CC BY
46
УДК 664
Е. В. Никитина, М. С. Цыганов, А. И. Вафина
СВОЙСТВА ТАПИОКОВЫХ КРАХМАЛОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ АМИЛАЗОЙ BACILLUS LICHENIFORMIS
Ключевые слова: амилаза, тапиоковый крахмал, вязкость, амилоза, температура желирования.
Модификация тапиокового крахмала была проведена с помощью амилазы Bacillus licheniformis. Ферментно модифицированные крахмалы, обработанные различной концентрацией фермента, имели различные технологические и химические свойства. Отмечено повышение доли амилозы в 5 и более раз, повышение температуры желирования на 2 - 7 °C, снижение вязкости в 2-4 раза и снижение концентрации редуцирующих сахаров в 2-3 раза в сравнении с нативным.
Keywords: amylase, tapioca starch, viscosity, amylose, gelling temperature.
The modification of tapioca starch was carried out with Bacillus licheniformis amylase. Enzymatically modified starches, treated with different enzyme concentrations, had different technological and chemical properties. There was an increase in the proportion of amylose by 5 or more times, an increase in the gelling temperature by 2-7 ° C, a decrease in viscosity by a factor of 2-4, and a reduction in reducing sugars by 2-3 times in comparison with the native one.
Введение
Крахмал является одним из самых важных и универсальных пищевых ингредиентов, обладающим дополнительными атрибутами для бесчисленного промышленного использования [1].
Тропические корнеплоды и клубни всемирно признаны важными продовольственными культурами, они являются богатыми источниками крахмала, а также многих витаминов и минералов [2].
Одним из тропических корнеплодов, содержащих крахмал, является кассава (Manihot esculenta Crantz) -вечнозеленая многолетняя культура, произрастающая во многих частях Азии, Африки и Южной Америки. Крахмал, полученный из кассавы, называется тапиоковым, он подробно изучен и находит применение в широком спектре отраслей промышленности [3].
Крахмалы в основном используются как источники углерода в пищевых продуктах, в следствии чего их промышленное применение. начало бурно развиваться в 20-м веке [4].
Нативный крахмал имеет несколько недостатков, такие как низкая растворимость, высокая вязкость крахмального геля при комнатной температуре, необратимая ретроградация и другие [5]. Эти недостатки могут быть преодолены с помощью модификации, которая направлена на получение определённого крахмала с заданными управляемыми свойствами, что в свою очередь повышает универсальное использование крахмала, а также удовлетворяет потребительский спрос [6].
Для модификации крахмала применяются физические, химические, ферментативные и биотехнические модификации, однако в последние десятилетия мы наблюдаем переход от кислотного гидролиза к ферментативному, который превращает крахмал в мальтодекстрины, глюкозные и фруктозные сиропы [7].
Целью данной работы является анализ физико-химических свойств модифицированных тапиоковых крахмалов, при варьировании концентрации
фермента, в качестве которого выступала амилаза Bacillus licheniformis.
Материалы и методы исследования
Используемые крахмалы. В качестве объекта исследования выступал нативный тапиоковый крахмал (Nat) (ГОСТ Р 51953-2002) и крахмал, ферментированный препаратом амилазы B. licheniformis.
Получение амилазного препарата. Препарат амилазы Bacillus licheniformis получали на селективной среде на кафедре биохимии Казанского федерального университета (КФУ).
Среда, оптимизированная для синтеза а-амилазы:
кукурузная мука - 8%; пшеничная мука - 8 %; кормовые дрожжи - 3 %; MgS04x7H20 -0,2 %; СаСОз - 0,25 %.
Значение рН среды до стерилизации устанавливали 8,0-8,2. Процесса культивирования штамма осуществляли в колбах объемом 750 мл с 30 мл ферментационной среды на качалке (240 об/мин) при 37-43 °С в течение 48 - 144 ч. Препараты получали, отделяя биомассу клеток продуцента от культуральной жидкости центрифугированием 8000 об/мин в течение 10 мин.
После чего проводили определение амилазной активности.
Определение амилазной активности. В опытную пробирку к 0,5 мл фермента (культуральной жидкости) добавить 0,5 мл субстрата (1 % растворимого крахмала в ацетатном буфере), инкубировать в течение 30 минут при 50 о. Затем Добавить 450 мкл 3,5-динитросалициловой кислоты (DNSA) (стоп раствора). Стоп раствор готовится 0,5 г. DNSA растворить в 30 ml H20 при 50о С с добавлением 5 ml Na,K раствора (8 г. NaOH + 11,2 г. KOH растворить в 50 ml H2O) и 5 мл раствора (15г Na,K виннокислый в 50 мл H2O). Смесь инкубируют на кипящей бане в течение 5 минут при 100оС, охлаждают в течение 5 минут при 0оС.
