CC BY
48
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Точилкина Л.П.1, Ходыкина Н.В.1, Новикова О.Н.1, Бочарова Л.Ю.1, Власова Т.М.1, Маркова Е.Ю.1, Великородная Ю.И.1, Баранчиков А.Е.2, Теплоногова М.А.2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ НАНОДИОКСИДА ЦЕРИЯ
Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» Федерального медико-биологического агентства, 400048, г. Волгоград;
2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей и неорганической химии имени Н.С. Курнакова Российской академии наук», 119991, г. Москва
Цель исследования - оценить гепатопротекторный потенциал нанодиоксида церия. Материал и методы. Объектом исследования служил высокодисперсный 0,047 М (8,08 мг/ мл) гидрозоль нанодиоксида церия (НДЦ), содержащий сферические частицы со средним диаметром 2,7 нм. Модель острого токсического гепатита реализовывали однократным внутри-желужочным введением лабораторным крысам 50 % масляного раствора тетрахлорметана (ТХМ) в дозе 4,5 мл/кг. Гепатопротекторный эффект НДЦ оценивали при введении его в дозах 2,0, 0,2 и 0,02 мг/кг (в/ж) в сравнении с эталонным препаратом карсилом (100 мг/кг в пересчете на действующее вещество силимарин). Для характеристики состояния печени применяли биохимические, коагулометрические и гистоморфологические методы исследования. Результаты и обсуждение. В ходе исследований установлено, что отравление ТХМ приводит к гибели части крыс. Спустя неделю у выживших животных сохраняется комплекс патологических биохимических сдвигов и гистоморфологических нарушений, предоставляющих для их коррекции достаточное (7 дней) «терапевтическое окно».
Изучали влияние курсовой (в течении 7 дней) терапии НДЦ на метаболизм, состояние анти-перекисной защиты и гистологическую структуру печени крыс, перенёсших острое отравление ТХМ. Установлено, что применение НДЦ в дозах 0,2 мг/кг и 0,02 мг/кг сопровождается отчётливым гепатопротекторным эффектом, проявляющимся ускоренным восстановлением гистоархитектоники печени, стабилизацией массы тела, купированием большинства метаболических нарушений и нормализацией ПОЛ. По результатам комплексной оценки зарегистрированных положительных сдвигов оптимальным признано использование НДЦ в дозе 0,2 мг/кг, позволившее максимально смягчить последствия острого отравления ТХМ. Повышение дозы НДЦ до 2,0 мг/кг приводит к практически полной утрате метаболического защитного эффекта, ослаблению антиоксидантного действия и положительного влияния на морфологическую картину органа-мишени.
По корректирующему влиянию на метаболизм НДЦ (0,2 мг/кг) несколько уступает карсилу, однако превосходит его по способности ускорять регенерацию печени.
Заключение. На тетрахлорметановой модели острой гепатотоксичности подтверждена возможность применения нанодиоксида церия в низких дозах в качестве гепатопротекторного средства. Полученные результаты могут способствовать дальнейшим разработкам в области экспериментальной терапии заболеваний печени с применением «наноантиоксидантов».
Ключевые слова: тетрахлорметан; крысы; острый токсический гепатит; окислительный стресс; антиоксиданты; наночастицы; диоксид церия; карсил.
Дляцитирования Точилкина Л.П., Ходыкина Н.В., Новикова О.Н., Бочарова Л.Ю., Власова Т.М., Маркова Е.Ю., Великородная Ю.И., Баранчиков А.Е., Теплоногова М.А. Экспериментальная оценка гепатопротекторных свойств нанодиоксида церия. Медицина экстремальных ситуаций. 2020; 22(2): 237-247.
Для корреспонденции: Точилкина Людмила Петровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией лекарственной безопасности ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» ФМБА России, 400048, г. Волгоград. E-mail: tochilkina@rihtop.ru
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Tochilkina L.P.1, Khodykina N.V.1, Novikova O.N.1, Bocharova L.Yu.1, Vlasova Т.М.1, Markova Е.Yu.1, Velikorodnaya Yu.I.1, Baranchikov А.Е.2, Teplonogova М.А.2
EXPERIMENTAL EVALUATION OF HEPATOPROTECTIVE PROPERTIES OF CERIUM NANODIOXIDE
Research Institute for Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology of the Federal Medical and Biological Agency, Volgograd, 400048, Russian Federation
2Kurnakov Institute of General and Inorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences (IGIC RAS), Moscow, 119991, Russian Federation
Aim of the study. Evaluation of the hepatoprotective potential of cerium nanodioxide (CND). Material and methods. The study object was the finely dispersed 0.047M (8.08 mg/ml) CND hydrosol containing spherical particles with an average diameter of 2.7 nm. The acute toxic hepatitis model was implemented by the single intragastric administration of 50% oil solution of tetrachloromethane to laboratory rats at a dose of 4.5 ml/kg. The hepatoprotective effect of CND was evaluated when administered in doses of 2.0; 0.2 and 0.02 mg/kg (i.g.) in comparison with the reference preparation Karlsil (100 mg/kg in terms of the active substance silymarin). To characterize the liver state, biochemical, coagulometric, and histomorphological research methods were used.
