CC BY
22УДК 615.9
СУБХРОНИЧЕСКАЯ ТОКСИЧНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ
Л.П. Точилкина, Н.В. Ходыкина, Л.Ю. Бочарова, М.С. Срослов, В.В. Клаучек, Б.Н. Филатов
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация
В опыте на беспородных белых крысах самцах изучена системная токсичность наночастиц диоксида церия в форме 0,078 М гидрозоля. Установлено, что двухмесячное пероральное поступление в организм нанодиоксида церия в дозах 50, 10 и 2 мг/кг сопровождается развитием дозозависимого резорбтивного токсического эффекта. Доза 2 мг/кг квалифицирована как порог общего токсического действия в субхроническом эксперименте. Ключевые слова: диоксид церия, наночастицы, гидрозоль, крысы, токсичность, пороговая доза.
Введение. Несмотря на чрезвычайное разнообразие современного рынка наноматериалов, к разряду приоритетных причислено не более двух десятков [1, 2,3]. Относящийся к ним нано-диоксид церия (НДЦ) представляет отдельный интерес как неорганический антиоксидант, обладающий выраженной кислородной нестехиометрией, способностью к быстрой регенерации и ферментомиметическими свойствами, которые в совокупности превращают его в перспективного кандидата для применения в медицине с целью лечения широкого круга заболеваний [4, 5, 6, 7]. Между тем в вопросе о безопасности потенциального терапевтического применения нанодиоксида церия нет полной ясности ввиду противоречивости взглядов на его токсичность и, в особенности, скудности определённых для него параметров токсикометрии [8, 9, 10, 11, 12].
Как показали собственные исследования с внутрибрюшинным введением 0,01 М гидрозоля, в остром опыте нанодиоксиду церия присуща широкая зона биологической активности и дозовая зависимость возникающих эффектов. На максимальном уровне воздействия (80 мг/кг)
наносоединение вызывает негативные длительно сохраняющиеся изменения как на системном, так и на организменном уровне, однако смертельного отравления не развивается. Пороговая доза общего токсического действия (Limacint) составила 0,8 мг/кг [13]. Было сделано заключение, что поиск показаний к терапевтическому применению гидрозоля НДЦ в дозе ниже 1 мг/кг для коррекции нарушений, обусловленных активацией перекисного окисления, может оказаться перспективным направлением дальнейших исследований его фармакологической активности. При этом представлялось логичным обращение к субхроническому режиму экспонирования, которое, во-первых, отвечало общепринятой схеме этапности работ по гигиеническому нормированию химических веществ, во-вторых, определялось его оптимальной продолжительностью для выявления возможных полезных фармакологических свойств, в-третьих, обеспечивало преемственность собственным ранее начатым исследованиям. По этим соображениям количественная оценка токсического эффекта нанодиоксида церия в условиях
Точилкина Людмила Петровна (Tochilkina Lyudmila Petrovna), кандидат медицинских наук, ст. научный сотрудник, заведующий лабораторией лекарственной безопасности ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, tochilkina@rihtop.ru;
Ходыкина Нина Владимировна (Khodykina Nina Vladimirovna), кандидат биологических наук, вед. научный сотрудник лаборатории лекарственной безопасности ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, hodykina@rihtop.ru;
Бочарова Людмила Юрьевна (Bocharova Lyudmila Yur'evna), научный сотрудник лаборатории лекарственной безопасности ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, BocharovaLY@mail.ru;
Срослов Михаил Сергеевич (Sroslov Mikhail Sergeyevich), научный сотрудник лаборатории лекарственной безопасности ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, SroslovMS@gmail.com;
Клаучек Валентина Васильевна (Klauchek Valentina Vasil'evna), доктор медицинских наук, зам. директора по научной работе ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, klauchek@rihtop.ru;
Филатов Борис Николаевич (Filatov Boris Nikolaevich), доктор медицинских наук, профессор, директор ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» (НИИГТП) ФМБА России, 400048, г. Волгоград, Российская Федерация, fllatov@rihtop.ru
субхронического эксперимента и стала целью настоящей работы.
Материалы и методы исследования. Объектом экспериментального исследования являлись образцы высокодисперсного 0,078° М золя диоксида церия, синтезированные в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Кур-накова (РАН, Москва) и охарактеризованные там же с применением методов УФ-видимой спектроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, рентгенофазового анализа и динамического светорассеяния. Согласно результатам анализа, синтезированные золи были монодисперсны, содержали сферические нано-частицы со средним гидродинамическим размером (радиусом) 3,5 нм в количестве 1,9х1023 мл-1 и сохраняли стабильность не менее 1-2 месяцев. Препаратом сравнения служил церий оксид (IV) ЧДА СТП ТУ КОМП 2-532-12 с массовой долей оксида церия 99,5 % (ДЦ).
