CC BY
68
Л.П. Точилкина, Л.Ю. Бочарова, М.С. Срослов, Б.Н. Филатов, Н.В. Ходыкина
Экспериментальное исследование эмбриотоксичности нанодиоксида титана
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии»
ФМБА России, г. Волгоград
L.P. Tochilkina, L.Yu. Bocharova, M.S. Sroslov, B.N. Filatov, N.V. Khodykina
Experimental study of nano-sized titanium dioxide embryotoxicity
Federal State Unitary Enterprise «Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational
Pathology» of FMBA, Russia, Volgograd
Ключевые слова: нанотехнологии, безопасность, диоксид титана, наночастицы, беременность, самки, потомство, эмбриотоксичность, терато-генность, нарушения постнатального онтогенеза.
Цель — экспериментальная оценка эмбриотокси-ческих свойств нанодиоксида титана при перо-ральном пути поступления в организм. Материалы и методы. Исследования выполнены на беспородных белых крысах, на протяжении беременности получавших водные дисперсии порошков нанодиоксида титана (смесь частиц рутильной и анатазной модификаций) и его макроаналога (химический реактив «Титан (IV) окись» марки «ХЧ») в дозе 100мг/кг. Для характеристики влияния диоксида титана на самок и постнатальный онтогенез потомства использовали комплекс физиологических и биохимических методов исследования, действие на антенатальное развитие оценивали с помощью микроанатомических методов анализа плодного материала. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке с применением критериев, адекватных виду эмпирического распределения сравниваемых показателей. Результаты. Эмбриотоксические свойства диоксида титана изучены с позиций системного подхода. Показано, что двуокись титана в макро- и наноразмерном состоянии (100 мг/кг per os) вызывает в материнском организме немногочисленные сдвиги сходной направленности. Ни нанодиоксид титана, ни его макроаналог не оказывают эмбри-олетального и тератогенного действия на потомство in utero, однако оба модифицируют его пост-натальное развитие.
Выводы. При пероральном введении в дозе 100мг/кг нанодиоксид титана и его макроаналог проявляют эмбриотоксические свойства. Последствия прена-тального контакта в обоих случаях проявляются у потомства на постнатальном этапе онтогенеза. Характер отклонений у живорожденных потомков имеет «размерно-обусловленную» специфику.
Keywords: nanotechnology, safety, titanium dioxide; nanoparticles, pregnancy, females, offspring, embryo-toxicity, teratogenicity, disorders of postnatal ontogenesis
Objective: Experimental assessment of embryo-toxic properties of nano-siz.ed titanium dioxide by the oral route of administration.
Material and methods: Researches were performed on white outbred rats during pregnancy the animals were being exposed to 100 mg/kg of water dispersions of nano-sized titanium dioxide powder (a mixture of rutile andanatase particles) andofits macro analogue (chemical reagent "Titanium (IV) oxide «chemically pure». To characterize the effect of titanium dioxide on the females and offsprings postnatal ontogenesis, were used physiological and biochemical research methods. The impact on the antenatal development was assessed using microanatomical methods for analysis of fetal material. The results of the experiments were statistically processed using criteria which are adequate to the type of empiric distribution of compared parameters.
Results: Embryotoxic properties of titanium dioxide were comprehensively studied. It was shown that titanium dioxide in macro- and nano-sized particled (100 mg/kg orally) caused rare similar shifts in mother organism. Neither nano-sized titanium dioxide, nor its macro analogue has embryo-lethal and teratogenic effect on the fetus in utero. How-ever both compounds modify postnatal development of the offspring.
Conclusions: When administered orally at a dose of 100 mg/kg nano-dioxide titanium and its macro analogue exhibit embryo-toxic properties. In both cases the prenatal substance administration effects postnatal ontogenesis. The type ofaberration in liveborn posterity depends on particle size.
Бурное развитие нанотехнологий поставило научное сообщество перед необходимостью контроля безопасности полученной с их применением продукции, объемы производства которой прогрессивно нарастают. Своевременная оценка токсичности и опасности наноматериа-лов способна стать надежным заслоном на пути беспрепятственного проникновения в жизнь вредных для здоровья человека и экологически опасных продуктов и/или содействовать разработке системы мер по защите от их неблагоприятных эффектов [3—5]. Следует также принимать во внимание и то, что любая информация, проливающая свет на особенности биологического действия веществ в наносостоянии, в условиях их недостаточной изученности представляет научныш интерес per se.
