Научная статья на тему 'Свойства поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных элементов на его основе'

Свойства поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных элементов на его основе Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
1090
519
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПОЛИМЕР / МОДИФИКАЦИЯ / ПОЛИВИНИЛОВЫЙ СПИРТ / N-ВИНИЛПИРРОЛИДОН / ИММОБИЛИЗАЦИЯ / БАКТЕРИИ GLUCONOBACTER OXYDANS / БИОРЕЦЕПТОРНЫЙ ЭЛЕМЕНТ / БИОСЕНСОР

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Асулян Людмила Дмитриевна, Алфёров Валерий Анатольевич, Долгая Дарья Вячеславовна, Горячева Анастасия Анатольевна, Прокопенко Дарья Владимировна

Приведены результаты исследования структуры полимера, полученного модификацией поливинилового спирта (ПВС) N-винилпирролидоном (N-ВП). Проведен сравнительный анализ свойств растворов полимера ПВС-N-ВП, пленок и рецепторных элементов на его основе в зависимости от срока хранения. Установлено, что основные показатели биорецепторных элементов не изменяются при хранении пленок ПВС-N-ВП с иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans в сухом виде при $+4^{\circ}$С.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Асулян Людмила Дмитриевна, Алфёров Валерий Анатольевич, Долгая Дарья Вячеславовна, Горячева Анастасия Анатольевна, Прокопенко Дарья Владимировна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Свойства поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных элементов на его основе»

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 2. Ч.1. С. 231-240 Химия

УДК 579.222:602.1:53.082.9

Свойства поливинилового спирта, модифицированного ^винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных

*

элементов на его основе *

Л.Д. Асулян, В. А. Алферов, Д. В. Долгая, А. А. Горячева,

Д. В. Прокопенко

Аннотация. Приведены результаты исследования структуры полимера, полученного модификацией поливинилового спирта (ПВС) М-винилпирролидоном (М-ВП). Проведен сравнительный анализ свойств растворов полимера ПВС-М-ВП, пленок и рецепторных элементов на его основе в зависимости от срока хранения. Установлено, что основные показатели биорецепторных элементов не изменяются при хранении пленок ПВС-М-ВП с иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans в сухом виде при +4°С.

Ключевые слова: полимер, модификация, поливиниловый спирт, М-винилпирролидон, иммобилизация, бактерии Gluconobacter oxydans, биорецепторный элемент, биосенсор.

Введение

Биологические и химические сенсоры применяются для контроля окружающей среды, для оценки уровня промышленных загрязнений в воздухе и воде, для контроля безопасности производств, в клинической диагностике и во многих других областях. В целом, биосенсоры можно включить в список тех высокотехнологичных устройств, которые активно разрабатываются и в XXI веке будут широко внедрены. Кроме очевидных требований, предъявляемых к новым сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, селективность и скорость анализа, биосенсоры отвечают еще и требованиям миниатюризации, что связано с развитием нанотехнологий.

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.В37.21.0561.

Важная роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Особенности метаболизма клеток позволяют создавать биосенсоры как на индивидуальные молекулы, так и на широкие классы соединений, например на всю совокупность биологически поглощаемых веществ.

Принципиальным вопросом при создании клеточных биосенсоров является метод иммобилизации клеток — закрепления их на поверхности преобразователя сигнала.

Наиболее перспективными носителями для иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов являются синтетические полимеры, так как они более доступны по цене, дают пленки и гели, обладающие хорошими механическими характеристиками. Среди таких синтетических полимеров широкое распространение получил поливиниловый спирт.

Цель работы: изучение структуры поливинилового спирта (ПВС), модифицированного К-винилпирролидоном (К-ВП), свойств растворов, пленок и рецепторных элементов на его основе в зависимости от срока и условий хранения.

Экспериментальная часть

1. Получение ПВС, модифицированного М-винилпирролидоном. Для приготовления ПВС, модифицированного К-винилпирролидоном, к 20 мл 5% водного раствора ПВС (марка 16/1, Россия) прибавляли 0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (КН4)2Се(КО3)б (Т = 0,1 г/мл) и 0,1 мл К-винилпирролидона при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов [1].

2. Определение вязкости раствора поливинилового спирта, модифицированного М-винилпирролидоном. Анализ проводили методом капиллярной вискозиметрии. Измерения вязкости проводились на вискозиметре ВПЖ-

2. Экспериментально определяли относительную вязкость как отношение времени истечения раствора полимера ко времени истечения растворителя по известной методике [2]:

потн = ^/^0,

где потн — относительная вязкость; t и ^ — время истечения раствора полимера и растворителя

3. Определение доли сшитого полимера в пленке поливинилового спирта, модифицированного М-винилпирролидоном. Определение доли сшитого полимера проводили методом экстракции. Для этого образец пленки взвешивали (0,1000-0,3000 г), заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов, при t = 50 — 60°С, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили до постоянной массы [2]. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы образца.