Results and discussion. In the course of research, it was found the poisoning with tetrachloromethane to lead to the death in some rats. A week later, the surviving animals retain the complex of pathological biochemical changes and histomorphological disorders that provide the sufficient (7 days) "therapeutic window " for their correction. We studied the effect of a course (within 7 days) CND therapy on metabolism, the state of antiperoxidation protection, and the liver histostructure of rats after acute poisoning with tetrachloromethane. The use of NDC in doses of 0.2 mg/kg and 0.02 mg/kg It was found to be accompanied by a clear hepatoprotective effect, manifested by an accelerated restoration of liver histoarchitectonics, stabilization of body weight, relief of most metabolic disorders and normalization of lipid peroxidation. According to comprehensive assessment results of registered positive shifts, the use of CND at a dose of 0.2 mg/kg was recognized as optimal, which made it possible to mitigate the effects of acute TCM poisoning as much as possible. The increase in the CND dose to 2.0 mg/kg leads to the almost complete loss of the metabolic protective effect, the weakening of the antioxidant effect, and the positive effect on the morphological picture of the target organ. According to the corrective effect on the metabolism, CND (0.2 mg/kg) is slightly inferior to Karsil, but surpasses it in its ability to accelerate liver regeneration.
Conclusion. On the tetrachloromethane model of acute hepatotoxicity the possibility of using cerium nanodioxide in low doses as a hepatoprotective agent was confirmed. The obtained results may contribute to further developments in the field of experimental therapy of liver diseases using "nanoantioxidants". Keywords: carbon tetrachloride; rats; acute toxic hepatitis; oxidative stress; antioxidants; nanoparticles; cerium dioxide; karsil.
For citation: Tochilkina L.P., Khodykina N.V., Novikova O.N., Bocharova L.Yu., Vlasova Т.М., Markova E.Yu., Velikorodnaya Yu.I., Baranchikov А.Е., Teplonogova М.А. Experimental evaluation of hepatoprotective properties of cerium nanodioxide. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2020; 22(2): 237-247. (In Russian)
For correspondence: LyudmilaP. Tochilkina, MD, PhD., Senior Researcher, Head of the Laboratory of Drug Safety of the Research Institute of Hygiene, Toxicology, and Occupational Pathology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, Volgograd, 400048, Russian Federation. E-mail: tochilkina@rihtop.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: November 20, 2019 Accepted: June 22, 2020
Введение
Гепатиты - полиморфная группа болезней с первичным поражением гепатоцитов, которые характеризуются широким спектром клинических вариантов течения и различным морфологическим субстратом заболевания. Токсические гепатиты, развивающиеся вследствие экзогенных химических воздействий (злоупотребление
238
алкоголем, передозировка лекарственных препаратов, случайный приём веществ промышленного назначения и т.п.), занимают в общей структуре патологических состояний с преимущественным повреждением гепатобилиарной системы далеко не последнее место. Такие гепатиты протекают обычно остро или подостро, однако могут иметь прогредиентное течение и исход в виде цирроза печени и в любом случае
создают угрозу жизни и здоровью пострадавших. Основными средствами патогенетической терапии гепатитов служат препараты фармакологической группы «гепатопротекторы», к критериям действия которых относят восстановление гомеостаза в печени, повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов [1, 2].
Однако недостаточная эффективность лечения целого ряда нозологических форм поражений печени, не позволяющая сдержать неуклонный рост инвалидизации и летальности, по-прежнему остаётся серьёзной клинической проблемой и вызовом современной медицинской науке [1, 2].
Как известно, окислительный стресс сопровождает практически любую патологию печени, однако при заболеваниях, относящихся к классу свободнорадикальных (токсические, лекарственно- и алкоголь-индуцированные поражения, ряд метаболических расстройств) он является триггером и ключевым патогенетическим механизмом гибели гепатоцитов [3-6]. Поэтому не удивительно, что подавляющее большинство гепатопротекторов представляют собой вещества, в той или иной степени обладающие антиоксидантным действием. В частности, силимарин и адеметионин (входящие в состав препаратов карсил и гептрал соответственно) являются мощными анти-оксидантами [7]. Тем не менее, в настоящее время ни одно из имеющихся на фармацевтическом рынке средств защиты печени в полной мере не удовлетворяет тем требованиям к «идеальному гепатопротектору», которые были сформулированы в 70-е годы ХХ века [1, 8]. В силу этого современная медицина сохраняет высокую потребность в новых эффективных и безопасных препаратах, которая стимулирует их постоянный поиск среди веществ различных химических групп, включая нетрадиционные формы, представленные, в частности на-номатериалами. В последнее десятилетие он активно проводится среди нанопроизводных металлов и их оксидов [9-11]. Нанодиоксиду церия (НДЦ) в рамках данного направления уделяется повышенное внимание.
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Уникальные физико-химические характеристики наночастиц диоксида церия (выраженная кислородная нестехиометрия и способность к саморегенерации), наличие каталазо- и супе-роксиддисмутазоподобных свойств позволяют им инактивировать широкий спектр свободных радикалов и АФК, участвуя во внутриклеточных редокс-реакциях многократно [12-17]. Доказанное в системах in vitro и in vivo анти-оксидантное действие [13, 15, 16] даёт основание прогнозировать у НДЦ наличие гепатопро-текторной активности. Материалы публикаций последних 5 лет свидетельствуют о формировании к этому вопросу устойчивого интереса [18-22]. Показательно, что только в 2019 г. в печати представлены результаты не менее трёх релевантных исследований [23-25]. Вместе с тем большинство опубликованных работ нацелено на выявление у нанодиоксида церия фибропревентивной, фибростатической и фи-бролитической активности, особо ценных для профилактики и лечения хронической патологии печени (фиброза, цирроза и их осложнений). Возможность терапевтического применения НДЦ для купирования проявлений острой гепатотоксичности практически не изучена, что и определило цель настоящей работы - оценить гепатопротекторный потенциал нанодиоксида церия, наноматериала с подтверждёнными in vitro и in vivo антиоксидантными свойствами. В основу публикации положены результаты экспериментального решения задачи, предопределённой вышеозначенной целью - охарактеризовать влияние НДЦ на проявления острой печёночной патологии, индуцированной одним из облигатных гепатотоксикантов.