Изучение системной токсичности проводили в двухмесячном субхроническом опыте на беспородных белых крысах самцах при в/ж способе введения наноматериала в трёх дозах - 50, 10 и 2 мг/кг (опыт 1, 2 и 3 соответственно). Для оценки последствий его применения использовали 2 группы - контрольную и подвергавшуюся воздействию макроаналога - ДЦ традиционной дисперсности (опыт 4). При работе с наногидрозолем маточные образцы разводили до расчётной концентрации деионизированной водой. Макроаналог апплицировали в/ж в виде сонифицированной водной суспензии в дозе 2 мг/кг. Самцы контрольной группы получали деионизированную воду. Объём вводимой жидкости составлял 1 мл на 100,0 г массы тела.
Численность групп составляла 22 особи. Через месяц по 10 из них выводили из эксперимента для промежуточного обследования и завершающей эвтаназии, 60 оставшихся (по 12 в группе) обследовали и умерщвляли в конце эксперимента.
О биологической активности НДЦ судили по характеру, глубине и динамике изменений показателей, характеризующих функциональное состояние целостного организма, общий уровень обмена веществ, особенности регуляции основных метаболических путей и эффективность механизмов антиперекисной защиты.
Функциональное состояние организма анализировали с применением интегральных тестов: масса тела; ЧСС, мышечная сила, поведенческие реакции (в автоматизированной системе регистрации и идентификации поведенческих актов «ЬАВОКАБ», «МеШ8», Нидерланды), морфологический состав крови.
Нарушения метаболизма оценивали на основании анализа изменений основных биохими-
ческих показателей сыворотки крови, включавших содержание общего белка, альбумина, глюкозы, триглицеридов, холестерина, мочевины, креатинина, общего билирубина, молочной и пировиноградной кислот, активность АЛТ, АСТ, ЛДГ, ГГТ, ЩФ и ХЭ. Состояние механизмов антиперекисной защиты организма оценивали по содержанию восстановленного глута-тиона в цельной крови и конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - в сыворотке. Исследования выполняли с применением биохимического анализатора «Chem Well 2910», («Combi», США) или унифицированными спектрофотометрическими методами.
Биологический материал, полученный на не-кропсии животных (головной мозг, сердце, лёгкие, печень, селезёнку, почки, надпочечники, семенники), обследовали макроскопически и использовали для определения коэффициентов массы внутренних органов. В конце эксперимента печень, почки, селезёнку и гонады подвергали гистологическим исследованиям по общепринятой схеме.
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с применением критерия t Стьюдента-Фишера [14], используя пакет Primer of Biostatistics 4.03. Различия считали достоверными при Р <0,05.
Результаты и обсуждение. Ежедневное наблюдение за животными не обнаружило у них явных признаков соматического неблагополучия. Инструментальное обследование подтвердило, что сдвиги на уровне целостного организма у самцов малочисленны. Изменения массы тела, контролируемые еженедельно, были связаны с приближением к возрастному пику физиологической зрелости, нежели обусловлены контактом с НДЦ: достоверные межгрупповые различия по данному показателю отсутствовали. Независимо от продолжительности экспозиции, гидрозоль не вызывал хронотропного эффекта и не снижал силу мышечной хватки. Отклонения со стороны поведения были минимальными и развивались только после введения НДЦ в максимальной и промежуточной дозах. В первой половине эксперимента они ограничивались слабовыраженными признаками двигательной гиперактивности, на которую в опыте 1 (50 мг/кг) указывало увеличение длительности перемещений (до 29,09±2,66 сек. против 21,20±2,67 сек. в контроле), в опыте 2 (10 мг/кг) - возрастание на 81 % времени перемещений с максимальной скоростью (168,58±22,44 сек. в сравнении с 92,92±25,36 сек. в контроле). К концу эксперимента эти сдвиги либо нивелировались, как это наблюдали в первой опытной группе, либо меняли направленность на прямо противоположные, как во второй опытной
группе, где регистрировали двукратное сокращение прежде повышенного времени перемещений с максимальной скоростью (65,17±15,54 сек. при 134,42±28,96 сек. в контроле).
В большей мере проявилось действие нано-гидрозоля на морфологический состав периферической крови. Результаты промежуточного обследования свидетельствовали, что НДЦ при введении в дозах 50 и 10 мг/кг, не оказывая влияния на белый кровяной росток, вызывал глубокие изменения в составе красной крови. У подопытных животных регистрировали выраженную эритропению со снижением содержания эритроцитов в опыте 1 - до (8,00±0,16)х1012/л и в опыте 2 - до (7,81±0,18)х1012/л по сравнению с (8,40±0,04)х1012/л в контроле. В обоих случаях отличия опыта от контроля были не только достоверными, но и выходили за пределы бисиг-мального диапазона его возможных колебаний. Эритропении сопутствовала гипогемоглобине-мия, когда в тех же группах концентрация гемоглобина была ниже контрольного уровня ~ на 6,5 %. Помимо этого, в опыте 2 обнаруживали тромбоцитопению: при содержании кровяных пластинок в крови контрольных животных, равном (700,50±20,27)х109/л, их количество у животных второй группы составляло только (639,30±15,12)х109/л.