Для нанодиоксида титана вопрос об оценке потенциального профессионального и экологического риска стоит особенно остро, поскольку на сегодняшний день среди нано-материалов в наиболее широких масштабах вырабатывается и используется именно он [7]. Известно, что природный диоксид титана (TiO2, ДТ) образует три полиморфные модификации с различным кристаллическим строением: минералы анатаз, рутил и бру-кит. Первые два имеют тетрагональную, последний — ромбическую сингонии [12; 13]. Промышленное значение имеют только рутил и анатаз, для технических целей применяющиеся в виде порошка. Перевод нативно-го диоксида титана в нанокристаллическое состояние сопровождается приобретением на-ночастицами (НЧ) уникальных свойств, существенно расширяющих границы возможного применения во многих сферах деятельности человека. Наноразмерный ДТ с частицами в виде кристаллов, наносфер или лент получают в трех формах — рутильной, анатаз-ной и рентгеноаморфной. В чистом виде на-нопрепараты TiO2 представляют собой легкие белые интенсивно электризующиеся порошки, не растворимые в воде, но легко диспергирующиеся в ней. Нанопорошки являются полифункциональным материалом, имеющим широкие перспективы применения в автомобильной, авиационной и космической промышленности, при изготовлении УФ-фильтров, самоочищающихся покрытий («эффект лотоса»), фотокатализаторов, электрохромных диспле-
ев, волоконной оптики, солнечных батарей, косметики, изделий медицинского назначения и т.д. [7; 10; 11]. С этих позиций очевидно, почему одним из первыгх гигиенических нормативов, обоснованных в России для нанома-териалов, стал ориентировочный безопасный уровень воздействия для нанодиоксида титана в воздухе рабочей зоны [2]. Однако возможность массированного попадания наноча-стиц в сточные воды и воду водоемов в процессе эксплуатации и утилизации продукции, содержащей нанодиоксид титана [7], придает не меньшую актуальность проблеме оценки последствий его поступления в организм пероральным путем. Как один из критериев токсичности и опасности традиционно рассматривается эмбриотоксичность [4].
В рамках настоящей статьи освещены результаты целевых исследований, выполнен-ныгх в ФГУП «НИИ гигиены, токсикологии и профпатологии» ФМБА России (г. Волгоград) в 2013 г.
Материалы и методы
Объектом исследования служил нанопо-рошок диоксида титана, синтезированный методом сжигания тетрахлорида титана в воздушной плазме (фирма «ПЛАЗМОТЕРМ», г. Москва). Согласно данным, представленным производителем, средний размер НЧ, установленный методом просвечивающей электронной микроскопии, составлял 40±3 нм; частицы имели форму, близкую к сферической, и удельную поверхность, равную 33,0±4,0 м2/г. Для определения последней применен метод БЭТ (по адсорбции криптона при температуре жидкого азота). По фазовому составу порошок представлял собой смесь рутила и ана-таза. В соответствии с результатами рентгено-фазового анализа (X-ray) доля рутильной модификации в смеси равнялась 35—40%.
В экспериментах применяли дисперсию исходного образца, полученную ex tempore разведением порошка деионизированной водой. Агрегацию наночастиц предотвращали со-нификацией раствора в ультразвуковой ванне. Препаратом сравнения (макроаналогом) служил химически чистый (ХЧ) реактив «Титан (IV) окись» (ТУ 6-09-05-1186-82) с размером частиц более 200 нм, водную дисперсию которого готовили по аналогичной схеме.
В качестве биомодели использовали беспородных белых крыс. Рабочие растворы нанодиоксида титана (наноТЮ2) и его макроаналога (макроТЮ2) в дозе 100 мг/кг/день вводили самкам внутрижелудочно с помощью зонда из расчета 1,0 мл на 100 г массы тела. Животные параллельного контроля ежедневно получали растворитель в эквивалентном объеме.
Для выявления сдвигов, индуцированных ДТ, использовали комплекс методов, выбор которых определялся задачами конкретного этапа эксперимента и особенностями анатомо-физиологической организации объекта исследования.
О функциональном состоянии организма у половозрелых особей судили по интегральным тестам: масса тела; СПП, ЧСС, мышечная сила, поведенческие реакции (в автоматизированной системе регистрации и идентификации поведенческих актов «LABORAS», «Metris», Нидерланды), морфологический состав крови. Влияние на метаболизм оценивали на основании анализа изменений основных биохимических показателей сыворотки крови, включавших содержание общего белка, альбумина, глюкозы, триглицеридов, холестерина, мочевины, креатинина, молочной и пировино-градной кислот, активность АЛТ, АСТ, ЛДГ и ГГТ. Об активности механизмов антипере-кисной защиты организма судили по содержанию восстановленного глутатиона в цельной крови и конечного продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида (МДА) — в сыворотке. Исследования выполняли с применением биохимического анализатора или унифицированными спектрофотоме-трическими методами.
У крысят-инфантов и ювенилъных животных контролировали видоспецифиче-ские показатели физического развития и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов [8]. Плоды исследовали на наличие аномалий развития традиционными микроанатомическими методами Вильсона и Даусона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР [8].
Полученный экспериментальный материал подвергали статистической обработке. Показатели, учитываемые в альтернативной форме (индексы зачатия, частота анома-
лий, величины эмбриональной и постнаталь-ной гибели), сравнивали методом ф Фишера [6]. Статистическую обработку градированных признаков с непрерывным распределением осуществляли с применением критерия t Стьюдента, используя пакет Primer of Biostatistics 4.03. Различия считали достоверными при р<0,05 [1] (в приведенных далее таблицах помечены символом «*»).
