Получение стабильных рецепторных элементов на основе гидрогеля поливинилового спирта для создания БПК-биосенсора Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 543.9 + 543.38

ПОЛУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА ДЛЯ СОЗДАНИЯ БПК-БИОСЕНСОРА

Л. Д. Асулян,О.А. Камаева,В.А.Арляпов, В. А. Алферов

Проведена модификация поливинилового спирта (ПВС) окислительной сшивкой полимерных цепей нитратом церия (IV) - аммония, приводящая к образованию сетчатой структуры. Получены основные характеристики рецепторного элемента на основе дрожжевых клеток ВеЬагуатусеяИатепп, иммобилизованныхв сшитыйПВС.

Ключевые слова:поливиниловый спирт, церий-аммоний нитрат, иммобилизация, дрожжи ВеЬагуатусе8Ьатепп, биорецепторный элемент, биосенсор, индекс биохимического потребления кислорода (БПК)

Введение

Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. В частности, в настоящее время важны разработки методов и аппаратуры для экспресс-анализа проб воды. Одним из наиболее важных параметров, определяющим загрязненность проб воды, является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). БПК отражает количество кислорода в мг/дм3, потребленное при окислении биоразлагаемых органических соединений. В соответствии с мировой практикой наиболее современным и эффективным подходом для оценки БПК является биосенсорный метод определения [1].

БПК-биосенсоры - устройства, использующие биологические материалы для определения биоразлагаемых органических веществ и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. К преимуществам БПК-биосенсоров можно отнести короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца [2].

Ключевым этапом в создании стабильного рецепторного элемента биосенсора является иммобилизация биологического материала, от успеха которой зависит возможность измерения сигнала, операционные характеристики сенсора, чувствительность и селективность определения органических компонентов в смесях сложного состава. Перспективными носителями для иммобилизации клеток микроорганизмов являются органические полимерные материалы, как природные, так и синтетические [3]. Природные полимеры, как правило, механически непрочные и биодеградируемые. Использование синтетических полимеров позволяет получать пленки и гели, длительное время удерживающие биологический

материал. Среди синтетических полимеров широкое распространение получил поливиниловый спирт (ПВС) как химически и микробиологически стабильный, нетоксичный и биосовместимый носитель. С целью получения нерастворимых в воде гидрогелей макромолекулы ПВС сшивают поперечными связями[4].

Целью данной работы является получение полимерного гидрогеля на основе ПВС для иммобилизации микроорганизмов окислительной сшивкой под действием нитрата церия (IV) - аммония.

Экспериментальная часть

Модификация ПВС окислительной сшивкой. Для получения сшитого полимера к 20 мл 5 % водного раствора ПВС (М = 78000, марка 16/1) прибавляли 0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH4)2Ce(NO3)6 (Т = 0,1 г/мл) при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 55°С в атмосфере инертного газа в течение 3-х часов.

Определение вязкости раствора поливинилового спирта. Анализ проводили методом капиллярной вискозиметрии. Измерения вязкости проводились на вискозиметре ВПЖ-2. Экспериментально определяли относительную вязкость как отношение времени истечения раствора полимера ко времени истечения растворителя по известной методике. [5].

Лоты t/to

Потн . - относительная вязкость;

t и to - время истечения раствора полимера и растворителя

Определение доли сшитого полимера в пленке модифицированного поливинилового спирта. Определение доли сшитого полимера проводили методом экстракции. Образец пленки взвешивали, заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов при t = 50-60°C, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили до постоянной массы. [5]. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы образца.

Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штамма D. hansenii BKM Y-2482 были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (г. Пущино). Дрожжи выращивали на богатой минеральной среде следующего состава: глюкоза - 10 г/дм , пептон - 5 г/дм3, дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм (Sigma, США). Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 101,325 кПа и температуре 121 oC в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре 10 минут (10000 об/мин) и промывали центрифугат 20 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Осевшие клетки переносили в свежий буфер, распределяли по порциям и осаждали на

центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре 25 °С.