Добавляют 4,5 мл дистиллированной воды и измеряют при 540 нм, по отношению к контролю. Контроль готовится следующим образом: контрольные пробирки с 0,5 мл субстрата (1 % растворимого крахмала в ацетатном буфере) инкубируют в течение 30 минут при 50 о. Добавляют 450 мкл DNSA (стоп раствора). Потом добавить 0,5 мл фермента (культуральной жидкости) и инкубировать на кипящей бане в течение 5 минут при 100 оС, Охладить в течение 5 минут при 0 оС и добавить 4,5 мл дистиллированной воды. Оценивать по калибровочной кривой редуцирующих сахаров (глюкозе).
Модификация крахмалов. Модификацию осуществляли в дистиллированной воде при рН=7.5 при температуре 40 °С, 60 мин, с регулярным перемешиванием смеси крахмала и фермента в воде. Концентрация крахмала в реакционной смеси 30г/100мл. Реакцию гидролиза останавливали путем добавления концентрированной серной кислоты до рН=2. Затем крахмал отделяли от жидкости фильтрованием и высушивали при 40°С в сушильном шкафу с дальнейшим высушиванием при комнатной температуре.
В зависимости от концентрации используемой амилазы крахмалы были названы: В1-1; В1 -0,5; В1 -0,25; В1 -0,1; В1 -0,05 (табл. 1).
Таблица 1 - Варианты и условия получения ферментно обработанных крахмалов
Y = 85,24 х X - 13,19, где Х - это величина поглощения при 625 нм [8].
Определение декстрозного эквивалента осуществляли стандартным методом Лэйна-Эйнона [9].
Определение температуры желирования проводили у 1 % раствора крахмала в дистиллированной воде при медленном нагревании на водяной бане. Отмечается температура, при которой происходит загустевание клейстера и осветление массы. Температуру желирования образцов фиксировали с помощью электронного термометра Piccolo (HI 98111) (Hanna, Italy).
Результаты исследования
Для крахмалов, обработанных ферментным препаратом амилазы Bacillus licheniformis, характерна значение вязкости в 2-4 раза меньшее, чем у нативного. При увеличении используемой для модификации концентрации фермента от 2,07 до 8,3 U/г крахмала в ряду полученных крахмалов характерно незначительное повышение вязкости (образцы B-0,25, B-0,5 и B-1) (рис. 1). Исключением является образец В-0,05, который при низкой концентрации фермента продемонстрировал повышение вязкости до 3,98. Наименьшая вязкость равная 1,44, выявлена у образца В-0,1.
Вари Активность Концентрация Вид
ант фермента, культуральной модифициро
U/г жидкости, мл/ ванного
крахмала 100 мл крахмала
реакционной
смеси
1. 8,3 1 Bl -1
2 4,15 0.5 Bl -0,5
3 2,07 0.25 Bl -0,25
4 0,83 0.1 Bl -0,1
5 0,415 0.05 Bl -0,05
Для дальнейших исследований высушенный крахмал измельчали до порошкообразной формы. Влажность крахмалов была в пределах нормы и варьировала от 7 до 9 %.
Определение динамической вязкости. Вязкость определяли у 1 % раствора крахмала, предварительно клейстерезованного и охлажденного до 20оС на вискозиметре .
Определение амилозы. Реактивы: А - KJ - 20 г и 2 г J2 растворяют в 100 мл дистиллированной воды (сначала растворяют в минимальном количестве этилового спирта). В - 10 мл раствора А разводят водой до 100 мл в мерной колбе.
Для определения содержания амилозы 20 мг крахмала смешивают с 10 мл 0,5 Н KOH в мерной колбе и перемешивают на магнитной мешалке 5 мин, затем доводят до 100 мл дистиллированной водой. От этого объема отбирают 10 мл и смешивают с 5 мл 1Н HCl и 0,5 мл йодного раствора В и доводят дистиллированной водой до 50 мл. В течение 5 минут измеряют при 625 нм. Расчет процентного количества амилозы вычисляем по формуле:
Nat В-0,05 В-0,1 В-0,25 В-0,5 В-1
Вид крахмала
Рис. 1 - Вязкость нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов
Содержание амилозы в модифицированных амилазой тапиоковых крахмалах значительно повышалось. Количество амилозы у крахмалов, обработанных низкой концентрацией амилазы Bacillus licheniformis (образцыВ-0,05 и В-0,01) увеличился по сравнению с нативным, однако дальнейшее увеличение количества амилазы в реакционной смеси привело к монотонному снижению доли амилозы в полученных крахмалах в образцах, начиная с образца В-0,25 до В-1(рис. 2). Максимальное количество амилозы, равное 25,33 %, было у образца В-0,1.
Декстрозный эквивалент используется для отображдения степени гидролиза крамала [10]. При ферментной модификации крахмалов декстрозный эвивалент снизился в 2 - 2,5 раза по сравнении с нативным. Наименьший показатель, равный 3,89, зафиксирован у образца В-0,05. Наибольший
показатель, равный 6,27 г глюкозы/100 г крахмала, был у образца В-0,1 (рис. 3). Увеличение количества фермента при обрадотке приводило к постепенному снижению количества свободной глюкозы в крахмальной смеси.