Результаты исследования и их обсуждение
Эмбриотоксичность нанодиоксида титана и его макроаналога оценивали в опыте на белых виргинных крысах-самках с исходной массой тела 200—240 г и регулярным эстральным циклом. Опытным самкам испытуемые дисперсии вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг практически на протяжении всего гестацион-ного периода — с 1-го по 20-й день беременности (ДБ). Контрольные животные по той же схеме получали деионизированную воду. 1-м ДБ считали дату обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках после спаривания с ин-тактными самцами. Экспериментальные группы (две опытные и одну контрольную) формировали по кумулятивному принципу, в течение 4 дней постепенно доводя их численность до 25 особей в каждой.
При составлении рабочего алгоритма эксперимента принимали во внимание уникальность взаимоотношений, складывающихся у млекопитающих в процессе беременности между организмами матери и плода, и исходили из необходимости применения системного подхода как адекватного метода их анализа [9]. Последний реализовывали, проводя одновременную оценку состояния основных звеньев функциональной системы «мать—плод» по завершении 3-недельного экспозиционного цикла испытуемыми соединениями.
О нарушениях гомеостаза у беременных самок судили по результатам их однократного (на 21-й ДБ) комплексного обследования, которое у половины состава каждой группы завершали эвтаназией и некропсией. На вскрытии у самок проводили целевую ревизию репродуктивных органов, у плодов — оценку общего физического развития по измеряемым у них соматометрическим параметрам. Параллельно регистрировали показатели, ха-
растеризующие функциональную активность системы жизнеобеспечения плодов (масса и диаметр диска плаценты). Изъятый на вскрытии плодный материал подвергали специальной фиксации для дальнейшего микроанатомического изучения.
Учитывая возможность манифестации в постнатальном онтогенезе нарушений, основы которых были заложены в период развития in utero, вторую половину численного состава каждой группы беременных доводили до естественного родоразрешения и проводили на-
Таблица 1 Результаты обследования беременных самок, подвергавшихся пероральному воздействию препаратов ДТ
на протяжении гестационного периода
Исследуемые показатели Группы животных
и единицы измерения опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Интегральные физиологические показатели
Прирост массы тела, г 75,9±6,1 82,1±3,5 83,5±3,0
СПП, В 2,19±0,09 2,18±0,08 2,16±0,07
ЧСС, уд./мин 496,7±6,0 487,1±7,7 488,6±7,2
Мышечная сила, г 1087,0±42,2 1011,0±48,1 1071,0±56,3
Поведенческие реакции за 5-минутный период наблюдения
Длительность передвижений, сек 21,81±4,24 23,74±2,62 16,33±3,25
Время неподвижности, сек 22,21±6,93* 37,20±9,78 64,29±13,92
Продолжительность подъемов на задние лапы («стоек»), сек 108,72±12,17 109,81±11,56 83,04±12,68
Продолжительность груминга, сек 33,96±9,27 23,34±3,87 16,01±3,16
Частота перемещений 17,4±3,0 21,4±2,4 15,3±2,7
Частота актов неподвижности 14,4±3,0 16,3±2,8 20,9±3,5
Частота подъемов на задние лапы (количество «стоек») 26,8±3,0 27,6±2,3 22,7±3,3
Частота актов груминга 5,0±1,0 5,1±0,8 3,3±0,4
Максимальная скорость перемещений, мм/сек 123,67±7,85 140,64±5,14* 111,80±8,26
Время перемещений с максимальной скоростью, сек 127,33±25,01 94,43±27,06 86,00±24,76
Средняя скорость перемещения, мм/сек 66,27±1,77 69,29±1,32 66,00±2,07
Пройденная дистанция, м 1,394±0,252 1,620±0,163 1,034±0,233
Количество круговых вращений по часовой стрелке 6,1±0,7 5,4±0,9 5,0±0,9
Количество круговых вращений против часовой стрелки 6,7±1,1 6,9±1,0 4,5±0,9
Средняя продолжительность круговых вращений, сек 8,724±0,433 7,903±0,238 8,737±0,435
Средний периметр окружности круговых вращений, мм 377,6±31,5 407,7±35,3 334,4±29,1
Средняя скорость круговых вращений, мм/сек 4,712±0,427 5,425±0,571 4,115±0,346
Содержание в периферической крови
лейкоцитов, *109/л 16,32±1,62* 12,72±1,39 11,03±1,28
эритроцитов, *1012/л 5,36±0,20 5,37±0,26 5,59±0,15
гемоглобина, г/л 101,7±3,5 101,4±5,1 107,6±3,3
тромбоцитов, *109/л 666,9±29,3 621,5±37,3 630,0±35,6
Биохимические показатели
АСТ, мкмоль/с*л 150,4±13,7 132,6±4,6 149,8±13,6
АЛТ, мкмоль/с*л 71,10±3,04 73,78±5,13 76,89±4,04
ГГТ, Е/л 4,379±0,518 5,076±0,668 3,570±0,757
Мочевина, ммоль/л 5,966±0,405 6,390±0,429 6,397±0,413
ПВК, мкмоль/л 47,67±1,98 45,13±2,09 43,46±1,26
Глюкоза, ммоль/л 4,169±0,242 3,920±0,252 3,964±0,251
Общий белок, г/л 74,87±2,42 72,03±2,03 72,43±0,74
Альбумин, г/л 39,86±1,12 40,12±1,45 40,49±0,60
Триглицериды, ммоль/л 3,571±0,414 3,882±0,272 4,150±0,360
Холестерин, ммоль/л 2,331±0,269 2,606±0,189 2,926±0,197
Молочная кислота, ммоль/л 3,949±0,302 3,867±0,210 3,818±0,172
Молочная кислота/ПВК 82,55±4,54 85,77±2,48 88,48±4,98
ЛДГ, Е/л 995,3±205,6 683,2±108,7 972,9±114,1
Креатинин, мкмоль/л 37,50±2,96 33,51±3,95 31,90±2,84
Восстановленный глутатион, мкмоль/л 1,274±0,139 1,158±0,134 1,231±0,117
МДА, мкмоль/л 10,72±0,51* 10,41±0,34* 12,63±0,52
блюдение за постнатальным развитием выношенного ими потомства.
