CC BY
20
Серия «Биология. Экология»
2020. Т. 31. С. 3-18 Онлайн-доступ к журналу: http://izvestiabio.isu.ru/ru
И З В Е С Т И Я Иркутского государственного университета
УДК 579.61:616-078+575.112
DOI https://doi.Org/10.26516/2073-3372.2020.31.3
Структуры CRISPR/Cas-системы в геноме штамма Staphylococcus aureus ST228 и фаговых рас, детектируемых методами биоинформатики
А. Ю. Борисенко1, Ю. П. Джиоев1, Л. А. Степаненко1, Ю. М. Землянская1, Н. П. Перетолчина1, Н. А. Арефьева2,
2 3 1 1 1
Ю. С. Букин ' , Е. Б. Ракова ' Л. А. Кокорина , Я. А. Портная ,
2 2 2 4
О. Ф. Вятчина , А. С. Мартынова , Л. А. Францева , В. В. Васильев , Г. А. Тетерина2, В. П. Саловарова2, Е. В. Симонова1, В. И. Злобин1
'Иркутский государственный медицинский университет, г. Иркутск, Россия 2Иркутский государственный университет, г. Иркутск, Россия 3Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск, Россия
4Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора,
г. Иркутск, Россия
E-mail: 89500720225@mail.ru
Аннотация. Рассматривается разработка перспективной стратегии использования бактериофагов в борьбе с опасными патогенными «супербактериями» из группы ESKAPE, в частности Staphylococcus aureus. В качестве нового подхода в поиске таргетных (штам-моспецифичных) бактериофагов предлагается их скрининг через структуры CRISPR/Cas-систем бактерий с использованием разработанного алгоритма из поисковых программных методов биоинформатики. С его помощью исследована структура CRISPR/Cas-системы в геноме штамма S. aureus ST228. Разработанный программный алгоритм поиска локусов CRISPR/Cas-систем позволяет определять степень устойчивости бактерий к специфичным бактериофагам, что должно обеспечить эффективность таргетной фаговой терапии инфекций, вызываемых «супербактериями».
Ключевые слова: геном штамма Staphylococcus aureus ST228, программные методы биоинформатики, CRISPR/Cas-система, спейсеры, повторы, протоспейсеры, бактериофаги.
Для цитирования: Структуры CRISPR/Cas-системы в геноме штамма Staphylococcus aureus ST228 и фаговых рас, детектируемых методами биоинформатики / А. Ю. Борисенко, Ю. П. Джиоев, Л. А. Степаненко, Ю. М. Землянская, Н. П. Перетолчина, Н. А. Арефьева, Ю. С. Букин, Е. Б. Ракова, Л. А. Кокорина, Я. А. Портная, О. Ф. Вятчина, А. С. Мартынова, Л. А. Францева, В. В. Васильев, Г. А. Тетерина, В. П. Саловарова, Е. В. Симонова, В. И. Злобин // Известия Иркутского государственного университета. Серия Биология. Экология. 2020. Т. 31. С. 3-18. https://doi.Org/10.26516/2073-3372.2020.31.3
Введение
Частота использования, а нередко и злоупотребления антибиотиками за прошлые несколько десятилетий заметно возросли в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве [Проблема резистентности ... , 2017] и вызвали появ-
ление патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) ко многим современным антибактериальным препаратам [Землянко, Рогоза, Журавлева, 2018; Origin and proliferation ... , 2015]. Следствием этой практики стало возникновение «супербактерий» (superbugs), которые становятся ныне большой глобальной угрозой для общественного здравоохранения из-за развития инфекционных болезней с более тяжёлыми последствиями [Burki, 2018; Veeraraghavan, Walia, 2019]. С помощью специального исследования по определению наиболее устойчивых к используемым современным антибиотикам бактериальных патогенов была выделена группа «супербактерий», представленная следующими бактериальными патогенами: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Aci-netobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp. - группа ESKAPE (по первым буквам названий) [Rice, 2008; Emerging strategies ... , 2019]. Патогены этой группы ответственны за большинство внутрибольнич-ных инфекций и способны «избегать» биоцидного действия многих антимикробных агентов [Navidinia, 2016]. Установлено, что ESKAPE-бактерии связаны с самым высоким риском смертности [Founou, Founou, Essack, 2017]. S. aureus включён в эту группу с высоким приоритетом, что свидетельствует о его реальной опасности для здоровья человека и животных [Deurenberg, Stobberingh, 2008; High vancomycin minimum ... , 2013; Goldmann, Medina, 2018; de Jong, van Kessel, van Strijp, 2019]. S. aureus -«успешный» патоген, способный вызывать поражение практически любой ткани человеческого тела. Он может также вызвать множество инфекций, от целлюлита и поверхностных кожных заболеваний до абсцессов, бактериемии, сепсиса, эндокардита и пневмонии [Nasal carriage ... , 2001; Nasal carriage ... , 2012]. Сегодня штаммы S. aureus стали ведущей причиной внутри-больничных и внебольничных инфекций, их воздействия остаются одной из значимых проблем здравоохранения во всём мире [Goldmann, Medina, 2017; Revisiting bacterial ... , 2019]. Решение проблемы «супербактерий» делает актуальным поиск альтернативных методов борьбы с ними, среди которых большой интерес представляют подходы с использованием бактериофагов -терапевтических агентов, которые ранее широко использовались для лечения бактериальных инфекций, но со временем уступили первенство антибиотикам. После того, как резко возросла устойчивость микроорганизмов к противомикробным препаратам и возникли «супербактерии», интерес к фаговой терапии вновь возрождается [Domingo-Calap, Delgado-Martínez, 2018; The magistral phage, 2018].