Возможно, выявленные гематологические сдвиги были обусловлены токсическим угнетением процессов кроветворения. Однако равновероятно и то, что они явились следствием гиперспленизма. Как известно, селезёнка в отношении кровообращения и кроветворения выполняет важные контрольные функции. Её считают и «депо» крови, и «кладбищем» форменных элементов [15, 16], и потому особый интерес вызывает тот факт, что анемия у животных первой и второй опытных групп сопровождалась достоверным увеличением (в опыте 1 - с выходом за 2о контроля) относительной массы селезёнки - соответственно до 5,18±0,36 г/кг и 4,69±0,15 г/кг при контрольном значении показателя 4,14±0,14 г/кг. Важно отметить, что продление контакта с НДЦ до двух месяцев приводило к нивелированию отмеченных гематологических нарушений. Более того, в третьей группе, где дозовая нагрузка наночастицами была наименьшей из испытуемых, в конце эксперимента обнаружился некий эффект стимуляции кроветворения в виде повышения содержания в периферической крови количества эритроцитов - до (8,37±0,13) х1012/л относительно (7,80±0,23)х1012/л в контроле. Примечательно то, что обратное развитие анемического синдрома, зарегистрированное при финишном обследовании животных первой и второй опытных групп (50 и 10 мг/
кг НДЦ), происходило на фоне инверсии гравиметрической характеристики селезёнки. Её относительная масса в первой группе не просто нормализовалась, но в сравнении с контролем (4,44±0,16 г/кг) оказалась достоверно сниженной (3,94±0,13 г/кг), во второй группе изменения были аналогичны (снижение до 3,93±0,44 г/кг), но имели лишь характер чётко выраженной тенденции.
Таким образом, сравнение патофизиологических сдвигов, выявленных у подопытных животных при промежуточном и финальном обследовании, указывает на возникновение в организме наряду с токсическими эффектами НДЦ процессов адаптации к ним. Косвенным свидетельством их весьма напряжённого характера, возможно, является снижение относительной массы надпочечников, выявленное в конце эксперимента во всех четырёх группах: при относительной массе органа в контроле, равной 0,174±0,004 г/кг, в опыте 1-4 данный показатель составлял соответственно 0,157±0,006; 0,145±0,008; 0,152±0,010 и 0,151±0,008 г/кг.
В ходе обоих обследований у всех подопытных животных, получавших наночастицы, наблюдали и немногочисленные изменения ряда биохимических параметров, при этом дозоза-висимый характер воздействия НДЦ на обмен веществ определялся не столько количеством и глубиной, сколько направленностью обнаруженных отклонений (табл. 1, 2).
В первую очередь, следует отметить разнона-правленность изменений уровня восстановленного глутатиона в крови. Так, у крыс, получавших НДЦ в высшей дозе (50 мг/кг), при первом тестировании достоверного отклонения его содержания от контроля не выявлено, а при продлении экспозиций до двух месяцев отмечалось снижение на 16 %, что является плохим прогностическим признаком и указывает на функциональную недостаточность системы антиперекис-ной защиты организма. У крыс второй группы (10 мг/кг) умеренный (на 9 %) рост восстановленного глутатиона, зарегистрированный в середине эксперимента на фоне роста (до 123 %) мочевины, к окончанию опыта сменился падением, выраженным в той же степени, что и в первой группе. И только животные, экспонированные НДЦ в низшей дозе (третья группа), отреагировали на его поступление стойким адаптивным повышением показателя (на 11 % и 17 % через один и два месяца соответственно) (табл. 1, 2).