Оценка влияния наноТЮ2 на беременных самок и антенатальное развитие потомства. Проведенное обследование показало, что 3-недельное поступление ДТ в организм в период беременности вызывает у самок немногочисленные, хотя и значимые сдвиги в поведении, составе периферической крови и в обменных процессах (табл. 1). У самок, получавших макроаналоговый препарат ДТ, выявлено всего 3 достоверных отклонения: почти 3-кратное сокращение времени неподвижности, лейкоцитоз и 15%-ное снижение содержания в крови конечного продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида. У крыс, контактировавших с НЧ ДТ, изменений было 2, и оба отражали аналогичную направленность действия ДТ. На определенную двигательную стимуляцию у самок этой группы указывало 25%-ное увеличение максимальной скорости перемещений, на активацию системы антиперекисной защиты — в той же степени выраженное снижение МДА (см. табл. 1).
Признаки неблагополучия, выявленные у самок при поступлении в организм ДТ, никак не сказались, однако, на их способности к воспроизводству потомства. Индексы зачатия, составившие в первой и второй опытных группах соответственно 88,0 и 96,0%, достоверно не отличались от контрольного показателя, равного 92,0%. Достаточное во всех группах количество забеременевших особей позволило весьма равномерно распределить их на подгруппы в соответствии с этапами исследования (табл. 2).
На абдоминальном вскрытии первой половины самок было установлено, что испытуемые препараты ДТ негативного влия-
ния на внутриутробное развитие потомства не оказывают. В обеих опытных группах выношенные плоды по внешнему виду и основным показателям жизнеспособности (кранио-каудальный размер, масса тела) соответствовали своему физиологическому возрасту и не отличались от потомства контрольных особей. Плацентарная система фетального жизнеобеспечения, судя по неизмененным метрическим характеристикам, имела адекватную степень функциональной зрелости. В величинах антенатальной гибели значимые различия между опытом и контролем также отсутствовали (табл. 3).
Прижизненный осмотр плодов наличия у них грубых пороков развития не обнаружил. При последующем микроанатомическом изучении зафиксированного плодного материала тератогенных эффектов также не наблюдали.
Так, просветление мягких тканей по методу Даусона и последующий анализ костной системы плодов (32 в контроле, 33 и 27 в первой и второй опытных группах соответственно) не выявили в опыте никаких отклонений в строении их скелета, равно как и в темпах оссификации хрящевых закладок различных костных образований.
В процессе исследования трансверсаль-ных срезов тела по методике Вильсона установлено, что внутренние органы плодов сохраняли нормальную топографию и свойственную им структуру. Во всех опытных группах регистрировали редкие нарушения эмбриогенеза без характерной специфики, каждое из которых по частоте не превышало уровня спонтанных аномалий аналогичного типа в контроле. При суммарном учете во всех опытных группах обнаружилась тенденция к увеличению их общего количества, однако ввиду отсутствия статистического подтверждения зна-
Таблица 2 Распределение беременных самок по этапам исследования
Исследуемые показатели Группы животных
опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Количество спарившихся самок 25 25 25
Количество забеременевших самок 22 24 23
Индекс зачатия, % 88,0 96,0 92,0
Количество самок, оставленных для получения плодного материала 11 10 9
Количество самок, оставленных для получения живорожденного потомства 11 14 14
Таблица 3
Результаты вскрытия беременных крыс, на протяжении гестационного периода получавших диоксид титана
Исследуемые показатели Группы животных
опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Количество на самку
Желтых тел беременности 11,9±0,6 11,2±0,4 11,7±0,5
Мест имплантации 11,4±0,7 11,0±0,4 11,2±0,7
Выношенных плодов 10,8±0,6 10,6±0,6 10,4±0,7
Внутриутробная гибель, %
До имплантации 4,2 1,8 3,8
После имплантации 5,3 3,6 6,9
Общая 9,2 5,4 10,5
Соматометрические показатели плода
Масса тела, г 3,85±0,10 4,00±0,14 3,99±0,10
Краниокаудальный размер, мм 36,3±0,2 36,3±0,4 36,2±0,2
Характеристики системы жизнеобеспечения плода
Масса плаценты, г 0,58±0,02 0,64±0,03 0,62±0,03
Диаметр диска плаценты, мм 15,0±0,1 15,2±0,1 15,2±0,1
чимости выявленных различий все нарушения эмбриофетогенеза в опыте квалифицировали как не имеющие каузальной связи с воздействием испытуемых препаратов ДТ (табл. 4).