Иммобилизация дрожжевых клеток в пленку из ПВС. Микропипеткой отбирали необходимое количество раствора модифицированного ПВС и добавляли в него дрожжевые клетки D. hansenii (20 мг биомассы на 100 мкл ПВС). Для равномерного распределения клеток в полимере проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». 200 мкл полученной смеси переносили в блистерную упаковку d = 6-8 мм и высушивали на воздухе до полного высыхания в течение 24 часов. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора.

Иммобилизация клеток адсорбцией на стекловолоконном фильтре. Выращенные клетки микроорганизмов промывали фосфатным буферным раствором (20 мМ, pH 6,8), центрифугировали (2000 об/мин, 10 мин), осадок сырой массы клеток взвешивали и разбавляли определённым количеством раствора буфера до концентрации 150 мг/см3. Полученную смесь наносили на пористый стекловолоконный фильтр (Whatman GF/A, Sigma) в объеме 0,003 см3. Рецепторный элемент размером 3x3 мм подсушивали на воздухе в течение 15 мин при 200 C. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора.

Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием рН-метр-иономер-БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия), сопряженного с персональным компьютером, работающим под управлением специализированного программного обеспечения EXP2PR (ООО «Эконикс-эксперт», Россия). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (мг/дм3-мин). Датчиками являлись кислородные электроды типа Кларка с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200 - 1000 мкл, 20 - 200 мкл, 0.5 - 10 мкл, Biotech, США).

Результаты и обсуждение

Долговременная стабильность и механическая прочность рецепторных элементов, полученных иммобилизацией микроорганизмов в полимерный гидрогель, зависит от степени сшивки макромолекул исходного полимера. Ранее сообщалось о синтезе композиционной

матрицы для иммобилизации бактериальных клеток модификацией поливинилового спирта ]Ч-винилпирролидоном (1Ч-ВП) в присутствии церий-аммоний нитрата и предложен механизм образования сшитого полимера через стадию образования оксильных радикалов [4]. В настоящее время выпуск 1Ч-винилпирролидона в России остановлен. В связи с этим в целях решения проблемы импортозамещения было решено провести сшивку ПВС в отсутствие 1Ч-ВП.

Естественно было предположить, что оксильные радикалы, образующиеся на первой стадии при восстановлении ионов церия:

-сн2—сн-

он ^

♦ Се

-сн,

сн-о

* Се*3 ♦ н+

способны вести реакции роста цепи и сшивки и без участия N-611, так как известно, что они весьма активны в реакциях отрыва атомов водорода от всех СН-связей поливинилового спирта [6]:

ок

-СН-

он

-СНп

сн-он

-СИ,

-СНчА/Ч/Х

он

\/\/\>-Н2С-

-сн2—сн-

-сн2—

яон

он

он

он

Далее может происходить рекомбинация алкильных радикалов с образованием поперечных сшивок:

он

-Н2С-С-СН2"

-Н2С С СН2"

он

2 -С-СН2-СН-СН2-СН^ааа

ОН ОН ОН

Для получения сшитого полимера 5 % водный раствор ПВС перемешивали в инертной атмосфере при 55°С в течение 3 часов в присутствии церий-аммоний нитрата при мольном соотношении полимер : инициатор = 2400:15. Методом капиллярной вискозиметрии была определена относительная вязкость полученного раствора как отношение времени истечения раствора полимера ко времени истечения растворителя, которая составила 10,2 ± 0,2. Относительна вязкость раствора ПВС, модифицированного ^винилпирролидоном, полученного по описанной методике [4], составила 13,7±0,4. Незначительное снижение вязкости раствора полимера в отсутствие К-винилпирролидона в качестве

сшивающего агента, можно объяснить более низкой молекулярной массой получающегося сшитого полимера.

Для доказательства сетчатой структуры полимерного материала, была определена доля сшитого полимера в пленке методом экстракции. Известно, что ПВС растворяется в воде [7], сетчатые же полимеры набухают, но не растворяются. Образец пленки взвешивали, заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов, при 1 = 50-60°С, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили и взвешивали. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы высушенного образца. Доля сшитого полимера составила около 50 %, в то время как для ПВС, модифицированного К-ВП, этот показатель составляет 10-16 % [8].

