители генотипа AA могут характеризоваться неадекватно увеличенной выработкой этого цитокина, как следствие более сильными воспалительными реакциями. Следует отметить, что мы не встретили ни одного сообщения относительно связи полиморфного локуса (-308) G^A гена TNF у матери с ВПРПН. В то же время нам удалось найти подтверждение связи женского аллеля (-308)A и генотипа AA гена TNF с другими видами патологии беременности. Установлено, что женщины с бактериальным вагинозом - носители генотипа AA гена TNF (rs1800629) - имели высокий риск преждевременных родов [18, 19]. Найдены ассоциации аллеля (-308)A гена TNF с развитием эндотелиальной дисфункции у женщин при гестозе [20], а также системным проявлением гестациональной гипертензии во время беременности [21].
При изучении вклада полиморфного локуса (-308) G^A гена TNF у матери в формирование врожденной аномалии развития у ребенка в зависимости от ее морфологической принадлежности установили, что материнский полиморфизм (-308) G^A гена TNF был ассоциирован только с образованием ВПР ЦНС у ребенка. Выявили, что аллель (-308) A и генотип AA гена TNF у женщин могут в 3,2 и в 14,3 раза
Таблица 5
Частоты материнских сочетаний генотипов изучаемых генов цитокинов в контроле и группе вПрПн
Сочетание генотипов Контроль (n = 364) ВПРПН (n = 243) p-уровень Pcor
Положительная ассоциация
TNF-308A/ILlRN*l/*2/IL6-174GG 1,3% 4,5% 0,0051 0,382
TNF-308AA/IL6-174GG 0% 2,5% 0,0094 0,667
TNF-308AA/IL4*3R,3R 0,5% 3,2% 0,022 1,000
TNF-308A/IL1B + 3953CT/IL6-174GG 0,5% 3,2% 0,023 1,000
Отрицательная ассоциация
TNF-308GG/IL1RN*1/*2/IL6-174CC 8,2% 3,3% 0,022 1,000
TNF-308GG/IL1B + 3953CT/IL1RN*1/*2 16,7% 10,3% 0, 036 1,000
Примечание. Приведены только те сочетания генотипов, для которых с помощью теста х2 с поправкой Йетса и двустороннего точного критерия Фишера выявили значимые отличия.
соответственно повышать вероятность развития врожденной аномалии ЦНС у ребенка. Между тем ассоциации материнского полиморфного локуса (-308) G^A гена TNF с остальными изучаемыми морфологическими группами ВПРПН отсутствовали.
Обнаруженная нами ассоциация материнского полиморфного варианта (-308) G^A гена TNF с ВПР ЦНС у ребенка описана впервые. Согласно данным литературы, аллель (-308)A имеет ассоциацию с развитием отдельных заболеваний ЦНС (рассеянный склероз [22], спорадическая болезнь Альцгеймера [23], болезнь Паркинсона [24]) у разных популяций людей. В то же время большинство исследователей рассматривают аллель (-308)A гена TNF в качестве маркера чувствительности к паразитарным, бактериальным и вирусным инфекциям [17].
Как показали клинические работы, формирование ВПР ЦНС у ребенка чаще всего обусловлено внутриутробным инфицированием вирусами герпеса, цитоме-галовирусом (ЦМВ), а также респираторными вирусами, тогда как связь токсоплазменной и микоплазменной инфекций с ВПР ЦНС у ребенка дискутируется [2, 25, 26]. Предполагается, что вирусные инфекции герпеса и ЦМВ являются пусковым механизмом в развитии гипокси-ишемических поражений плаценты, в результате чего становится возможной передача вируса от матери к плоду [27]. Результаты модельных исследований на мышах показали, что анти-TNFa-терапия способствует улучшению резистентности организма к ЦМВ-инфекции [28]. Локальное повышение синтеза TNFa вызывает появление основных клинических симптомов герпетической инфекции, усиливает и пролонгирует воспалительные изменения за счет активации иммунокомпетентных клеток с последующей секрецией других цитокинов (IL-1 и IL-6), потенцирующих воспалительный процесс и усугубляющих повреждение тканей. Кроме того, хроническая избыточная продукция TNF-a способствует апоптозу T-клеток, формируя иммунодефицит, возникающий при персистен-ции герпес-вирусов [29, 30].