Таким образом, в описанных условиях эксперимента как макроаналоговый, так и на-норазмерный ДТ вызывали в функциональной системе «мать—плод» немногочисленные патологические сдвиги, сосредоточенные в пределах материнского организма. Отсутствие различий между опытом и контролем по частоте и характеру мальформаций свидетельствовало против наличия у них тератогенного действия.
Изучение влияния наночастиц ДТ на постнаталъное развитие потомства. Состояние полученного от второй половины самок потомства контролировали на протяжении 2 месяцев после рождения. Динамическое наблюдение за его развитием включало учет смертности, регистрацию параметров морфологического созревания и изучение скорости становления базовых сенсорно-двигательных рефлексов лактационного периода. В 2-месячном возрасте животных подвергали комплексному обследованию. За исключением массы тела, которую определяли
Таблица 4 Данные микроанатомического анализа трансверсальных срезов тела плодов самок, подвергавшихся воздействию диоксида титана во время беременности
Исследуемые показатели Группы животных
опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Количество и пол исследованных плодов 29 в 21 ? 26 в 24 ? 27 в 23 ?
Количество плодов с нарушениями эмбриогенеза 8/50 8/50 4/50
Частота отдельных дефектов развития, %о
Гидронефроз 2,0 2,0 2,0
Нефроптоз 6,0 6,0 2,0
Мегауретер 2,0 0 0
Мегацистис 2,0 2,0 0
Дистопия тестикул 2,0 (3,4% самцов) 2,0 (3,8% самцов) 0
Гемоперитонеум 0 2,0 0
Кровоизлияния в печень 2,0 0 0
Кровоизлияния в слюнные железы 0 0 2,0
Подкожные гематомы 0 0 2,0
Межмышечные гематомы 0 2,0 0
Суммарная частота аномалий в группе, % 17,4 17,8 8,0
Таблица 5 Постнатальная смертность и динамика массы тела потомства крыс, подвергавшихся воздействию диоксида титана во время беременности
Исследуемые показатели Группы животных
опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Количество рожденных крысят 97 141 140
Средняя величина помета, крысят/самку 8,8±0,9 10,1±0,5 10,0±0,5
Гибель в постнатальном периоде, %
4-е сутки 9,6 2,1 5,3
7-е сутки 11,5 8,5 5,3
14-е сутки 12,5 12,8 6,9
21-е сутки 12,5 20,6* 8,4
1 месяц 13,5 22,7* 9,2
2 месяца 13,5 22,7* 9,2
Прирост массы тела, г
14-е сутки 20,8±0,3* 18,3±0,3* 19,1±0,3
21-е сутки 30,1±0,5* 27,6±0,4 28,0±0,5
1 месяц 61,3±1,1 58,6±1,0 58,6±1,0
2 месяца 153,7±3,5 150,0±2,9 156,6±2,4
у всех крысят поголовно, остальные показатели регистрировали выборочно. Для обеспечения репрезентативности выборок (не менее 24 особей) от каждой отдельной самки произвольно отбирали по 2 крысенка (самку и самца) на каждые 2—3 теста, что позволяло и в этом случае добиться практически тотально -го включения в эксперимент всей выращенной популяции.
Проведенное наблюдение показало, что развитие потомства в опыте и контроле происходит с некоторыми различиями. В первую очередь они затронули такие основополагающие для суждения о характере и выраженности действия ксенобиотиков показатели, как пост-натальная смертность и прирост массы тела.
Было установлено, что макроразмер -ный ДТ оказывает на наращивание массы тела крысятами в период лактации некото -рое стимулирующее действие: данный показатель в первой опытной группе был достоверно повышен относительно контроля на 14-е и 21-е сутки жизни. Постнатальная смертность имела динамику, сходную с наблюдавшейся в контроле (табл. 5).
Напротив, после воздействия нанодиоксида титана масса тела крысят на 14-й день достоверно снизилась, и одновременно наметилась тенденция к повышению постнатальной гибели. Начиная с 21-х суток подъем смертности над уровнем контроля ~ в 2,4 раза приобрел устойчиво достоверный характер (см. табл. 5).
Тотальное тестирование крысят-инфантов свидетельствовало, что основные признаки прогрессирующего морфологического созревания, такие как отлипание ушной раковины, прорезывание резцов, покрытие шерстью и открытие глаз, в подопытных группах и контроле формировались одновременно. Однако обретение свойственных полу репродуктивных признаков происходило по-разному — не только в опыте и контроле, но и у потомков разного пола. У самцов макро- и наноразмерный ДТ ускоряли темпы опускания семенников, и к 25-му дню жизни этот процесс завершился у 83,7% (макроТЮ2) и 78,7% (наноТЮ2) самцов, притом что аналогичный показатель в контроле был равен всего 57,4%. В противоположность этому половое созревание самок, подвергавшихся прена-тальному воздействию нанодиоксида титана, было затянутым. Так, на 55-й день жизни открытие влагалища произошло лишь у 78,3% самок второй опытной группы, в то время как в контроле — у 98,4% (табл. 6).