Со стороны белкового обмена при первом обследовании отмечено значимое снижение альбумина в сыворотке крыс первой группы (34,28±0,67 г/л при 36,26±0,42 г/л у параллельного контроля), возможно, определяемое его связыванием поступающими в кровяное русло
Таблица 1
Биохимические показатели крови крыс после одномесячного перорального
воздействия диоксида церия
Показатели Группы животных
и единицы измерения Опыт 1, НДЦ 50 мг/кг Опыт 2, НДЦ 10 мг/кг Опыт 3, НДЦ 2 мг/кг Опыт 4, ДЦ 2мг/кг контроль
1 2 3 4
АСТ, Е/л 187,7±11,1 171,3±11,8 196,0±11,0 216,5±16,9 200,8±9,4
АЛТ, Е/л 75,6±7,4 87,9±6,2 79,4±4,7 84,0±5,5 89,5±5,2
ЛДГ, Е/л 503,1±61,4 396,3±24,0 421,6±59,4 451,8±61,1 472,6±48,6
ГГТ, Е/л 11,64±0,87 10,12±0,82 9,36±0,77 9,20±0,60 10,96±0,66
ЩФ, Е/л 454,7±40,0* 565,2±66,8 581,0±47,1 639,3±75,3 745,8±69,9
ХЭ, Е/л 377,1±17,8 421,1±20,1* 416,8±19,9* 371,6±15,9 362,6±13,6
Альбумин, г/л 34,28±0,67* 35,57±0,38 35,45±0,31 34,99±0,57 36,26±0,42
Общий белок, г/л 78,83±1,59 82,08±0,95 81,20±1,38 80,36±1,05 82,45±1,41
Триглицериды, ммоль/л 0,813±0,074 0,952±0,117 0,792±0,033* 1,067±0,110 0,910±0,041
Холестерин, ммоль/л 2,050±0,127 2,094±0,129 1,846±0,075 2,006±0,093 1,892±0,080
Мочевина, ммоль/л 4,752±0,477 5,502±0,354* 4,404±0,267 4,578±0,344 4,471±0,238
Креатинин, мкмоль/л 32,39±1,83 36,94±1,99 35,05±1,71 34,23±1,67 35,13±1,41
Глюкоза, ммоль/л 4,368±0,124 4,000±0,132 4,248±0,129 4,302±0,205 4,021±0,137
Молочная кислота, ммоль/л 5,472±0,519 5,012±0,391 4,484±0,297* 5,198±0,316 5,550±0,291
ПВК, мкмоль/л 44,11±2,10 43,77±1,74 45,71±2,63 46,82±2,92 47,46±2,22
Молочная кислота/ПВК 122,70±7,62 114,19±7,46 99,38±4,21** 111,74±3,92 116,81±1,86
Билирубин, мкмоль/л 12,18±0,35 12,28±0,25 12,43±0,23 12,47±0,39 12,18±0,16
Восстановленный глутатион, мкмоль/л 1,058±0,026 1,131±0,028* 1,156±0,013* 1,105±0,038 1,038±0,025
МДА, мкмоль/л 12,09±0,42 11,51±0,45 11,33±0,50 11,78±0,35 12,46±0,40
Са2+, ммоль/л 2,505±0,067 2,568±0,044 2,474±0,039 2,523±0,043 2,538±0,035
Хлориды, ммоль/л 111,36±0,94 110,95±0,85 111,05±0,35 110,96±0,44 110,38±0,36
Примечание: * - обозначены достоверные сдвиги,
** - достоверные сдвиги, выходящие за пределы диапазона физиологических (М±2о) колебаний параллельного контроля
наночастицами [17]. На более низких уровнях воздействия НДЦ указанный эффект исчезал, а в третьей группе к окончанию эксперимента наблюдалось достоверное (до 105 %) повышение общего белка, связанное, очевидно, с активацией синтеза.
Энзимологические исследования сыворотки крови выявили у крыс первой группы
значимые отклонения активности ЩФ. При этом установленное через месяц от начала опыта ингибирование фермента (на 39 %) в последующем сменялось его столь же выраженной (на 42 %) активацией с сопутствующим падением концентрации ионов кальция (2,244±0,054 ммоль/л при 2,412±0,042 ммоль/л в контроле), в обмене которых указанный
Таблица 2
Биохимические показатели крови крыс после двухмесячного перорального
воздействия диоксида церия
Показатели и единицы измерения Группы животных
Опыт 1, НДЦ 50 мг/кг Опыт 2, НДЦ 10 мг/кг Опыт 3, НДЦ 2 мг/кг Опыт 4, ДЦ 2мг/кг контроль
1 2 3 4
АСТ, Е/л 187,1±8,5 218,8±18,2 183,8±8,3 184,2±9,7 189,5±14,5
АЛТ, Е/л 86,3±5,0 86,3±5,9 100,4±6,0 89,3±6,6 93,0±7,4
ЛДГ, Е/л 425,9±46,0 465,5±84,1 505,8±41,7 438,6±57,2 435,2±58,5
ГГТ, Е/л 10,14±1,16 10,38±0,496 10,93±0,751 10,11±1,02 11,93±0,53
ЩФ, Е/л 556,8±55,9* 382,4±28,9 409,5±26,3 42525±38,2 391,0±27,4
ХЭ, Е/л 481,8±26,9 497,8±33,9 434,0±14,7 451,3±18,8 464,7±20,2
Альбумин, г/л 34,53±0,41 33,75±0,53 34,28±0,45 33,54±0,45 33,19±0,62
Общий белок, г/л 75,62±0,65 76,16±0,73 79,34±0,73* 78,03±1,13 75,57±0,93
Триглицериды, ммоль/л 0,658±0,038 0,656±0,037 0,666±0,016 0,595±0,026 0,608±0,035
Холестерин, ммоль/л 1,642±0,069 1,648±0,063 1,706±0,061 1,604±0,111 1,633±0,069
Мочевина, ммоль/л 4,426±0,258 4,695±0,274 4,583±0,191 4,730±0,242 4,260±0,339