Недавно установлено, что у людей генотип AA гена TNF (rs1800629) ассоциирован с риском быстрого прогрессирования и неблагоприятного исхода медленных инфекций вирусов герпеса и иммунодефицита человека (ВИЧ). Напротив, аллель (-308)G и генотип GG гена TNF, проявляли защитный эффект в отношении быстрого прогрессирования герпетической и ВИЧ-инфекций [29]. Исходя из данных литературы и собственных результатов, можно предположить, что избыточная продукция белка TNF, детерминируемая аллелем (-308)A гена TNFa, у женщин может отражаться на механизмах специфической и неспецифической защиты против вирусов. Поэтому беременные женщины - носители аллеля (-308)A и в большей степени генотипа AA гена TNF - могут иметь высокую восприимчивость к вирусным инфекциям особенно на ранних этапах эмбриогенеза в момент закладки и формирования нервной трубки у эмбриона. Но для того чтобы подтвердить наше предположение, требуется дальнейшее исследование с учетом клинических характеристик женщин во время беременности.
Таким образом, результаты нашего исследования показали, что материнский полиморфный вариант гена TNF (rs1800629) ассоциирован только с формированием ВПР ЦНС у ребенка. Типирование гена TNF у женщин репродуктивного возраста может быть использовано для выявления групп женщин с высоким риском ВПР ЦНС у ребенка.
- 302 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонова И.В., Богачева Е.В., Китаева Ю.Ю. Роль экзогенных факторов в формировании врожденных пороков развития. Экология человека. 2010; 6: 30-5.
2. Тератология человека: Руководство для врачей. М.: Медицина; 1991.
3. Хаматханова Е.М., Кучеров Ю.И. Эпидемиологические аспекты врожденных пороков развития. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2007; 6: 35-9.
4. Хонина Н.А., Дударева А.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Останин А.А., Пасман Н.М. и др. Нарушение механизмов иммунной супрессии при беременности, осложненной ге-стозом. Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2003; 3: 74-8.
6. Колесникова Н.В. Цитокиновый статус беременных с хронической фетоплацентарной недостаточностью (обзор). Российский иммунологический журнал. 2010; 4 (4): 343-51.
7. Ширшев С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции. Екатеринбург: УрО РАН; 2002; т. 2.
8. Голованова О.В., Коненков В.И., Шевченко А.В., Коломейчук М.Ю., Завьялова М.В., Вторушин С.В. Полиморфизм гена TNFA (C-863A, G-308A, G-238A) у больных раком молочной железы. Иммунология. 2009; 30 (2): 92-4.
9. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека. Цитокины и воспаление. 2005; 4: 3-12.
11. Горева Е.П., Силков А.Н., Сенникова Н.С, Максимов В.Н., Чердынцева Н.В. Полиморфизмы гена IL-1P, их связь с уровнем продукции IL-1P мононуклеарными клетками и риском развития рака молочной железы. Вестник Уральской академической науки. 2010; 2/1 (29): 29.
12. Рудко А.А., Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н., Лошкова Е.В., Пузырев В.П. Полиморфизм генов-модификаторов иммунного ответа: влияние на развитие целиакии и варианты ее клинического течения в Томской области. Молекулярная биология. 2008; 42 (1): 42-9.
13. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коломейчук М.Ю., Коненков В.И., Гарбуков Е.Ю.,Стахеева М.Н. Полиморфизм про-мотерного региона генов IL-4, IL-6 и IL-10 у пациенток с раком молочной железы. Медицинская иммунология. 2009; 11 (1): 21-8.