Модифицированный в результате окислительной сшивки ПВС использовали для формирования рецерторных элементов БПК-биосенсора иммобилизацией дрожжевых клеток Debaryamyces hansenii.

При разработке рецепторного элемента биосенсора для определения БПК предпочтительно использовать целые клетки микроорганизмов, обладающие широкой субстратной специфичностью. Широкая субстратная специфичность при этом является преимуществом, так как приводит к повышению правильности результатов анализа БПК. Оценка субстратной специфичности иммобилизованных микроорганизмов была проведена по 20 субстратам, включая спирты, углеводы и карбоновые кислоты. Для проведения эксперимента использовались растворы субстратов одинаковой концентрации (0,1 моль/дм ), за 100 % принимался ответ биосенсора на этанол. Результаты представлены на рисунке.

Из данных, приведенных на рисунке, видно, что иммобилизация дрожжей Debaryomyceshansenii в пленку модифицированного ПВС практически не изменяет их субстратную специфичность по сравнению с наиболее щадящим методом иммобилизации - адсорбцией: ответ сенсора на спирты уменьшается по мере увеличения длины углеводородного радикала и степени его разветвления; величина отклика на углеводы уменьшается при переходе от альдоз (глюкоза) к кетозам (фруктоза); окисление дисахаридов (сахароза и лактоза) проходит менее интенсивно, чем моносахаридов; многоосновные кислоты окисляются более эффективно (32-35 %) по сравнению с одноосновными (19-24 %).

Все аналитические и метрологические характеристики биорецепторного элемента были определены для глюкозо-глутаматной смеси (ГГС), так как её применение в качестве стандарта при анализе БПК предусмотрено федеративными природоохранными нормативными документами [9].

I пленка ПВС I адсорбция

Портрет субстратной специфичности дрожжей ОеЬагуотусезИате-пп, иммобилизованных адсорбцией на стекловолоконном фильтре и в

пленку модифицированного ПВС.

Сравнительная характеристика рецепторных элементов на основе

ПВС, модифицированного окислительной сшивкой (полимер I) и №винилпирролидоном (полимер II) при определении содержания глюкозо-глутаматной смеси (ГГС).

Характеристики Полимер I Полимер II [10]

Относительное стандартное отклонение по 10 измерениям, % 1,0 4,2

Долговременная стабильность, сутки 36 30

Коэффициент чувствительности, мин'1 0,0025±0,0001 0,0045±0,0003

Нижняя граница определяемых содержаний, мг/дм3 0,54 0,7

Продолжительность одного измерения, мин. 5-7 5-7

Из результатов, приведенных в таблице видно, что увеличение доли сшитого полимера в рецепторном элементе на основе ПВС, модифицированного окислительной сшивкой (полимер I) приводит к более высокой долговременной стабильности - 36 суток, по сравнению с полимером ПВС-1Ч-ВП (полимер II) - 30 суток. Операционная

стабильность, характеристикой которой является относительное стандартное отклонение по 10 последовательным измерениям, также оказалась выше для рецепторного элемента на основе полимера I: относительное стандартное отклонение составило 1 %, против 4,2 % для полимера II.

Коэффициент чувствительности, характеризующий скорость развития отклика биосенсора при введении субстрата, для рецепторных элементов на основе полимера I снижается по сравнению с полимером II: 0,0025 и 0,0045 мин-1 соответственно. Очевидно, что в рецепторном элементе с более высоким содержанием сшитого полимера меньше размер пор и активные центры биокатализатора менее доступны. Тем не менее, это не повлияло на продолжительность одного измерения, которое составляет 5-7 минут.

Выводы

1. Показано, что окислительная сшивка поливинилового спирта под действием нитрата церия-аммония в отсутствие N-винилпирролидона в качестве сшивающего агента позволяет получить гидрогель, пригодный для иммобилизации микроорганизмов.