Креатинин, мкмоль/л 39,27±1,15 42,25±1,42 40,35±2,30 41,15±2,17 41,73±1,56
Глюкоза, ммоль/л 5,472±0,177 5,325±0,255 5,501±0,173 6,000±0,178 5,663±0,191
Молочная кислота, ммоль/л 2,876±0,166 3,003±0,226 2,936±0,137 2,737±0,117 3,040±0,248
ПВК, мкмоль/л 43,79±1,62 48,43±2,30 48,35±1,35 45,13±1,22 46,75±1,70
Молочная кислота/ПВК 65,99±3,64 61,54±3,29 60,88±2,80 63,12±2,51 62,22±3,20
Билирубин, мкмоль/л 10,01±0,46 10,61±0,91 11,40±0,39 10,47±0,30 10,94±0,53
Восстановленный глутатион, мкмоль/л 1,101±0,071* 1,094±0,050* 1,532±0,072* 1,218±0,078 1,309±0,064
МДА, мкмоль/л 10,88±0,48 11,09±0,58 10,44±0,24 10,86±0,31 10,88±0,23
Са2+, ммоль/л 2,244±0,054* 2,359±0,061 2,386±0,062 2,467±0,039 2,412±0,042
Хлориды, ммоль/л 109,32±0,45 109,88±0,67 108,59±0,63 109,93±0,73 110,05±0,61
Примечание: * - обозначены достоверные сдвиги,
** - достоверные сдвиги, выходящие за пределы диапазона физиологических (М±2а) колебаний параллельного контроля
фермент принимает непосредственное участие [18]. В этой связи нельзя исключить ни повреждающего действия наночастиц на клетки желчных протоков, ни нарушений на-
ночастицами метаболизма костной ткани.
У крыс, получавших НДЦ в средней и низшей дозах, энзимологические сдвиги проявлялись умеренной (на 15 %) активацией ХЭ в середине
Таблица 3
Комплексно-схематическая оценка достоверных сдвигов, выявленных в субхроническом эксперименте
Достоверно изменённые показатели
Группы животных и сроки обследования, месяцы
НДЦ ДЦ
опыт 1 опыт 2 опыт 3 опыт 4
50 мг/кг 10 мг/кг 2 мг/кг 2 мг/кг
I II I II I II I II
Физиологические
Длительность передвижений Т - - - - - - -
Время перемещений с максимальной скоростью - - Т 4 - - - -
Гематологические
Эритроциты 44 - 44 - - Т - -
Гемоглобин 4 - 4 - - - - -
Тромбоциты - - 4 - - - - -
Биохимические
ЩФ 4 Т - - - - - -
ХЭ - - Т - Т - - -
Альбумин 4 - - - - - - -
Общий белок - - - - - Т - -
Триглицериды - - - - 4 - - -
Мочевина - - Т - - - - -
Молочная кислота - - - - 4 - - -
Лактат/пируват - - - - 44 - - -
Восстановленный глутатион - 4 Т 4 Т Т - -
Са2+ - 4 - - - - -
Относительная масса внутренних органов
Селезёнка ТТ 4 Т - - - - -
Надпочечники - 4 - 4 - - 4
Достоверных сдвигов 6 5 8 3 5 4 0 1
Из них сдвигов, выходящих за ±2о контроля 2 0 1 0 1 0 0 0
Суммарное количество достоверных изменений 11 (2) 11 (1) 9 (1) 1 (0)
Примечание: Т и 4 - направленность достоверных сдвигов;
ТТ и 44 - направленность достоверных сдвигов, выходящих за пределы диапазона колебаний параллельного контроля (их общее число заключено в скобки)
эксперимента (табл. 1). Адаптивный характер данной реакции представляется вполне обоснованным. Известно, что рост активности холин-эстераз обнаруживается при различных стрессовых воздействиях, отражая способность холинергических систем к адаптации к изменившемся условиям. Включение адаптационных механизмов в ответ на ежедневное поступление в организм НДЦ проявлялось и изменениями на уровне регуляции процессов энергообеспечения, имевшими место только у животных, получавших нанопрепарат в низшей дозе (2 мг/кг). При первом тестировании (1 месяц) в сыворотке крыс третьей группы зарегистрировано статистически значимое снижение концентрации молочной кислоты (на 19 %), сопровождавшееся достоверным (с выходом за М±2о параллельного контроля) падением отношения лактат/пируват (99,38±4,21 против 116,81±1,86 в контрольной группе) и триг-лицеридов (до 87 %) (табл. 1). Направленность указанных отклонений свидетельствует в пользу повышения скорости и эффективности энергетического обмена. К окончанию эксперимента отмеченные показатели нормализовались (табл. 2). Обращает на себя внимание, что на протяжении всего эксперимента у крыс группы сравнения, экспонированных макроаналогом, на уровне, соответствующем низшему уровню воздействия НДЦ (2 мг/кг), никаких значимых метаболических сдвигов не выявлено (табл. 1, 2).