14. Данилко К.В., Корытина Г.Ф., Ахмадишина Л.З., Янбаева Д.Г., Зигиддулин Ш.З., Викторова Т.В. Ассоциация полиморфных маркеров генов цитокинов (IL1B, IL1RN, TNFA, LTA, IL6, IL8, IL10) с развитием хронической обструктивной болезни легких. Молекулярная биология. 2007; 41 (1): 26-36.
17. Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм гена TNFA и патология // Цитокины и воспаление. 2005; 4 (3): 4-10.
20. Радьков О.В., Калинкин М.Н., Заварин В.В. Влияние полиморфизма генов цитокинов на формирование дисфункции эндотелия при гестозе. Цитокины и воспаление. 2010; 9 (3): 15-8.
22. Макарычева О.Ю., Царква Е.Ю., Судомоина М.А. Кулакова О.Г., Быкова О.В., Гольцова Н.В. и др. Анализ сцепления и ассоциации аллелей генов провоспалительных цитокинов IL-6, IFNG и TNF с рассеянным склерозом с помощью теста неравновесной передачи аллелей (TDT). Молекулярная биология. 2010; 44 (5): 26-36.
25. Островская О.В., Ивахнишина М.Н., Будко Н.М. Власова М.А., Наговицина Е.Б, Морозова И.О. Инфекции матери -одно из звеньев мультифакториальной природы врожденных дефектов. Справочник педиатра. 2010; 4: 31-41.
26. Попова О.В., Боконбаева С.Дж. Особенности перинатальных поражений ЦНС при персистирующих вирусных инфекциях. Вестник КРСУ. 2006; 6 (2): 85-90.
27. Буштырева И.О., Курочка М.П., Гайда О.В., Волокитина Е.И. Гестоз: инфекционная болезнь или нет? В кн.: Материалы X Всероссийского научного форума «Мать и дитя»: 29 сентября-2 октября. М.; 2009; 32.
29. Сухаленцева А.Н., Наследникова И.О., Чернов А.С., Решетников В.И., Уразова О.И., Новицкий В.В. и др. Полиморфные
варианты промоторного региона гена INFy и гена TNFa как маркеры восприимчивости к медленным вирусным инфекциям. Молекулярная медицина. 2011; 3: 23-7.
REFERENCES
1. Antonova I.V., Bogacheva E.V., Kitaeva Yu.Yu. Role of exogenous factors in malformations forming. Ekologiya cheloveka. 2010; 6: 30-5 (in Russian).
2. Human teratology: A guide for physicians. Moscow: Meditsina; 1991 (in Russian).
3. Khamatkhanova E.M., Kucherov Yu.I. Epidemiological aspects of congenital malformations. Rossiyskiy vestnik perinatologii i pediatrii. 2007; 6: 35-9 (in Russian).
4. Khonina N.A., Dudareva A.V., Tikhonova M.A., Leplina O.Yu., Ostanin A.A., Pasman N.M. et al. Defect of active immunosuppression in pregnancy-induced hypertension. Byulleten’ Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2003; 3: 74-8 (in Russian).
5. Guilbert L., Robertson S.A., Wegmann T.G. The trophoblast as an integral com a macrophage-cytokine network. Immunol. cell Biol. 1993; 71: 49-57.
6. Kolesnikova N.V Cytokine status in pregnant women with chronic fetoplacental insufficiency (Literature review). Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2010; 4 (4): 343-51 (in Russian).
7. Shirshev S.V Mechanisms of immune-endocrine control of reproduction’s process. t. 2. Ekaterinburg: UrO RAN; 2002; t. 2 (in Russian).
8. Golovanova O.V., Konenkov V.I., ShevchenkoA.V., Kolomeychuk M.Yu., Zav’yalova M.V., Vtorushin S.V TNFA gene polymorphism (C-308A, G-308A, G-238A) in patients with breast cancer. Immunologiya. 2009; 30 (2): 92-4 (in Russian).
9. Gromova A.Yu., Simbirtsev A.S. Gene polymorphisms of interleukin-1 family cytokines. Tsitokiny i vospalenie. 2005; 4:
3- 12 (in Russian).