2. Показано, что биорецепторные элементы на основе ПВС, модифицированного окислительной сшивкой, обладают более высокой операционной и долговременной стабильностью по сравнению с биорецепторами на основе гидрогеля ПВС-^ВП.

3. Биосенсоры с рецепторными элементами на основе ПВС, модифицированного окислительной сшивкой, могут быть с успехом использованы при определении БПК, так как имеют низкий предел обнаружения органических примесей и обладают высокой долговременной и операционной стабильностью.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта "УМНИК" № 8358ГУ/201

Список литературы

1. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): a review/ S.Jouanneau, L.Recoules, M.J.Durand et al//Water research. 2014. Т. 49. С. 6282.

2.

Микробныебиосенсорыдляопределениябиологическогопотреблениякислор ода/ О.Н.Понаморева, В.А.Арляпов, В.А.Алферов и др.// Прикладная биохимия и микробиология.2011. Т.47. №1. C. 5-15.

3. HandbookofBiosensorsandBiochips. / EditedbyMarksR. S., CullenD. C., Karubel., LoweC. R., WeetallH. 2007. 356 p.

4. Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора иммобилизацией бактериальных клеток GluconobacteroxydansE пленку из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном /

B.А.Алферов, Н.М.Филатова, Л.Д. Асулян и др. // Известия Тульского государственного университета. Химия. Вып. 1. 2011. С. 210-220.

5. Лосев И.П.. Практикум по химии высокомолекулярных соединений. М.: Госхимиздат, 1962. С. 174.

6. Валиева А.Ф. Кинетика и механизм окисления поливинилового спирта в водной среде: автореферат дис. ... канд. хим. наук. Уфа, 2007. 23 с.

7. Бойко В.В. Синтез поливинилового спирта в водно-спиртовых средах: дис. ... канд. хим. наук. М., 2004. 112 с.

8. Свойства поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, растворов, пленок и биорецепторных элементов на его основе /Л.Д.Асулян, В.А.Алферов, Д.В.Долгая и др.// Известия Тульского государственного университета. Химия. Вып. 2: в 2 ч. 2013. Ч.1.

C. 231-240.

9. ПНД Ф 14.1:2:3:4.123-97 Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн.) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах.

10. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly (vinylalcohol) modified by N-vinylpyrrolidone/V.A.Arlyapov, N.Yu.Yudina, L.D.Asulyanet al. // Enzyme and Microbial Technology. V.53. 2013. P. 257-262.

Асулян Людмила Дмитриевна, канд.хим. наук, dou.,asuljan@,rambler.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Камаева Оксана Александровна, магистрант,

kamaieva.oksana@ mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд.хим. наук, доц.,[email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Алферов Валерий Анатольевич, канд. хим. наук, проф., директор, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет

PREPARATION OF STABLE RECEPTOR ELEMENTS BASED ON A HYDROGEL OF POLY(VINYL ALCOHOL) TO FORM A BOD-

BIOSENSOR

L. D. Asulian, O. A. Kamaeva, V. A. Arlyapov, V. A. Alferov

Modification of polyvinyl alcohol by oxidative crosslinking of polymer chains with cerium-ammonium nitrate leads to the formation of the reticulate structure. The main characteristics of the receptor element based on crosslinked PVA and immobilized yeast Debarya-myceshanseniiare received.

Keywords: polymer, polyvinyl alcohol (PVA), cerium-ammonium nitrate, immobilization, yeast Debaryamyceshansenii, bioreceptor element, a biosensor, an index of biochemical oxygen demand (BOD).

Asulyan Lyudmila Dmitrievna, candidate of chemical sciences, docent, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,

Kamaeva Oksana Alexandrovna, graduate student, kamaieva. oksana amail. ru, Russia, Tula, Tula State University,

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, docent, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,

Alferov Valeriy Anatolievich, candidate of chemical sciences, professor, director, [email protected], Russia, Tula, Tula State University