Оценка своевременности и динами -ки формирования у опытных животных сенсорно-двигательных рефлексов лактационного периода свидетельствовала о десин-хронизации процессов становления у них и ряда сенсорных функций. Так, в раннем нео-натальном периоде подопытное потомство демонстрировало лучшую по сравнению с контролем способность к координации движений,
Таблица 6
Показатели физического развития потомства крыс, подвергавшихся пероральному воздействию диоксида титана
во время беременности
Исследуемые показатели Возраст крысят, Количество особей с наличием признака, %
сутки опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Отлипание ушной раковины 4 81,1 71,7 74,3
5 98,4 95,4 97,6
6 100,0 99,2 100,0
Прорезывание нижних резцов 12 92,3 97,6 97,5
Открытие глаз 19 100,0 98,8 99,2
21 100,0 100,0 100,0
Опускание семенников 25 83,7* 78,7* 57,4
30 100,0 100,0 100,0
Открытие влагалища 45 30,8 39,6 45,3
55 94,7 78,3* 98,4
Мышечная сила 30 334,5±6,7 321,9±6,7 335,8±6,6
60 826,3±14,8 808,4±15,0 802,1±12,7
Примечание: для показателя «Мышечная сила» единицей измерения являются граммы.
на что указывали более высокие показатели, полученные в обеих опытных группах в тесте «переворачивание на плоскости» (табл. 7).
О более развитом обонянии у потомков второй опытной группы можно было судить по определенному опережению контроля в сроках формирования положительных ответов в тесте «хоминг». Однако наряду с подобными изменениями были и негативные сдвиги. В частности, если у потомков второй опытной группы процент особей, принимавших правильную позу в тесте «отрицательный геотаксис», по величине был сопоставим с контрольными показателями, то у крысят первой группы на 5-й день жизни он был достоверно снижен.
В 2-месячном возрасте химически индуцированные модификации постнатально-го развития подопытного потомства сохранялись. Их проявления были совсем немногочисленны, но биологически значимы.
В первой опытной группе они ограничивались тремя показателями. Первый характеризовал изменения в сфере круговых движе-
ний и выражался в увеличении среднего периметра окружности вращений. Вторым являлась лейкопения, третьим — снижение уровня общего холестерина в сыворотке крови (табл. 8).
Потомки второй группы, развивая такую же максимальную скорость, как и контрольные животные, не могли поддерживать ее столь же долго, и время перемещений с максимальной скоростью у них было сокращено в сравнении с контролем ~ в 1,6 раза.
Таким образом, итоги наблюдения свидетельствуют, что на жизненном отрезке от периода новорожденности до возраста репродуктивной зрелости развитие потомства обеих подопытных групп происходило с целым рядом отклонений от физиологического образца, представленного параллельным контролем. Выявленные модификации дают основания заключить, что в описанных условиях эксперимента макро- и наноразмерный ДТ проявляет эмбриотоксические свойства.
Резюме. В опытах на беспородных белых крысах установлено, что 3-недельный кон-
Таблица 7
Скорость созревания у потомства некоторых сенсорно-двигательных рефлексов лактационного периода
Исследуемые показатели Возраст крысят, Количество особей с наличием признака, %
сутки опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Переворачивание на плоскости 5 94,7* 90,2 87,1
6 100,0* 99,2* 93,5
Отрицательный геотаксис 5 38,3* 52,3 51,8
7 78,3 94,6 88,5
Хоминг 12 53,8 72,8* 50,8
14 83,5 93,5* 85,2
Переворачивание в свободном падении 19 100,0 98,4 100,0
Таблица 8 Результаты обследования двухмесячного потомства (обоего пола) самок крыс, подвергавшихся пероральному воздействию диоксида титана в период беременности (средние из 24—40 определений)
Исследуемые показатели Группы животныгх
опыт 1, макроТЮ2 опыт 2, наноТЮ2 контроль
Интегральные физиологические показатели
СПП, В 2,38±0,06 2,36±0,05 2,39±0,05
ЧСС, уд./мин 505,0±6,4 500,8±6,8 500,5±7,2
Поведенческие реакции за 5-минутный период наблюдения
Длительность передвижений, сек 28,25±1,65 25,10±1,63 26,66±1,80
Время неподвижности, сек 10,51±1,84 20,47±5,56 14,75±3,63
Продолжительность подъемов на задние лапы («стоек»), сек 161,67±6,44 148,13±8,34 154,71±7,81
Продолжительность груминга, сек 31,89±4,26 25,81±4,38 29,83±4,11
Частота перемещений 25,3±1,4 22,3±1,5 23,1±1,6
Частота актов неподвижности 6,9±0,9 10,2±1,6 8,5±1,2
Частота подъемов на задние лапы (количество «стоек») 33,6±1,2 30,8±1,6 31,2±1,4
Частота актов груминга 5,4±0,5 4,9±0,7 5,3±0,6