10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. In: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor, Lab. Press.; 1989.
11. Goreva E.P., Silkov A.N., Sennikova N.S, Maksimov VN., Cherdynt-sevaN.V. IL-1P polymorphism, its relation to the level of IL-1P production by mononuclear cells and the risk of breast cancer. Vestnik Ural’skoy akademicheskoy nauki. 2010; 2/1 (29): 29 (in Russian).
12. Rudko A.A., Kondrat’eva E.I., Yankina G.N., Loshkova E.V., Puzyrev VP. Influence of polymorphism of immune defense modifier genes on celiac disease development and various clinical features of disease in Tomsk population. Molekulyarnaya bi-ologiya. 2008; 42 (1): 42-9 (in Russian).
13. Shevchenko A.V., Golovanova O.V., Kolomeychuk M.Yu., Konenkov V.I., Garbukov E.Yu., Stakheeva M.N. Promotor polymorphism of IL-4, IL-6, and IL-10 genes among patients with breast cancer. Meditsinskaya immunologiya. 2009; 11 (1): 21-8 (in Russian).
14. Danilko K.V., Korytina G.F., Akhmadishina L.Z., Yanbaeva D.G., Zigiddulin Sh.Z., Viktorova T. V. Association of cytokines genes (IL1, IL1RN, TNF, LTA, IL6, IL8, IL10) polymorphic markers with chronic obstructive pulmonary disease. Molekulyarnaya bi-ologiya. 2007; 41 (1): 26-36 (in Russian).
15. Genevay S., di Giovine F.S., Perneger T. V., Silvestri T., Stingelin
S., Duff G., et al. Association of interleukin-4 and interleukin-1B gene variants with Larsen score progression in rheumatoid arthritis. Arthr. and Rheum. 2002; 47: 303-9.
16. Unfried G., Bocskor S., Endler G., Nagele F., Huber J.C., Tempfer C.B. A polymorphism of the interleukin-6 gene promoter and idiopathic recurrent miscarriage. Hum. Reprod. 2003; 18: 267-70.
17. Rydlovskaya A.V., Simbirtsev A.S. TNFA functional gene polymorphism and pathology. Tsitokiny i vospalenie. 2005; 4 (3):
4- 10 (in Russian).
18. Himes K.P., Simhan H.N. Genetic susceptibility to infection-mediated preterm birth. Infect. Dis. Clin. N. Am. 2008; 22: 741-53.
19. Macones G.A., Parry S., Elkousy M., Clohier B., Ural S.H., Strauss J.F. 3rd. A polymorphism in the promoter region of TNF
- 303 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
and bacterial vaginosis: preliminary evidence of gene-environment interaction in the etiology of spontaneous preterm birth. Am. J. Obstet. Gynecol. 2004; 190: 1504-8.
20. Rad’kov O.V, Kalinkin M.N., Zavarin V.V. Endothelial dysfunction in pregnant women with preeclampsia depending on cytokine genes polymorphism. Tsitokiny i vospalenie. 2010; 9 (3): 15-8 (in Russian).
21. Chen Y.-P., Pfab T., Slowinski T., Richter C-M., GodesM., Hoch-er B. Impact of genetic variation of tumor necrosis factor-а on gestational hypertension. Chin. Med. J. 2006; 119: 719-24.
22. Makarycheva O.Yu., Tsarkva E.Yu., Sudomoina M.A. Kulakova O.G., Bykova O.V., Goltsova N.V. et al. Linkage and association of proinflammatory cytokines genes IL-6, IFNG and TNF with multiple sclerosis. Molekulyarnaya biologiya. 2010; 44 (5): 26-36 (in Russian).
23. Qidwai T., Khan E.F. Tumor necrosis factor gene polymorphism and disease prevalence. Scand. J. Immunol. 2011; 74: 522-47.
24. Wahner A.D., Sinsheimer J.S., Bronstein J.M., Ritz B. Inflammatory cytokine gene polymorphisms and increased risk of Parkinson disease. Arch. Neurol. 2007; 64: 836-40.