Материал и методы
Объектом экспериментального исследования служил образец золя НДЦ, синтезированный и охарактеризованный в ИОНХ РАН, Москва.
По данным просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и УФ-видимой спектроскопии, образец содержал практически не агрегированные наночастицы со средним диаметром 2,7 нм и УФ-спектром поглощения, соответствующим диоксиду церия (рис. 1). Содержание диоксида церия в тестируемом золе составляло 8,08 мг/мл (0,047 М).
239
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Исследования проводили на белых беспородных крысах самцах с массой тела 180-230 г. Содержание, питание, уход за животными и их умерщвление осуществляли в соответствии с требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, Женева, 1985) и. Приказом Минздрава России от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
Острую гепатотоксичность моделировали применением облигатного гепатотоксиканта тетрахлорметана (ТХМ). 50% раствор ТХМ (ХЧ, Россия) в растительном масле вводили крысам однократно перорально при помощи зонда из расчета 4,5 мл/кг массы [26]. Крыс опытных групп, предназначенных для оценки гепатопротекторного эффекта НДЦ, после отравления подвергали курсовому лечению золем наночастиц в трёх ежедневных дозах - 2,0; 0,2 и 0,02 мг/кг. При этом высший уровень экспозиции НДЦ соответствовал величине установленного ранее порога общетоксического субхронического действия [27]. В качестве эталонного гепатопротектора-антиоксидан-та использовали водную суспензию препарата карсил (SOPHARMA AD, Болгария), обеспечивая поступление действующего вещества си-лимарина в ежедневной дозе 100 мг/кг [26]. Средства фармакологической коррекции вводили крысам перорально из расчета 0,5 мл на 100 г массы. Животные контрольной группы и
240
группы сравнения (ТХМ без лечения) получали деионизированную воду в тех же количествах. С целью обеспечения достаточного «терапевтического окна» испытуемые препараты вводили в течение 7 сут с момента отравления ТХМ. Исходная численность сравниваемых групп составляла 20 особей.
Наблюдения за животными осуществляли ежесуточно, фиксируя общее состояние, активность, процент и время гибели отдельных особей. По окончании курса терапии выживших крыс (по 12-14 особей в группе) подвергали инструментальному обследованию, завершавшемуся эвтаназией (производившуюся методом декапитации) и вскрытием. Биологический материал, полученный при вскрытии животных, использовали для определения коэффициентов массы внутренних органов, образцы ткани печени - для гистоморфологического исследования. Для оценки гепатотоксичности ТХМ и гепато-топротекторного действия НДЦ использовали показатели, характеризующие функциональное состояние печени, эффективность механизмов антиоксидантной и антиперекисной защиты и морфологическую картину органа-мишени.
Сравнительные биохимические исследования выполняли на полученных при обследовании образцах крови подопытных и контрольных крыс. В сыворотке крови на автоматическом биохимическом анализаторе «ChemWell 2910» («Combi», США) с использованием наборов «Диакон-ДС» и «Вектор-Бест» (Россия) определяли активность аланиновой трансаминазы (АЛТ), аспарагиновой транс-аминазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), у-глутамилтрансферазы (ГГТ), лактатдегидро-геназы (ЛДГ), холинэстеразы (ХЭ), содержание общего билирубина, холестерина, триглицери-дов, общего белка, альбумина, глюкозы, креати-нина, мочевины. Одновременно плазму крови, стабилизированной цитратом натрия, использовали для проведения коагулографии на автоматическом 4-канальном коагулометре «TS-4000» («HTI», США). При этом регистрировали показатели: активированное частичное тромбо-пластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ), уровень фибриногена. Антиоксидантный статус оценивали путём количественного определения восстановленного глутатиона (Г-SH) и
1п
С
V12
О4 С" 0,5-
0^ 300 400 500 600 Л, nm 700
Рис. 1. УФ-спектр поглощения образца (V12) золя наночастиц диоксида церия.
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Таблица 1
Масса тела и смертность крыс после отравления тетрахлорметаном и недельного курса терапии карсилом или наночастицами диоксида церия
Группа животных
Показатель TXM + карсил TXM + НДЦ Контроль
TXM доза испытуемых средств
100 мг/кг 2,0 мг/кг 0,2 мг/кг 0,02 мг/кг
Масса тела, г:
исходная i93,3 ± 4,3 i96,5 ± 3,7 i96,0 ± 4,4 i94,6 ± 4,9 i98,4 ± 4,4 i99,4 ± 5,1
конечная 176,5 ± 4,8* 192,4 ± 4,2** 173,2 ± 4,4* i85,4 ± 4,4 i83,9 ± 5,1 i95,7 ± 4,7
снижение, % от контроля 9,8 1,7 11,5 5,3 6,0
Смертность (погибшие крысы) i 3 2 i i 0
Примечание. Здесь и табл. 2: * - достоверные отличия от контроля; ** - от группы сравнения (ТХМ).
активности каталазы в крови, антиокислительной активности сыворотки (АОА) и содержания в ней конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА).