Максимальная скорость перемещений, мм/сек 162,52±4,43 170,72±4,53 162,53±4,94
Время перемещений с максимальной скоростью, сек 100,45±14,62 72,95±12,44* 114,15±14,92
Средняя скорость перемещения, мм/сек 74,68±0,88 76,97±0,91 74,40±0,97
Средняя скорость за период наблюдения, мм/сек 7,96±0,46 7,65±0,48 7,30±0,47
Пройденная дистанция, м 2,388±0,139 2,295±0,144 2,191±0,142
Количество круговых вращений по часовой стрелке 8,6±0,6 8,1±0,8 9,3±0,7
Количество круговых вращений против часовой стрелки 9,6±0,5 8,9±0,6 8,7±0,6
Средняя продолжительность круговых вращений, сек 7,542±0,204 7,249±0,183 7,437±0,169
Средний периметр окружности круговых вращений, мм 260,7±7,1* 249,6±7,0 240,6±6,4
Средняя скорость круговых вращений, мм/сек 36,56±1,23 37,71±1,22 34,72±1,01
Содержание в периферической крови
Лейкоцитов, *109/л 15,23±0,80* 16,76±0,78 18,31±1,01
Эритроцитов, *1012/л 5,95±0,08 5,90±0,09 5,99±0,10
Гемоглобина, г/л 127,7±2,1 128,2±1,8 128,4±1,9
Тромбоцитов, *109/л 542,1±20,5 500,5±21,0 537,4±20,4
Биохимические показатели
АСТ, мкмоль/с*л 177,7±13,5 190,8±19,2 174,6±13,8
АЛТ, мкмоль/с*л 121,6±8,6 137,9±9,3 122,7±7,1
ГГТ, Е/л 5,529±0,710 6,001±0,912 4,828±0,678
Мочевина, ммоль/л 5,792±0,321 6,020±0,348 6,658±0,338
ПВК, мкмоль/л 40,86±1,21 37,76±0,91 40,84±1,31
Глюкоза, ммоль/л 8,608±0,157 8,270±0,144 8,371±0,192
Общий белок, г/л 68,89±2,38 67,89±2,23 69,90±2,47
Альбумин, г/л 42,48±1,43 42,29±1,48 43,15±1,57
Триглицериды, ммоль/л 0,594±0,049 0,723±0,052 0,681±0,030
Холестерин, ммоль/л 1,747±0,055* 2,013±0,086 1,964±0,078
Молочная кислота, ммоль/л 3,581±0,179 3,311±0,124 3,530±0,189
Молочная кислота/ПВК 87,07±2,51 87,50±2,10 86,55±3,10
ЛДГ, Е/л 681,4±100,0 621,7±63,2 573,2±62,4
Креатинин, мкмоль/л 34,39±1,16 34,75±1,13 35,08±0,95
Восстановленный глутатион, мкмоль/л 1,066±0,029 1,078±0,046 1,156±0,038
МДА, мкмоль/л 10,82±0,25 10,51±0,22 10,87±0,22
такт с нанодиоксидом титана и его макроаналогом (100 мг/кг per os) приводит к возникновению у беременных самок весьма немногочисленных сходных гомеостатических сдвигов и не отражается на их способности к зачатию и вынашиванию потомства. Внутриутробное разви-
тие их потомства протекало без явных патологических отклонений: ни повышения антенатальной гибели, ни учащения структурных пороков у плодов опытных групп не регистрировали. Тем не менее последующее наблюдение за живорожденными потомками предоста-
вило экспериментальные доказательства того, что реальные последствия пренатального воздействия ДТ и в макро-, и в наноформе оказались более серьезными.
Многочисленные и порой разнонаправленные модификации постнатального онтогенеза у подопытного потомства наблюдали и в раннем неонатальном периоде, и в юве-нильном возрасте, и в возрасте репродуктивной зрелости. Безусловно негативный характер носили такие изменения, как повышение постнатальной смертности (наноформа ДТ), торможение прироста массы тела ( нано- и макроформа ДТ), замедленное половое созревание у самок (наноформа) и отставание в сроках формирования отрицательного геотаксиса (макроформа). Наряду с ними констатировали наличие изменений, лишенных очевидных признаков вредности. Например, невозможно было проигнорировать, что становление таких рефлексов, как «переворачивание на плоскости» (обе группы) и «хоминг» (наноформа), шло ускоренными темпами и что в отличие от самок формирование половых признаков у самцов в опыте (нано- и макроформа ДТ) по срокам опережало контроль.
Разнонаправленные смещения относительно контроля маркерных сроков физического и функционального созревания, вероятно, указывали на химически индуцированную десинхронизацию сложных процессов гетерогенного системогенеза у подопытных крысят, причем последствия пренатального воздействия нанодиоксида титана и его макроаналога разнились, что с учетом равной в мг/кг до-зовой нагрузки на самок позволяет выявленный в каждом случае спектр отклонений считать «размерно-обусловленным», т.е. эффектом, зависимым от степени дисперсности ДТ. Даже по достижении потомками возраста относительной зрелости модификационные изменения сохраняли межгрупповые различия. Так, в первой опытной группе (макроформа) отмечали определенные расстройства в сфере круговых вращений, лейкопению и гипохоле-стеринемию, во второй (наноформа) — изменения локомоции в отсутствие гематологических сдвигов и признаков нарушенного печеночного метаболизма.