Таким образом, плановые тестирования животных продемонстрировали, что субхроническое внутрижелудочное поступление наноча-стиц диоксида церия не было безразлично для их организма, на что указывали обнаруженные в ходе эксперимента функциональные сдвиги, в схематическом виде отражённые в таблице 3.
Формальный анализ табличных данных мог бы привести к выводу, что все три выбранные для испытаний дозовых уровня НДЦ, несмотря на 5-кратный разрыв между ними, являются едва ли не изотоксичными: суммарное количество достоверных сдвигов, выявленных в 1-3 опытных группах, находится практически на одном уровне. Однако ошибочность подобного умозаключения убедительно доказывают принципиальные различия в характере и динамике нарушений, возникавших после введения НЧ ДЦ в разных дозах. Так, большинство гомеостатических сдвигов, развивавшихся на максимальном уровне воздействия НДЦ 50 мг/кг, носили безусловно вредный характер. К их числу, несомненно, следует отнести анемию, спленомегалию, гипоальбумине-мию, функциональную недостаточность системы антиперекисной защиты организма и опосредованное ЩФ вмешательство в кальциевый обмен. В условиях же длительного контакта с НДЦ в средней дозе 10 мг/кг стало возможным возник-
новение, наряду с аналогичными токсическими эффектами той же выраженности (анемия, спле-номегалия), изменений негативных, но более умеренных (истощаемость системы антиперекисной защиты организма) и даже сдвигов, относимых к адаптивным (повышение активности ХЭ). При снижении дозовой нагрузки на организм ещё в 5 раз (до 2 мг/кг) адаптивный характер приобрели уже практически все выявленные изменения, к числу которых следует отнести стимуляцию эри-тропоэза, активацию белкового синтеза и повышение эффективности энергетического обмена. Таким образом, зависимость характера наблюдавшихся сдвигов от уровня экспозиции наноча-стицами вполне очевидна.
Таким образом, результаты дифференцированной оценки последствий применения диоксида церия в разных дозах и опора на принятые в профилактической токсикологии критерии вредности [19] дают основания признать уровни НДЦ 50 и 10 мг/кг действующими, дозу 2 мг/кг -пороговой по общетоксическому эффекту.
Значимость и патогенетическое сходство единственного (!) возникшего после воздействия макроаналога (ДЦ традиционной дисперсности) нарушения с наблюдавшимися при применении НДЦ (снижение относительной массы надпочечников) препятствуют квалификации его дозы 2 мг/кг как недействующей и побуждают рассматривать и её как пороговую.
Заключение. В Российской Федерации разработана целостная структурированная система многоуровневой оценки безопасности и контроля наноматериалов на всех стадиях жизненного цикла [20]. Профильные методические документы закрепляют принцип «каскадности» испытаний, и место, цель и задачи субхронического эксперимента в схеме токсиколого-гигиениче-ской оценки наноматериалов чётко обозначены. Вместе с тем очевидно, что это не исключает возможности альтернативного использования представленных материалов, например, для расчёта референтных доз НДЦ и уточнения фар-макотерапевтической ценности активирующих эффектов его низкоуровневых воздействий.
Выводы.
1. Наночастицы диоксида церия диаметром ~ 7 нм при длительном внутрижелудочном введении в дозах 50, 10 и 2 мг/кг оказывают на крыс самцов общее токсическое действие, не вызывая грубых патоморфологических нарушений. Пороговая доза по системному эффекту установлена на уровне 2 мг/кг.
2. На пороговом уровне воздействия (2 мг/кг) модифицирующее влияние НДЦ на функциональный статус организма в сравнении с ДЦ традиционной дисперсности носит более выраженный характер.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Методические рекомендации МР 1.2.2641-10. Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах. М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспо-требнадзора, 2010.
2. Методические рекомендации МР 1.2.0037-11. Контроль наноматериалов в воздухе. М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотреб-надзора, 2012.
3. Piccinno F., Gottschalk F., Seeger S., Nowack B. Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world. Journal of Nanoparticle Research. 2012; 14 (9): 1109-1120.
4. Kyosseva S.K, McGinnis J.F. Cerium oxide nanoparticles as promising ophthalmic therapeutics for the treatment of retinal diseases. World J. Ophthalmol. 2015; 5(1): 23-30.