Для патоморфологического исследования образцы ткани печени фиксировали при 4°С в 4% растворе параформальдегида («Sigma», США), приготовленного на 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,4 («Sigma», США). Спустя 1-3 сут образцы обезвоживали в батарее спиртов восходящей крепости, просветляли в хлороформе с использованием гистопроцессора Cytadel 2000 («Shendon», Великобритания) и заключали в парафиновую среду Histomix («Биовитрум», Россия). Парафиновые блоки разрезали на ротационном микротоме HM340E («MICROM International GmbH», Германия). Полученные срезы толщиной 4-5 мкм помещали на предметные стекла и окрашивали гематоксилин-эозин-флоксином по общепринятой методике. Степень повреждения печеночной ткани оценивали по шкале METAVIR. Препараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа «AxioScopeAl» («Zeiss», Германия), оборудованного цифровой камерой «AxioCamMRc5». Фотографии обрабатывали с помощью программы ZENpro 2012 («Zeiss», Германия).
Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы анализа данных Statistica 10 RU с учётом эмпирического распределения сравниваемых параметров. К градированным признакам с непрерывным распределением применяли однофакторный дисперсион-
ный анализ (Опе^ау ANOVA), используя для оценки значимости выявленных в опыте изменений адекватные апостериорные критерии.
Результаты и обсуждение
Наблюдение за общим состоянием и внешним видом животных показало, что ухудшение их самочувствия (снижение мышечного тонуса и двигательной активности) происходит через 3-4 часа после отравления. Гибель части крыс (5-15%) наступала в течение первых 2-3 сут. Статистически значимые различия по летальному эффекту между опытными группами отсутствовали. При инструментальном обследовании к 7-м суткам после введения ТХМ у крыс, не получавших терапии (группа сравнения), обнаружено достоверное снижение массы тела (на 10 %, табл. 1). При этом коэффициенты массы внутренних органов существенных изменений не претерпевали.
Спектр изменений биохимических маркёров печёночной патологии у животных из группы сравнения включал согласованное повышение активности ГГТ и билирубина (на 31 и 12% соответственно), указывавшее на развитие хо-лестаза, и умеренную (на 28%) ферментемию АСТ, которая, в отсутствие повышения АЛТ, могла определяться не столько цитолизом, сколько адаптивным изменением регуляции биоэнергетических механизмов (табл. 2).
Свидетельств гепатодепрессии не выявлено как биохимически, так и по показателям коа-гулограммы, более того, содержание общего
to to
о
'i
u 0) p
5I И
l| о №
a-
Is
5|
So
J а
^ ri Q) О
Го, с о
3£
OS'S
m1»
I?
си 2 ° 2 ® Si
Q) 0)
bS
Таблица 2 Результаты обследования крыс самцов через 7 суток после острого перорального воздействия тетрахлорметаиа и курсовой терапии карсилом или нанодиоксидом церия
Показатель Группа животных Контроль
ТХМ ТХМ + карсил ТХМ + НДЦ
доза лекарственных средств
100 мг/кг 2,0 мг/кг 0,2 мг/кг 0,02 мг/кг
Основные биохимические показатели
ACT, Е/л 243,4 ± 17,5* 220,5 ± 10,5 251,5 ± 21,2* 227,5 ± 9,2 250,8 ± 15,6* 189,6 ± 10,0
АЛТ, Е/л 106,7 ± 6,8 109,0 ±9,1 104,3 ± 8,4 94,4 ± 8,3 90,6 ±6,1 89,6 ± 3,7
ЛДГ, Е/л 894,0 ± 77,7 949,4 ± 72,3 924,0 ± 77,9 947,5 ± 66,9 790,4 ± 74,4 770,7 ± 76,4
ЩФ, Е/л 197,1 ±9,8 215,9 ± 13,8 180,5 ± 10,8 209,0 ± 10,3 212,4 ±8,7 196,9 ± 10,7
ГГТ, Е/л 19,27 ± 1,03* 16,69 ± 1,26 20,56 ± 1,19* 19,32 ± 1,21* 19,30 ± 1,09* 14,76 ± 0,97
Билирубин общий, мкмоль/л 16,74 ± 0,37* 16,02 ±0,61 16,91 ± 0,47* 16,03 ± 0,42 16,01 ±0,28 14,97 ± 0,46
Холестерин, ммоль/л 1,867 ±0,120 1,929 ±0,104 2,002 ± 0,096 1,811 ±0,089 1,940 ± 0,090 1,839 ±0,084
Триглицериды, ммоль/л 0,711 ±0,035 0,675 ± 0,022 0,734 ± 0,043 0,655 ± 0,023 0,618 ±0,036 0,686 ± 0,026
Глюкоза, ммоль/л 4,393 ±0,176 4,603 ± 0,346 4,886 ±0,170 5,120 ±0,349 5,304 ±0,344 4,926 ±0,110
Альбумин, г/л 39,13 ±0,54 37,77 ±0,33 38,86 ±0,32 38,45 ±0,41 37,92 ± 0,29 38,77 ±0,36
Общий белок, г/л 73,60 ± 0,78* 71,17 ±0,93** 73,70 ± 1,06* 70,86 ±0,54** 71,47 ±0,79 70,96 ± 0,65
ХЭ, Е/л 172,7 ± 17,0 174,9 ± 14,4 187,6 ±28,1 187,9 ±21,9 189,8 ±21,1 188,1 ±30,8
Мочевина, ммоль/л 7,375 ± 0,336* 5,808±0,405** 7,193 ± 0,327* 6,005 ± 0,577** 6,411 ±0,565 5,827 ±0,281
Креатинин, мкмоль/л 38,15 ± 1,89* 36,90 ± 1,32 40,50 ± 1,47* 36,22 ± 1,44 36,26 ±2,13 32,67 ± 1,27
Биохимические показатели состояния антиперекисной защиты
Г-SH, мкмоль/л 0,860 ± 0,026 0,897 ±0,035 0,968 ± 0,032 0,915 ±0,043 0,894 ± 0,028 0,912 ±0,037
Каталаза, Е/л 30,42 ± 0,60* 31,88 ± 0,71* 31,54 ± 0,57* 31,53 ± 0,59* 31,50 ± 0,59* 34,59 ± 0,63
МДА, мкмоль/л 9,31 ±0,17* 9,07 ± 0,22 9,38 ±0,23* 8,61 ±0,23 8,38 ±0,15 8,32 ±0,38
АОА, мкмоль МДА/л 2,962 ± 0,094 3,389 ± 0,126* 3,301 ± 0,117* 2,783 ± 0,092 2,759 ± 0,089 2,775 ±0,146
Показатели коагулограммы
АЧТВ, с 19,25 ± 0,65 18,72 ±0,50 18,56 ±0,61 18,91 ±0,60 18,59 ±0,36 20,54 ± 0,66
Фибриноген, г/л 1,50 ±0,03 1,45 ± 0,04 1,59 ±0,06 1,46 ± 0,05 1,48 ± 0,05 1,41 ±0,03
ТВ, с 36,15 ±0,69 36,58 ± 1,13 37,44 ± 1,01 36,14 ± 1,74 37,72 ± 1,26 35,33 ±0,72
у
x г
X
0
1
к t:
К »
ЬО
о
KJ
о ьо
JO
ьо
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Рис. 2. Ткань печени контрольной крысы, обычное гистологическое строение.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином. Общее увеличение х200.