25. Ostrovskaya O.V., Ivakhnishina M.N., Budko N.M. Vlasova M.A.,
Nagovitsina E.B, Morozova I.O. Maternal infections - one of the sections of multifactorial congenital defects nature. Spravochnik pediatra. 2010; 4: 31-41 (in Russian).
26. Popova O.V., BokonbaevaS.Dzh. Features perinatal CNS lesions in persistent viral infections. Vestnik KRSU. 2006; 6 (2): 85-90 (in Russian).
27. Bushtyreva I.O., Kurochka M.P., Gayda O.V., Volokitina E.I. Preeclampsia: an infectious disease or not? In.: Materials X Russian scientific forum “Mother and Child”. September 29-October 2. Moscow; 2009: 32 (in Russian).
28. Pavic I., Polic B., Crnkovic I., Lucin P., Jonjic S, Koszinowski U.H. Participation of endogenous tumor necrosis factor a in host resistance to cytomegalovirus infection. J. Gen. Virol. 1993; 74: 2215-23.
29. Sukhalentseva A.N., Naslednikova I.O., Chernov A.S., Reshetnik-ov V.I., Urazova O.I., Novitskiy V.V. et al. Immunogenetic markers of slow virus infections. Molekulyarnaya meditsina. 2011; 3: 23-7 (in Russian).
30. Herbein G., O’Brien W.A. Tumor necrosis factor (TNF)-a and TNF-receptors in viral pathogenesis. Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.). 2000; 223: 241-7.
Поступила 06.09.13
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ
© Г.в. БРЮХИН, А.в. ШОПОВА
УДК 616.36-02:615.2/.3]-092:612.112.95]:618.3-092:9
Г.В. Брюхин, А.В. Шопова
АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК МАКРОФАГОВ РАЗЛИЧНЫХ
компартментов у потомства самок крыс с лекарственным поражением печени
Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Минздрава России, 454092, г Челябинск, ул. Воровского, 64, тел. 232-01-50 viktoriya malinina@list.ru
Проведено исследование влияния экспериментального лекарственного поражения печени матери на способность к ловушкообразованию, а также активности внеклеточных ловушек макрофагов различных компартментов у потомства. Ловушкообразующую способность оценивали по двум параметрам. Количество ловушек было снижено в опытной группе, а длина хвоста внеклеточных сетей, напротив, оказалась большей в фагоцитирующих клетках, выделенных от крысят опытной группы. Установили угнетение активности макрофагальных внеклеточных ловушек у потомства самок крыс опытной группы, что проявляется снижением количества активных ловушек, индекса макрофагальной ловушки и киллинговой активности изучаемых мононуклеаров. Результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что у матерей с лекарственным поражением печени рождается физиологически незрелое потомство с угнетением защитных реакций, что в последствии приводит к нарушению неспецифической резистентности организма плода.
Ключевые слова: активность макрофагальных ловушек, способность к ловушкообразованию, киллинг, поражение печени, потомство
G.V Bryuhin, A.V Shopova
THE ACTIVITY oF TRAPS FoRMATIoN of MAKRoFAGES of DIFFERENT KoMPARTMENTS of THE
posterity of female rats with medicinal liver defeat
The investigation of effect of the experimental drug liver defeat of mother's on ability to trap and the activity of macrophage extracellular traps of different compartments in the posterity was studied. Trap ability was assessed in two ways. Number of traps was reduced in the experimental group, and the length of the tail of extracellular networks, by contrast, was greater in the phagocytic cells isolated from experimental rats. Inhibition of macrophage extracellular traps in the posterity of female rats of the experimental group, which manifested by reduced number of active traps, index of a makrophage trap and killing activity of studied mononuclear cells was found. Results of the study suggest that the mothers with drug liver defeat have physiologically immature posterity with depression of protective reactions, which, in consequence, leads to defeat of non-specific resistance of the fetus.
Key words: macrophage traps activity, the ability to traps, killing, liver defeat, posterity
- 304 -