5. Щербаков А. Б., Жолобак Н. М., Иванов В. К., Третьяков Ю. Д., Спивак
H. Я. Наноматериалы на основе диоксида церия:свойства и перспективы использования в биологии и медицине.
REFERENCES:
I. Metodicheskie rekomendatsii МР 1.2.2641-10. Determination of priority types of nanomaterials in environmental objects, living organisms and foods. М.: Federal'nyy Tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora, 2010 (in Russian).
2. Metodicheskie rekomendatsii МР 1.2.0037-11. Control of nanomaterials in air. М.: Federal'nyy Tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora, 2010 (in Russian).
3. Piccinno F., Gottschalk F., Seeger S., Nowack B. Industrial production quantities and uses of ten engineered nanomaterials in Europe and the world. Journal of Nanoparticle Research. 2012; 14 (9): 1109-1120.
4. Kyosseva S.K, McGinnis J.F. Cerium oxide nanoparticles as promising ophthalmic therapeutics for the treatment of retinal diseases. World J. Ophthalmol. 2015; 5(1): 23-30.
5. ShcherbakovA. B., Zholobak N. M., Ivanov V. K., Tret'yakov Yu. D., Spivak N. Ya. Nanamaterials based on the nanocrystalline ceric dioxide: properties and use perspectives in biology and medicine. Biotechnologia Acta. 2011; 4
Бютехнолопя Acta. 2011; 4 (1): 9-28.
6. Estevez A. Y., Erlichman J. S. The potential of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for neurodegenerative disease therapy. Nanomedicine. 2014; 9 (10): 1437-40.
7. Иванов В.К., Щербаков А.Б., Баранчиков А.Е., Козик В.В. Нанокри-сталлический диоксид церия: свойства, получение, применение. Томск; 2013.
8. Tseng M.T., LuX., DuanX.,Hardas S.S., Sultana R., Wu P. et al. Alteration of hepatic structure and oxidative stress induced by intravenous nanoceria. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012; 260 (2): 173-82.
9. Спивак Н.Я., Носенко Н.Д., Жолобак Н.М., Щербаков А. Б., Резников А. Г., Иванова О. С. и др. Нанокристалличе-ский диоксид церия повышает функциональную активность репродуктивной системы стареющих самцов крыс. На-носистемы: физика, химия, математика. 2013; 4 (1): 72-7.
10. Ramesh A., Ratla N. N., Indukuri R., Venkatesh K., Rao S.T. Acute and sub-acute oral toxicity assesement of the cerium oxide nanoparticles in Wistar rats. International Journal of
(1): 9-28 (in Russian).
6. Estevez A. Y., Erlichman J. S. The potential of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for neurodegenerative disease therapy. Nanomedicine. 2014; 9 (10): 1437-40.
7. Ivanov V.K., Shcherbakov A.B., BaranchikovA.E., Kozik V.V. Nanocrystalline cerium dioxide: properties, preparation, application. Tomsk; 2013 (in Russian).
8. Tseng M.T., LuX., DuanX.,Hardas S.S., Sultana R., Wu P. et al. Alteration of hepatic structure and oxidative stress induced by intravenous nanoceria. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012; 260 (2): 173-82.
9. Spivak N.Ya., Nosenko N.D., Zholobak N.M., Shcherbakov A. B., Reznikov A. G., Ivanova O. S. et al. The nanocrystalline cerium dioxide raises the functional activity of genesial system of ageing males of rats. Nanosistemy: fizika, khimiya, matematika. 2013; 4 (1): 72-7 (in Russian).
10. Ramesh A., Ratla N. N., Indukuri R., Venkatesh K., Rao S.T. Acute and sub-acute oral toxicity assesement of the cerium oxide nanoparticles in Wistar rats. International Journal of
Phytopharmacology. 2014; 5 (1): 46-50.
11. Poma A., Ragnelli A.M., de Lapuente J., Ramos D., Borras M., Aimola P. et
al. In vivo inflammatory effects of ceria nanoparticles on CD-1 mouse: evaluation by hematological, histological, and TEM analysis. J. Immunol. Res. 2014. Avaible at: http://www.hindawi.com/journals/ jir/2014/361419/ (accessed 8 August 2016).
12. Ефименко Е.Ю., Савченко Ю.А., Фалалеева Т.М., Береговая Т.В., Щербаков О.Б., Иванов В.К. и др. Изменения моторной функции желудка и толстой кишки у крыс под влиянием нанокристалического диоксида церия. Физиологический журнал.2014; 60 (3): 67-74.
13. Срослов М.С., Точилкина Л.П., Филатов Б.Н., Ходыкина Н.В. Экспериментальное изучение острой токсичности наночастиц диоксида церия. В сб.: Нанотоксикология: достижения, проблемы и перспективы: Материалы научной конференции. Волгоград, 2014; 58-9.