белка претерпевало даже небольшой (на 4%) адаптивный рост. Зарегистрированное повышение мочевины и креатинина (в 1,27 и 1,17 раза соответственно) свидетельствовало в пользу нарушения функции почек (см. табл. 2).
Установленные метаболические сдвиги наблюдались на фоне усиления ПОЛ, проявлявшегося достоверным ростом (на 12 %) конечного продукта - МДА - в сыворотке крови. Одновременное снижение активности каталазы подтверждало функциональную недостаточность системы антиперекисной защиты, однако очевидно, что обнаруженные нарушения не являлись критичными и не сопровождались падением восстановленного глутатиона и АОА (см. табл. 2).
Патоморфологическое исследование показало, что через 7 сут после введения ТХМ в ткани печени подопытных животных сохранялись признаки воздействия токсиканта, отсутствующие у контрольных крыс (рис. 2): дискомплек-сация печёночных балок в перипортальнах зонах (рис. 3), единичные фокальные некрозы, а также наличие воспалительных инфильтратов (рис. 4).
Оценивая спектр и глубину метаболических сдвигов и морфогистологических изменений, обнаруженных у интоксицированных ТХМ животных, необходимо указать, что наиболее выраженные проявления цитолиза, холестаза, гепатодепрессии и тяжёлая структурная пато-
Рис. 3 Ткань печени крысы после введения ТХМ в дозе 4,5 мл/кг. Дискомплексация печеночных балок.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином.
Общее увеличение х200.
логия печени обычно регистрируются у крыс в течение первых трёх суток [9, 28]. Важно отметить, что предусмотренный алгоритмом эксперимента срок тестирования (1 нед с момента острого отравления) был изначально нацелен, с одной стороны, на обеспечение достаточного для фармакологической коррекции «терапевтического окна», с другой - на обнаружение всё ещё сохраняющихся и очевидных последствий отравления ТХМ. Характеризуя особенности выбранного срока тестирования, следует отметить свойственную биообъекту высокую ско-
Рис. 4. Ткань печени крысы после введения ТХМ в дозе 4,5 мл/кг. Скопление лимфоидных элементов на месте повреждения ткани печени.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином. Общее увеличение х200.
243
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Рис. 5. Ткань печени крысы после введения ТХМ и лечения карсилом. Дискомплексация печеночных балок и наличие воспалительных инфильтратов в перипортальной зоне.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином. Общее увеличение х200.
рость обменных процессов вообще и регенерации печени в частности. Очевидно, что в ответ на токсическое воздействие быстро активируется адаптационный процесс, в ходе которого эффекты повреждения и регенерации формируют качественно новое гомеостатическое состояние, необходимое для сохранения жизненно важных функций организма. Поэтому не удивительно, что спустя 1 нед после отравления ТХМ, повлекшего за собой частичную гибель животных, у выживших крыс не обнаружено тех грубых патологических изменений, какими изобилуют многие источники информации [29, 30].
Тем не менее, установленные на фоне сниженной массы тела и морфоструктурных нарушений печени значимые отклонения по половине исследованных показателей, несомненно, свидетельствовали о сохранении к седьмым суткам после отравления ТХМ гепатотоксиче-ского эффекта, требующего коррекции. Очевидно, что на данной стадии патологического процесса именно сужение спектра установленных биохимических изменений при ускорении нормализации морфогистологической картины печени могло служить критерием эффективности терапевтического применения НДЦ в сравнении с успешно применяемым в клинике гепато-протектором карсилом. 244
Как и ожидалось, лечение карсилом сопровождалось определённым положительным эффектом. Так, у интоксицированных крыс, получавших карсил, через 1 нед после отравления масса тела соответствовала норме (см. табл. 1). При этом тестирование обнаружило у них лишь два значимых биохимических сдвига (у нелеченых животных - восемь), затрагивающих исключительно антиоксидантный статус -снижение активности каталазы (на 8 %) и адаптивное повышение АОА (в 1,2 раза) (см. табл. 2). Установленные по трём показателям (масса тела, содержание мочевины и общего белка) достоверные изменения по сравнению с крысами, не получавшими терапии (см. табл. 1, 2), безусловно позволяют констатировать наличие у карсила в условиях избранной схемы лечения терапевтического метаболического действия. Однако, в отличие от биохимического статуса, на выраженность остаточных морфологических нарушений ткани печени лечение карсилом практически не влияло. После курса терапии гепатопротектором у подопытных крыс, как и в группе сравнения, отмечалось нарушение гистоархитектоники печёночных балок в перипортальных зонах, скопление моноцитов и фокальные некрозы. В перипортальных и цен-тролобулярных зонах печёночной дольки регистрировались многочисленные гистиоциты, содержащие пигмент в цитоплазме (рис. 5).