4. Иммобилизация бактериальных клеток в пленку из ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном. В раствор ПВС, модифицированного N-ВП, добавляли бактериальные клетки Gluconobacter охуйапв (30 мг биомассы на 250 мкл раствора полимера), смесь переносили на предметное стекло и высушивали в течение 2 часов при 20°С. Из полученной пленки вырезали рецепторные элементы размером 3x3 мм, которые хранили в сухом виде или помещали в фосфатно-цитратный буферный раствор (рН = 6, 0) и ставили в холодильник (+4°С).

Характеристики рецепторных элементов и биосенсоров на их основе получены на биосенсорной установке, основными элементами которой являются потенциостат IPC 2L, используемый в качестве преобразователя для измерения содержания молекулярного кислорода, и электрод Кларка.

Результаты и обсуждение

Ранее авторами сообщалось о синтезе новой композиционной матрицы для иммобилизации бактериальных клеток модификацией поливинилового спирта N-винилпирролидоном, предложен механизм образования сшитого полимера и получены высокие характеристики рецепторных элементов, содержащих клетки Gluconobacter охуйапв, иммобилизованные в новую матрицу, и биосенсоров на их основе [1].

Настоящая работа является продолжением начатых ранее исследований.

Для доказательства сетчатой структуры полимерного материала, полученного модификацией ПВС, была определена доля сшитого полимера в пленке методом экстракции. Известно, что ПВС [3], N-винилпирролидон, а также поливинилпирролидон [4] растворяются в воде, сетчатые же полимеры набухают, но не растворяются. Образец пленки взвешивали, заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов, при t = 50-60°С, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили и взвешивали. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы высушенного образца. Доля сшитого полимера составила около 10%.

Наличие сшивок в модифицированном полимере было подтверждено также с помощью светового микроскопа AXIO imager A1. Характерной особенностью строения ПВС является наличие протяженных пор со средним сечением 0.18-0.26 мкм [5], в то время как на фотографиях пленок, полученных высушиванием модифицированного полимера, видны линейные участки, характерные для ПВС и участки с сетчатой структурой (рис. 1).

Модифицированный ПВС использовали для иммобилизации микроорганизмов с целью получения рецепторных элементов биосенсоров. Иммобилизацию проводили путем тщательного перемешивания бактериальных клеток с раствором полимера с последующим высушиванием суспензии на предметном стекле при 20°С.

На рис. 2 показана пленка полимера с иммобилизованными бактериями Gluconobacter охуйапв, в которой видны отдельные участки со скоплением

Рис. 1. Структура модифицированного поливинилового спирта (увеличение в 100 раз)

Рис. 2. Рецепторный элемент с иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280

бактерий и практически свободные. Это может быть связано с тем, что микроорганизмы лучше удерживаются на сшитых участках полимера.

Естественно предположить, что увеличение доли сшитого полимера в массе пленки будет способствовать лучшему удерживанию микроорганизмов

в получаемых рецепторных элементах и их большей операционной и долговременной стабильности.

В ходе исследований установлено, что дополнительная сшивка цепей ПВС происходит при длительном хранении раствора модифицированного полимера (около 6 месяцев) при 20°С, о чем свидетельствует значительное повышение относительной вязкости раствора полимера (с 50 до 90). Доля сетчатого полимера в пленке, полученной при высушивании «состаренного» полимера, составила 16%, т. е. в 1,6 раза больше, чем в пленке на основе свежеполученного полимера.

На основе свежеполученного (А) и «состаренного» (В) полимеров были приготовлены рецепторные элементы биосенсоров иммобилизацией бактерий СЫсопоЪасЬет охуйапв и по описанным ранее методикам [1] получены их характеристики: операционная и долговременная стабильности, чувствительность, минимальный предел обнаружения определяемых субстратов и определены максимальные скорости ферментативной реакции и эффективные константы Михаэлиса (Км).

Таблица 1

Сравнительная характеристика рецепторных элементов на основе свежеполученного (А) и «состаренного» (В) полимеров

Характеристики Полимер А Полимер В

Субстраты Глюкоза Этанол Глюкоза Этанол

Относительное стандартное отклонение по 15 измерениям, % 2,3 1,8 2,2 1,7

Долговременная стабильность, сутки 27 20 36 25

Чувствительность, нА • л/(мин • ммоль) 19±4 25±4 17±2 19±3

Минимальный предел обнаружения, моль/л 5, 1 О 1 съ б,240-6 5, 1 о 1 съ 6, 'о 1 о 1 съ

Нижняя граница определяемых концентраций, моль/л 1,8-10-4 2,3-10-4 1 1 о і 2,140-4