14. Глотов Н.В., ред. Биометрия: Учебное пособие. Л.: ЛГУ; 1982.
15. Селезенка, её функции. Available at:
Phytopharmacology. 2014; 5 (1): 46-50.
11. Poma A., Ragnelli A.M., de Lapuente J., Ramos D., Borras M., Aimola P. et
al. In vivo inflammatory effects of ceria nanoparticles on CD-1 mouse: evaluation by hematological, histological, and TEM analysis. J. Immunol. Res. 2014. Avaible at: http://www.hindawi.com/journals/ jir/2014/361419/ (accessed 8 August 2016).
12. lefimenko O.Yu., Savchenko I.O., Falalyeyeva T.M., Beregova T.V., Shcherbakov O.B., Ivanov V.K. et al. The changes of the motor function of the stomach and the colon under the action of the nanocrystalline cerium dioxide. Fiziol. Zh. 2014; 60 (3): 67-74 (in Russian).
13. Sroslov M.S., Tochilkina L.P., Filatov B.N., Khodykina N.V. Experimental study of cerium dioxide nanoparticles acute toxicity. In: Nanotoxicology: achievements, problems and prospects: Materials of scientific conference. Volgograd, 2014; 58-9 (in Russian).
14. GlotovN.V., ed. Biometriya: Textbook: L.: LGU; 1982 (in Russian).
15. Spleen, its function. Available at: http://www.komykak.ru/analiz/selezenka.
http://www.komykak.ru/analiz/selezenka. html (accessed 9 August 2016).
16. Сапин М.Р., Ревазов В.С. Селезенка и костный мозг. Здоровье. 1984; 10. Avaible at: http://lechebnik.info/503/12. htm (accessed 9 August 2016).
17. Song L. Sorption of Bovine Serum Albumin on Nano and Bulk Oxide Particles: Masters Theses 1896. Paper 391. Massachusetts; 2014. Avaible at: http:// scholarworks.umass.edu/cgi/viewcontent. cgi?article=1475&context=theses (accessed 10 August 2016).
18. Анализ крови на щелочную фосфа-тазу. Avaible at: http://myfamilydoctor.ru/ analiz-krovi-na-shhelochnuyu-fosfatazu/ (accessed 10 August 2016) (in Russian).
19. Саноцкий И.В., Уланова И.Л. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М.: Медицина; 1975.
20. Онищенко Г.Г., Тутельян И.В., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Развитие системы оценки безопасности и контроля наноматериалов и нано-технологий в Российской Федерации. Гигиена и санитария. 2013; (1): 4-11.
html (accessed 9 August 2016) (in Russian).
16. Sapin M.R., Revazov KS. Spleen and bone marrow. Zdorov'e. 1984; 10. Avaible at: http://lechebnik.info/503/12.htm (accessed 9 August 2016) (in Russian).
17. Song L. Sorption of Bovine Serum Albumin on Nano and Bulk Oxide Particles: Masters Theses 1896. Paper 391. Massachusetts; 2014. Avaible at: http:// scholarworks.umass.edu/cgi/viewcontent. cgi?article=1475&context=theses (accessed 10 August 2016).
18. Blood alkaline phosphatase test. Avaible at: http://myfamilydoctor.ru/ analiz-krovi-na-shhelochnuyu-fosfatazu/ (accessed 10 August 2016) (in Russian).
19. Sanotskiy I.V., Ulanova I.L. Criteria of harmfulness in hygiene and toxicology for assessment of chemical compounds hazard. M.: Meditsina; 1975 (in Russian).
20. Onishchenko G.G., Tutel'yan I.V., Gmoshinskiy I.V., Khotimchenko S.A. Development of safety evaluation system and control of nanomaterials and nanotechnology in Russian Federation. Gigiena i sanitariya. 2013; (1): 4-11 (in Russian).
L.P. Tochilkina, N.V. Khodykina, L.Yu.Bocharova, M.S. Sroslov, V.V. Klauchek, B.N. Filatov
SUB-CHRONIC TOXICITY OF NANOSIZED CERIUM DIOXIDE
Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology, Federal Medical and Biological Agency of Russia, 400048 Volgograd, Russian Federation
In an experiment on white male rats, systemic toxicity of cerium dioxide nanoparticles in the form of 0.078 M hydrosol was studied. It is found out that a two-month intake of cerium nano dioxide in doses of 50, 10 and 2 mg / kg, was followed by the development of toxic dose-dependent resorptive effect. The dose of 2 mg / kg was qualified as a threshold of general toxic effect in sub-chronic experiment. Keywords: cerium dioxide, nanoparticles, hydrosol, rats, toxicity, threshold dose.
Материал поступил в редакцию 18.11.2016 г.