Экспериментальная оценка гепатопротек-торного действия испытуемого золя НЦД выявила явную зависимость защитного эффекта от ежедневно получаемой дозы препарата. Анализ цифрового материала, представленного в табл. 1 и 2, свидетельствует о том, что введение НДЦ в высшей дозе (2,0 мг/кг) не сопровождалось значимым лечебным действием, на что указывало сохранение практически всех негативных последствий применения ТХМ (включая снижение массы тела) спустя 1 нед терапии. Вместе с тем, антиоксидантная активность наночастиц в указанной дозе всё же проявлялась достоверным повышением АОА (на 19%), как и при лечении карсилом (см. табл. 2). Кроме того, морфологические изменения печёночной ткани в группе, получавшей НДЦ в дозе 2,0 мг/кг, были менее выраженными, чем у крыс без лечения или лечен-
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Рис. 6. Ткань печени крысы после введения ТХМ
и лечения НДЦ в дозе 2,0 мг/кг Присутствие пигментированных гистиоцитов.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином. Общее увеличение *400.
ных карсилом, и ограничивались скоплением пигментированных гистиоцитов в поврежденных областях органа (рис. 6).
Пошаговое десятикратное снижение уровня воздействия НДЦ было более успешным, убедительно продемонстрировав сравнимое с эталонным гепатопротектором терапевтическое действие, позволившее к седьмым суткам после отравления частично скорректировать массу тела и нивелировать большинство установленных метаболических сдвигов (см. табл. 1, 2). Более того, на органном уровне лечение НДЦ в дозах 0,2 мг/кг и 0,02 мг/кг оказалось эффективнее, чем терапия карсилом, обеспечив полную нормализацию гистоморфологи-ческой картины печени интоксицированных ТХМ крыс (рис. 7). Несмотря на то, что существенных различий между средней (0,2 мг/кг) и низшей (0,02 мг/кг) дозами препарата не выявлено, наиболее действенной признана средняя. Основанием для этого послужило не только максимальное приближение метаболического статуса леченых крыс к уровню, характерному для интактных, но и наличие (в отличие от низшей дозы) достоверных позитивных сдвигов по сравнению с группой отравленных и нелеченых животных (см. табл. 2).
Выявленная зависимость служит подтверждением имеющихся представлений о проявле-
Рис. 7. Ткань печени крысы после введения ТХМ и лечения НДЦ в дозе 0,02 мг/кг Обычное гистологическое строение.
Окраска гематоксилин-эозин-флоксином. Общее увеличение х200.
нии антиоксидантной активности наночастиц в области доз, значительно ниже токсических [4, 14-16]. Принимая во внимание признание высшего из использованных уровней воздействия НДЦ (2,0 мг/кг) «пороговым», по результатам субхронического токсикологического эксперимента [27], можно предположить, что, несмотря на существенно меньшую продолжительность его лечебного применения, суммарная доза препарата всё же превысила оптимальную терапевтическую. В противоположность этому, более низкие уровни (0,2 мг/кг и 0,02 мг/кг) индуцировали отчётливый гепатопротекторный эффект. С учётом вышеизложенного очевидно, что курсовое применение биосовместимого золя НДЦ в низких дозах способствует ускоренному восстановлению метаболизма и гистоструктуры печени при модельном токсическом гепатите.
Заключение
Интерес учёных к разработке новых подходов к патогенетической терапии заболеваний печени вообще и её экзотоксических повреждений в частности никогда не ослабевал и заставляет продолжать поиски «идеального гепатопротектора» и в настоящее время. Однако, несмотря на огромный массив научных публикаций, посвященных скринингу,
245
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
экспериментальным разработкам и доклиническим испытаниям природных и синтетических гепатопротекторов, только немногие из них доходят до «больничной койки» [2]. В последние годы очевидные успехи нанотехнологий и развитие их биомедицинских приложений всё настойчивее побуждают направить вектор поисковой активности на наноматериалы, обладающие свойствами антиоксидантов.
Нанодиоксид церия является одним из наиболее ярких представителей группы «нано-антиоксидантов» [15, 16]. На протяжении последних 10 лет одним из многих тщательно изучавшихся аспектов его биологической активности являлась гепатопротекторная. В условиях эксперимента доказана способность НДЦ оказывать благотворное влияние на течение и исход ряда хронических заболеваний печени (фиброза, цирроза и их осложнений) [18-25]. В настоящем исследовании проведена оценка гепатопротекторного потенциала нанодиоксида церия на тетрахлорметановой модели острого токсического поражения печени. Установлено, что несмотря на относительную узость временного «терапевтического окна» (7-дневный курс лечебного применения), НДЦ в суточных дозах 0,2 и 0,02 мг/кг внутрижелудочно способствовал ускоренному восстановлению гистоархи-тектоники печени, стабилизации массы тела, купированию большинства метаболических сдвигов и снижению ПОЛ. Несмотря на то, что коррекция модельных проявлений острой гепа-тотоксичности не была полной, терапевтическая эффективность наноантиоксиданта в дозе 0,2 мг/кг была сопоставима с таковой эталонного гепатопротектора карсила при перораль-ном введении его аналогичным курсом в дозе 100 мг/кг: по корректирующему влиянию на метаболизм НДЦ несколько уступал карсилу, однако превосходил его по способности ускорять регенерацию печени.