Nat В-0,05 B-ОД В-0,25 В-0,5 В-1
Вид крахмала
% амилозы m % амилопектина
Рис. 2 - Соотношение амилозы и амилопектина в нативном и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалах
tu 12
Nat В-0,05 В-0,1 В-0,25 В-0,5 В-1
Вид крахмала
Рис. 3 - Декстрозный эквивалент нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов
Модифицированные крахмалы обладали повышенной, в сравнении с нативным, температурой желатинизации. Наибольшая температура желатинизации, равная 59,9 °C, выявлена у образца В-1. Наименьшая температура, среди обработанных амилазой Bacillus licheniformis, зафиксирована у В-0,1. При увеличении концентрации фермента, используемой для модификации, наблюдали увеличение температуры желирования у получаемых в результате крахмалов (рис. 4).
Обсуждение
Как отмечалось ранее [11], ферментативная модификация приводит к значительному изменению химического состава тапиокового крахмала.
Пониженная вязкость крахмалов может быть объяснена повышенным содержанием амилозы, которая, в свою очередь, является более линейной и образует более жидкие растворы (рис. 1, 2). [12]. Кроме того, было замечено и то, что с увеличением количества амилозы повышалась температура
желатинизации (рис. 2, 4). Данный эффект обусловлен тем, что амилоза, будучи линейным полимером, требует больше энергии для разрыва образующий ее водородных связей. Обычно чем выше уровень амилозы, тем выше температура желатинизации крахмалов [13].
Nat В-0,05 В-0,1 В-0,25 В-0,5 В-1
Вид рахмала
Рис. 4 - Температура желетинизации нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов
Важно отметить, что крахмалы модифицированные амизой Bacillus licheniformis при желатинизации образовывали прозрачные гели, в отличии от амилосубтилиновых, которые образовывали мутную пасту [11]. Подобное поведение объясняется мехазмом действия фермента амилазы, который предпочтительно разрушает внутренние связи молекулы крахмала [4].
Анализируя показатель декстрозного эквивалента, можно судить о технологических и химических свойствах крахмала. Наблюдаемое уменьшение декстрозного эквивалента говорит о том, что модифицированные крахмалы обладают меньшей сладостью, менее подвержены гидролизу, чем нативные, из чего следует предположить, что они имеют более низкий гликемический индекс.
Таким образом, ферментно модифицированные тапиоковые крахмалы имели более высокие показатели содержания амилозы, температуры желирования, более низкие показатели вязкости и декстрозного эквивалента. Наиболее интересным, с точки зрения технологических параметров, является образец В-0,1, который обладает пониженной вязкостью, повышенной сладостью и средней температурой желатинизации. Дальнейшие исследования по изучению свойств модифицированных тапиоковых крахмалов будут направлены на изучение технологических свойств ферментно модифицированных крахмалов с целью определения сферы его применения в пищевой промышленности.
Работа поддержана грантом Академии наук Республики Татарстан № 10-79-хГ/2017.
Литература
1. Appelqvist I. A. M., Debet M. R. M. // Food Reviews International, 1997. 13(2):163-224.
2. Tonukari N. J. // Electronic journal of Biotechnology, 2004. 7(1):5-8.
3. Moorthy S. N. // Starch-Starke, 2002. (54)12:559-592.
4. Maarel, M.J.E.C.V.D., Veen, B.V.D., Uitdehaag, J. C.M., Leemhuis, H., Dijkhuizen, L. // Journal of Biotechnology, 2002. 94(2):137-155.
5. Oh E.J., Choi S.J., Lee S.J., Kim C.H., Moon T.W. // Journal of Food Science, 2008. 73(3):158-166.
6. Bemiller J. N. //Starch-Starke, 1997. 49(4):127-131.
7. Hebeda R. E., Bowles L. K., Teague W. M. // Cereal Foods World, 1990. 35(5):453-457.
8. Lyons, P.H., Kerry F.J., Morrissey P.A., Buckley D.J. // Meat Sci, 1999. 51:43-52.
9. ГОСТ Р 50549-93 Продукты гидролиза крахмала. Определение восстанавливающей способности и эквивалента глюкозы. Метод постоянного титра Лейна и Эйнона.
10. Uthumporn U., Zaidul I. S. M., Karim A. A. // Food and Bioproducts Processing, 2010. 88(1):47-54.
11. Никитина Е.В., Цыганов М.С. // Вестник технологического университета. 2017. 20(2): 156-158.
12. Jane J., Chen Y.Y., Lee L.F., McPherson A.E., Wong, K.S., Radosavljevic M., Kasemsuwan T. // Cereal chemistry, 1999. 76(5):629-637.
13. Morris V.J. // Trends Food Sci. Technol, 1990. 1: 2-6.
© Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, НОЦ фармацевтики КФУ, [email protected]; М. С. Цыганов - студент каф. технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected]; А. И. Вафина - асп. каф. ТММП КНИТУ.
© E. V. Nikitina - PhD, Assoc. of prof. of Dep. Of food production technology KNRTU, REC pharmacy, Kazan (Volga Region) Federal University, [email protected]; M. S. Tsyganov - the student of the department of technology of food production KNRTU, [email protected]; A. I. Vafina - graduate student of Dep. Technology of meat and milk production KNITU.