Максимальная скорость Утах, нА/мин 100±5 80±7 110±11 90±5

Эффективная константа Михаэлиса (Км), ммоль/л 1,8±0,3 1,7±0,3 2,5±0,2 2,5±0,5

Полученные данные приведены в табл. 1, из которой видно, что рецепторные элементы на основе «состаренного» полимера, как и предполагалось, обладают более высокой долговременной стабильностью — 36 и 25 дней при определении глюкозы и этанола соответственно, в то время как на свежеполученном полимере — 27 и 20 дней. Операционная стабильность, характеристикой которой является относительное стандартное отклонение по 15 последовательным измерениям, также оказалась немного выше для рецепторного элемента на основе «состаренного» полимера:

относительное стандартное отклонение составило 2,2 и 1,7 % при определении глюкозы и этанола соответственно, против 2,3 и 1,8 % для свежеполученного полимера.

В то же время для рецепторных элементов на основе полимера B чувствительность несколько ниже, что связано с затрудненным проникновением субстрата через более сшитый полимер: 17 и 19

нА-л/(мин-ммоль) при определении глюкозы и этанола соответственно против 19 и 25 для рецепторных элементов на основе свежеполученного полимера.

Снижение минимального предела обнаружения субстратов (с 5,б-10-6 до 5,3-10-6 моль/л для глюкозы и с б,2-10-6 до б,010-6 моль/л для этанола) и нижней границы определяемых концентраций (с 1,8-10-4 до 1,5-10-4 моль/л для глюкозы и с 2,3-10-4 до 2,1 -10-4 моль/л для этанола) для биосенсоров с рецепторными элементами на основе полимера B объясняется, по-видимому, большим содержанием микроорганизмов в рецепторном элементе из полимера с более «сшитой» структурой, препятствующей вымыванию клеток.

Максимальная скорость ферментативной реакции и эффективная константа Михаэлиса, равная концентрации определяемого субстрата при скорости ферментативной реакции, равной половине максимальной, в биорецепторах на основе «состаренного» полимера повышаются, что также связано с повышенной концентрацией микроорганизмов в более «сшитом» полимере В.

Таким образом, хранение раствора полимера, полученного модификацией поливинилового спирта N-винилпирролидоном, в закрытой емкости в течение длительного времени (до б месяцев) при комнатной температуре не только не приводит к ухудшению качества полимера, но дает возможность получать рецепторные элементы биосенсоров с улучшенными характеристиками вследствие увеличения доли сетчатого полимера.

Следующим этапом работы было установление возможности хранения готовых рецепторных элементов с иммобилизованными бактериями в течение длительного времени с сохранением их ферментативной активности. Исследования проводились путем параллельных измерений откликов биосенсора с рабочим рецепторным элементом, который был приготовлен сразу после иммобилизации микроорганизмов (C), и биосенсора с биорецептором, приготовленным из пленки, определенное время хранящейся в холодильнике (D).

В ходе работы были получены операционные стабильности через 3, 15 и 30 дней после иммобилизации для биосенсоров на основе рецепторных элементов С и D (рис. 3).

Как видно на рис. 3 и из приведенных в табл. 2 данных, операционные стабильности биосенсоров на основе рецепторных элементов С и D практически не отличаются. Оба обладают высокой операционной

Рис. 3. Операционная стабильность биосенсоров на основе полученных рецепторных элементов при определении этанола; * — пленка Б

Таблица 2

Операционные стабильности рецепторных элементов

Рецепторный элемент Субстрат Стандартное отклонение по 15 измерениям, %

3-й день 15-й день 30-й день

Б Глюкоза 1,1 1,2 2,0

Этанол 1,3 2,1 2,0

С Глюкоза 1,2 1,4 1,8

Этанол 1,2 2,2 2,2

стабильностью независимо от времени хранения полученной пленки в холодильнике и работы рецепторного элемента.

В ходе измерений установлено, что долговременные стабильности рецепторных элементов, находящегося в работе и хранящегося в холодильнике в сухом виде, полностью совпадают (рис. 4).

В табл. 3 приведены все характеристики исследуемых рецепторных элементов, полученные известными методами [1]

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, существенной разницы между рецепторным элементом, находящимся в работе, и биорецептором, хранящимся такое же время в холодильной камере при +4°С в сухом виде, нет. Операционная стабильность 1,2—1,4 % при определении глюкозы, 2,1—2,2 % при определении этанола; долговременная стабильность — 25 и 18 дней при определении глюкозы и этанола соответственно; чувствительность 18-23 нА-л/(мин-ммоль); минимальный предел обнаружения 5,2-10-6-5,6-10-6

120

0

О 5 10 15 20 25 30 35

Дни

Рис. 4. Долговременная стабильность сенсора на основе полученных рецепторных элементов; * — рецепторные элементы, полученные из пленки