Авторы выражают надежду, что представленные в публикации материалы смогут составить основу для дальнейших разработок в области экспериментальной терапии заболеваний печени с применением «наноантиоксидантов».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
(пп. 2, 10, 11, 15-25 см. в REFERENCES)
1. Орлов Ю.В., Синячкин Д.А., Халимов Ю.Ш., Антуше-вич А.Е. Современное состояние проблемы лечения токсических гепатитов и фиброзов печени. Medline. ru. Гепатология. Доступ: http://www.medline.ru/public/ pdf/18_033.pdf (дата обращения 17.10.2019).
3. Променашева Т.Е., Колесниченко Л.С., Козлова Н.М. Роль оксидативного стресса и системы глутатиона в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени. Бюллетень ВСМЦ СО РАМН. 2014; 5(99): 80-3.
4. Мышкин В.А. и др. Экспериментальная оценка производных пиримидина на моделях токсического поражения печени: обзор. Медицинские науки. 2016; 3: 88-98.
5. Звягинцева Т.Д., Чернобай А.И. Токсические поражения печени: современные представления и патогенетическая коррекция. Мед. газета «Здоровье Украины». 2017; 3: 1-7.
6. Балукова Е.В., Успенский Ю.П., Фоминых Ю.А. Поражения печени различного генеза (токсического, лекарственного, дисметаболического): от этиологической гетерогенности к единой унифицированной терапии пациентов. РМЖ «Медицинское обозрение». 2018; 1(1): 35-40.
7. Ткач С.М. Эффективность и безопасность гепатопро-текторов с точки зрения доказательной медицины. Мед. газета «Здоровье Украины». 2009; 6: 7-9.
8. Минушкин О. Н. Гепатопротекторы в лечении некоторых заболеваний печени Медицинский совет. 2016; 14: 52-7.
9. Карпова Е.А., Щукина О.Г., Бенеманский В.В., Ильина О.П. Патоморфологическая оценка биологического действия препарата наноселена при токсическом поражении печени. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013; 5(93): 141-5.
12. Щербаков А.Б. и др. Синтез и биомедицинские применения нанодисперсного диоксида церия. Томск: Изд. Дом Томского государственного университета; 2016.
13. Иванов В.К., Иванова О.С., Баранчиков А.Е., Третьяков Ю.Д. Нанокристаллический диоксид церия -компонент эффективных антиоксидантных препаратов. Доступ: http://www.igic.ras.ru/docs/patent/ placatZionh-3.pdf (дата обращения 13.06.2019).
14. Попов А.Л. Исследование биологической активности цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия (СеО2). Дисс. ... канд. биол. наук. М., 2017.
26. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К; 2012.
27. Точилкина Л.П. и др. Субхроническая токсичность наночастиц диоксида церия. Токсикологический вестник. 2016; 6: 54-62.
28. Музалевская Е. Н. Экспериментальное обоснование применения семян амаранта для коррекции осложнений, вызываемых изоцианидом. Дисс....канд. фарм. наук. Воронеж, 2015.
29. Чехани Н. Р. и др. Гепатопротекторное действие нового сбора из растительного сырья в сравнении с препаратом «карсил» (экспериментальное исследование). Бутлеровские сообщения. 2014; 38(4): 63-6.
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
30. Белоусов М.В. и др. Исследование гепатозащитных свойств нативных гуминовых кислот низинного торфа Томской области. Химико-фармацевтический журнал. 2014; 48(4): 28-31.
REFERENCES
1. Orlov Yu.V., Sinyachkin D.A., Khalimov Yu.Sh., Antu-shevich A.E. Current status of the treatment of toxic hepatitis and liver fibrosis. Medline.ru. Gepatologiya. URL: http://www.medline.ru/public/pdf/18_033.pdf (application date 17.10.2019) (in Russian)
2. Weiskirchen R. Hepatoprotective and Anti-fibrotic Agents: It's Time to Take the Next Step. Review article. Frontiers in Pharmacology. 2016. DOI: org/10.3389/ fphar.2015.00303
3. Promenasheva T.E., Kolesnichenko L.S., Kozlova N.M. The role of oxidative stress and glutathione system in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease Bjul-leten'VSMCSORAMN. 2014; 5(99): 80-3. (in Russian)
4. Myshkin V.A. i dr. Experimental evaluation of pyrimi-dine derivatives in models of toxic liver damage: a review. Medicinskie nauki. 2016; 3: 88-98. (in Russian)
5. Zvjaginceva T.D., Chernobaj A.I. Toxic lesions of the liver: current understanding and pathogenetic correction. Med. gazeta «Zdorov'e Ukrainy». 2017; 3:1-7 .
6. Balukova E.V., Uspenskij Ju.P., Fominyh Ju.A. Liver lesions of various origins (toxic, drug, dysmetabolic): from etiological heterogeneity to a single unified treatment of patients. RMZh «Medicinskoe obozrenie». 2018; 1(1): 35-40. (in Russian)
7. Tkach S.M. The effectiveness and safety of hepatopro-tectors in terms of evidence-based medicine. Med. gazeta «Zdorov'e Ukrainy». 2009; 6:7-9 .