Выводы
1. Наночастицы диоксида титана (40±3 нм; смесь рутила и анатаза) и его крупноразмерный аналог (ХЧ-реактив ДТ) при вну-трижелудочном введении в период беременности в дозе 100 мг/кг в виде водных дисперсий оказывают на лабораторных крыс-самок сходное слабовыраженное общетоксическое действие.
2. При пероральном введении в дозе 100 мг/кг нанодиоксид титана и его макроаналог проявляют эмбриотоксические свойства. Последствия пренатального воздействия проявляются у потомства разнонаправленными модификациями процессов мор-фофункционального созревания на пост-натальном этапе онтогенеза.
3. Комплекс отклонений, индуцированных у потомков диоксидом титана разной дисперсности, имеет «размерно-обусловленную» специфику.
Литература
1. Биометрия: Учеб. пособие. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982.
2. ГН 1.2.2633-10. Гигиенические нормативы содержания приоритетных нанома-териалов в объектах окружающей среды: утв. главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 25 мая 2010 г.
3. МР 1.2.2522-09. Выявление наномате-риалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека. Методические рекомендации: утв. главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 1 июля 2009 г.
4. МУ 1.2.2520-09. Токсиколого - гигиеничес -кая оценка безопасности наноматериа-лов. Методические указания: утв. главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 5 июня 2009 г.
5. МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания: утв. главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 мая 2010 г.
6. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М.: Изд-во МГУ, 1980.
7. Проданчук М.Г., Балан Г.М. Наночастицы диоксида титана и их потенциальный риск для здоровья и окружающей среды // Современные проблемы токсикологии. 2011. № 4. С. 11-27.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева; 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2005.
9. Савченков Ю.И., Лобынцев К.С. Очерки физиологии и морфологии функциональной системы мать-плод. М.: Медицина, 1980.
10. Iavicoli I., Leso V., Fontana L., Berga-maschi A. Toxicological effects of titanium dioxide nanoparticles: a review of in vitro mammalian studies // European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2011. Vol. 15. № 5. P. 481-508.
11. Iavicoli I., Leso V., Bergamaschi A. Toxicological effects of titanium dioxide nanoparticles: a review of in vivo studies //
Journal of Nanomaterials. 2012. Vol. 2012. Article ID 964381. Available at: http://www. hindawi.com/journals/jnm/2012/964381/ (accessed: 11.07.2014).
12. Occupational exposure to titanium dioxide: current intelligence bulletin 63. NIOSH, April 2011. 140 pp. № 2011-160.
13. State of the science literature review: nano titanium dioxide environmental matters. Scientific, technical, research, engineering and modeling support (STREAMS): final report / U.S. EPA; prepared by eastern research group. Washington, August 2010. 486 pp. № EP-C-05-059.
Контакты:
Точилкина Людмила Петровна,
заведующая лабораторией лекарственной безопасности ФГУП ФГУП «НИИГТП» ФМБА России, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник. Тел. раб.: 8-8442-78-62-57; тел. моб.: 8-902-38-68-168. E-mail: tochilkina@rihtop.ru
информация_
Информация о рабочем межрегиональном совещании по профилактике геморрагической лихорадки Эбола
По данным Всемирной организации здравоохранения, эпидемическая ситуация по заболеваемости геморрагической лихорадкой Эбола остается сложной. Ежедневно регистрируется около 200 больных. В основном неблагополучными по заболеваемости этой инфекцией остаются страны Западной Африки (Гвинея, Либерия, Сьерра-Леоне), где на 15 ноября зафиксировано около 15 тыс. случаев заболевания, из них около 6 тыс. - с летальным исходом. Кроме того, имеют место случаи заносов лихорадки Эбола в другие страны и регионы: Мали, Нигерию, Сенегал, Демократическую Республику Конго, США, Испанию, Германию, Францию, Норвегию, Англию.
По информации главного государственного санитарного врача Российской Федерации, не исключаются случаи завоза лихорадки Эбола на любые территории, в том числе на территорию Российской Федерации.
В целях обеспечения подготовки специалистов ФМБА России к организации и проведению противоэпидемических мероприятий при заносе особо опасных вирусных лихорадок на базе ФГБУЗ «Головной центр гигиены и эпидемиологии» ФМБА России 19 ноября 2014 г. проведено межрегиональное рабочее совещание по вопросам профилактики лихорадки Эбола. На совещании присутствовали врачи-инфекционисты, госпитальные эпидемиологи, организаторы здравоохранения, руководители территориальных органов из 45 медицинских организаций, обслуживаемых ФМБА России, расположенных в 31 субъекте Российской Федерации.
На совещании выступал главный внештатный специалист, заведующий кафедрой инфекционных болезней ФГБОУ ДПО ИПК ФМБА России В.В. Никифоров.
Специалисты МСЧ № 165 продемонстрировали все виды защитной одежды, используемой в очагах особо опасной инфекции, средства доставки больных (биобоксы) и работу походного изолятора для госпитализации инфекционных больных.