Б через 15 дней хранения

Таблица 3

Сравнительная характеристика рабочего рецепторного элемента С и рецепторного элемента Б на 15 день после иммобилизации бактерий

Характеристики Рецепторный элемент С Рецепторный элемент Б

Глюкоза Этанол Глюкоза Этанол

Операционная стабильность по 15 измерениям, % 1,4 2,2 1,2 2,1

Долговременная стабильность, суток 25 18 25 18

Чувствительность, нА-л/(мин-ммоль) 18±3 22±3 23±4 20±2

Минимальный предел обнаружения, моль/л 5,2 • 10—6 4,940-6 5,6 • 10—6 4, 1 О 1 СЪ

Нижняя граница определяемых концентраций, моль/л 1,440-4 1,240-4 1,8Ю-4 1,040-4

Максимальная скорость Утах, нА/мин 110±10 75±4 120±12 70±5

Эффективная константа Михаэлиса (Км), ммоль/л 2,5±0,4 1,7±0,2 2,7±0,4 1,7±0,5

моль/л для глюкозы, 4,5■ 10—6 —4,9■ 10—6 моль/л для этанола; нижняя граница определяемых концентраций 1,4-10-4-1,8-10-4 моль/л для глюкозы и 1,0 10-4—1,210-4 моль/л для этанола. Максимальные скорости ферментативной реакции и константы Михаэлиса для рецепторных

элементов на основе пленок С и Б практически совпадают в пределах ошибки определения.

Таким образом, рецепторные элементы, полученные иммобилизацией клеток Gluconobacter oxydans sbsp. ¡пЛпзЬтшз Б-1280 в ПВС, модифицированный К-ВП, могут храниться в сухом виде в холодильной камере на протяжении всего периода жизни клеток.

Выводы

1. Методами экстракции и световой микроскопии установлена сшитая структура поливинилового спирта, модифицированного N винилпирролидоном.

2. Показано, что при хранении растворов модифицированного полимера при комнатной температуре повышаются рабочие характеристики рецепторных элементов на его основе.

3. Установлено, что рабочие характеристики биорецепторов на основе свежеполученных пленок модифицированного ПВС с иммобилизованными бактериями в разные дни использования биосенсора совпадают с характеристиками биорецепторов из пленки с иммобилизованными бактериями, хранящейся такое же время в сухом виде при +4 ^ +6°С.

4. Установлено, что хранение биорецепторных элементов с иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans в холодильной камере в сухом виде не влияет на скорость ферментативной реакции и константу Михаэлиса.

Список литературы

1. Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в пленку из поливинилового спирта, модифицированного М-винилпирролидоном / В.А. Алферов [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2011. Вып. 1. С. 210-220.

2. Лосев И.П., О.Я. Федотова Практикум по химии высокомолекулярных соединений. М.: Госхимиздат, 1962. 228 с.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3. Ушаков С.Н. Поливиниловый спирт и его производные. Т. 1. Изв. АН СССР, 1960. 552 с.

4. Сидельковская Ф.П. Химия М-винилпирролидона и его полимеров. М.: Наука, 1970. 150 с.

5. Шаскольский Б.Л. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включенных в матрицу криогеля поливинилового спирта: автореф. дис.. . . к-та хим. наук. М, 2009.

Асулян Людмила Дмитриевна (asuljan@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алфёров Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Долгая Дарья Вячеславовна (daryachichkova@yandex.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Горячева Анастасия Анатольевна (goryachevanastya@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Прокопенко Дарья Владимировна (nauthis@yandex.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Properties of polyvinyl alcohol, modified N-vinylpyrrolidone, solutions, films and bioreceptor elements based on it

L.D. Asulyan, V. A. Alferov, D.V. Dolgaya, A. A. Goryacheva,

D. V. Prokopenko

Abstract. The structure of the polymer that is obtained by a modification of polyvinyl alcohol (PVA) using N-vinylpyrrolidone (N-VP) is reported. A comparative analysis of the properties of PVA-N-VP polymer in solution, films and bioreceptor elements is performed depending on the storage time. Key structural indicators of bioreceptor elements and biosensors are found do not change during the storage of dried PVA-N-VP films with immobilized bacteria Gluconobacter oxydans at +4°C.

Keywords : polymer, modification, polyvinyl alcohol, N-vinylpyrrolidone, immobilization, bacteria Gluconobacter oxydans, bioreceptor element, biosensor.

Asulyan Lyudmila (asuljan@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Valerij (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, head of department, department of chemistry, Tula State University.

Dolgaia Darya (daryachichkova@yandex.ru), student, department of chemistry, Tula State University.

Goryacheva Anastasia (goryachevanastya@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Prokopenko Darya (nauthis@yandex.ru), student, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 05.05.2013

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.