8. Minushkin O.N. Hepatoprotectors in the treatment of certain liver diseases. Meditsinskiy sovet. 2016; 14: 527. (in Russian)
9. Karpova E.A., Shchukina O.G., Benemanskiy VV, Il'ina O.P. Pathomorphological assessment of the biological effect of the drug applied in toxic liver damage. Byulleten' VSNTs SO RAMN. 2013; 5(93): 141-5. (in Russian)
10. Ghosh S., Gomes A. Hepatoprotective Efficacy of Gold Nanoparticle Synthesized by Green Method Using Trigo-nella Foenum-Graecum Seed Extract. Translational Medicine. 2016; 6(4): 5. DOI: 10.4172/2161-1025.1000190
11. Amin K.A., Hashem K.S., Alshehri F.S. et al. Anti-oxidant and Hepatoprotective Efficiency of Selenium Nanoparticles Against Acetaminophen-Induced Hepatic Damage. Biol. Trace Elem. Res. 2017; 175: 136.
12. Shcherbakov A.B. et.al. Synthesis and biomedical applications of nanodispersed cerium dioxide [Sintez i biomedicinskie primenenija nanodispersnogo dioksida cerija]. Tomsk: Izd. Dom Tomskogo gosudarstvennogo universiteta; 2016. (in Russian)
13. Ivanov VK., Ivanova O.S., Baranchikov A.E., Tret'yakov Yu.D. Nanocrystalline cerium dioxide - a component of effective antioxidant drugs. URL: http://www.igic. ras.ru/docs/patent/placat/ionh-3.pdf (application date 13.06.2019) (in Russian)
14. Popov A.L. Study of the biological activity of citrate-stabilized cerium dioxide (CeO2) nanoparticles. Diss. ... kand. biol. nauk. Moscow, 2017. (in Russian)
15. Nelson B.C. et al. Antioxidant Cerium Oxide Nanopar-ticles in Biology and Medicine: Review. Antioxidants. 2016; 5 (15). DOI: 10.3390/antiox5020015
16. Rzigalinski B.A., Carfagna C.S., Ehrich M. Cerium Oxide Nanoparticles in Neuroprotection and Considerations for Efficacy and Safety. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnoogy. 2017; 9 (4). DOI: 10.1002/wnan.1444
17. Changyan Li. et al. Hot Topics and Challenges of Regenerative Nanoceria in Application of Antioxidant Therapy: Review Article. Journal of Nanomaterials. 2018; Article ID 4857461.
18. Oro D. et al. Hepatoprotective Effect of CeO2 Nanoparticles in Rats Treated with CCl4 Journal ofHepatology. 2014; 60: 77.
19. Oro D. et al. Cerium oxide nanoparticles reduce steatosis, portal hypertension and display antiinflammatory properties in rats with liver fibrosis. Journal of Hepatol-ogy. 2016; 64 (3): 691-8.
20. Povedano W.J., Puntes VF. Cerium oxide nanoparticles as a new therapeutic tool for tissue regeneration in liver. Regeration and Transplantation of Organs and Tissues. 18th SYMPOSIUM. Fundacio La Marato de TV3. URL: http://statics. ccma.cat/webs/tv3/marato/simposiums/marato2017/me-moria/Eng/DrJimenez.pdf (application date 14.09.2019).
21. Surendran P.S. et al. Nanoparticles for the treatment of liver fibrosis. International Journal of Nanomedicine. 2017; 12: 6997-7006.
22. Ibrahim H.G. et al. Cerium oxide nanoparticles: In pursuit of liver protection against doxorubicin-induced injury in rats. BiomedPharmacother. 2018; 103: 773-81.
23. Carvajal S. et al. Cerium oxide nanoparticles display anti-lipogenic effect in rats with non-alcoholic fatty liver disease. Scientific Reports. 2019; 9, Article number: 12848.
24. Ribera J. et al. Functionalized cerium oxide nanoparticles mitigate the oxidative stress and pro-inflammatory activity associated to the portal vein endothelium of cirrhotic. PLoS ONE. 2019; 14 (6): e0218716.
25. Adebayo O.A., Akinloye O., Adaramoye O.A. Cerium Oxide Nanoparticles Attenuate Oxidative Stress and Inflammation in the Liver of Diethylnitrosamine-Treated Mice. Biol. Trace. Elem. Res. 2019; Apr 16. DOI: org/10.1007/s12011-019-01696-5
26. Guidelines for preclinical studies of drugs. Part one [Ru-kovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. Chast' pervaja]. Pod red. A.N. Mironova. Moscow: Grif i K; 2012. (in Russian)
27. Tochilkina L.P. et al.. Subchronic toxicity of cerium dioxide nanoparticles. Toksikologicheskiy vestnik. 2016; 6: 54-62 (in Russian).
28. Muzalevskaya E.N. Experimental rationale for the use of amaranth seeds for the correction of complications caused by isocyanide. Diss....kand. farm. nauk. Voronezh; 2015 (in Russian).
29. Chehani N.R. et al.. Hepatoprotective effect of a new collection of plant materials in comparison with the drug «Karsil» (experimental study). Butlerovskie soobshheni-ja. 2014; 38(4): 63-6. (in Russian)
30. Belousov M.V. i dr. Study of hepatoprotective properties of native humic acids of lowland peat of the Tomsk region. Himiko-farmacevticheskij zhurnal. 2014; 48(4): 28-31. (in Russian).
Поступила 20 ноября 2019 Принята в печать 22 июня 2020