За последние 20 лет, благодаря накопленным базам данных геномов бактерий и вирусов (бактериофагов), появилась возможность проводить аналитические исследования с этими данными, используя методы биоинформатики. Посредством биоинформационных компьютерных программ уже можно проводить моделирование процессов эволюции, изменчивости, патогенности, устойчивости и адаптации бактерий и вирусов к условиям существования. Резкий рост интереса к моделированию и редактированию геномов бактерий и вирусов возник после открытия механизма действия
CRISPR/Cas-систем бактерий и архей против бактериофагов и плазмид. CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins, или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами с CRISPR-ассоциированными белками) является самой древней системой «адаптивного иммунитета» у бактерий и архей [Bhaya, Davison, Barrangou, 2011; Gasiunas, Sinkunas, Siksnys, 2014]. Эта система позволяет интегрировать в определённые области генома бактерий ДНК-фрагменты бактериофагов и плазмид (спейсеры), что придаёт в последующем бактериям устойчивость к данным фагам и плазмидам при повторном заражении [Multiple mechanisms ... , 2015]. Можно предположить, что использование структурных особенностей CRISPR/Cas-систем и программных методов биоинформатики позволит проводить скрининговые исследования по выявлению фагов, специфичных для каждого штамма бактерий по типу и степени их антагонизма.
Целью настоящего исследования является демонстрация разработанного на основе методов биоинформатики программного алгоритма для поиска локусов структур CRISPR/Cas-систем в геноме метицилин-резистентного штамма S. aureus ST228 из базы данных GenBank и оценка возможностей идентификации фаговых рас через спейсерные последовательности выявленной CRISPR-кассеты.
Материалы и методы
Материалом для исследования являлся геном штамма S. aureus ST228 (№ в базе данных GenBank: NC_020537). Исследуемый штамм выделен в 2008 г. от больных в госпитале г. Лозанны (Швейцария). Он является эпидемическим клоном метицилин-резистентного штамма S. aureus (ST228-MRSA-I) и распространён в нескольких странах Центральной Европы, включая Германию, Италию, Венгрию, Словению, Австрию и Швейцарию. В течение 2008 г. наблюдалось необычное распространение этого штамма в больницах Швейцарии, от которого заболели более пятисот пациентов [Short term evolution ... , 2012]. Для поиска локуса CRISPR/Cas-системы применяли методы программного моделирования MacSyFinder, v. 1.0 [MacSyFinder ... , 2014]. Поиск точной гомологии последовательностей проводили при помощи установленных вспомогательных пакетов makeblastdb (v.2.2.28) и HMMER (v.3.0), а также определяли структурно-функциональные характеристики обнаруженных cas-генов в анализируемом геноме штамма S. aureus [CRISPR Target., 2013; Grissa, Vergnaud, Pourcel, 2007]. Расшифровку структур CRISPR-кассеты производили при помощи алгоритмов поиска, включающих следующие программы: CRISPR Recognition Tool (http://www.room220.com/crt/); CRISPI: a CRISPR Interactive database (http://crispi.genouest.org) [CRISPI: a ... , 2009]; CRISPRFinder (http://crispr.u-psud.fr/Server); CRISPRDetect (http://brownlabtools.otago.ac.nz/ CRISPRDetect/ predict_crispr_array.html). Для идентификации фагов через расшифрованные спейсерные последовательности с помощью алгоритма поиска BLASTn по базе данных GenBank-Phage были использованы онлайн-приложения CRIS-
PRTarget (http://bioanalysis. otago.ac.nz/ CRISPRTarget/crispr_analysis.html) и Mycobacteriophage Database (http://phagesdb. org/blast/).
Результаты и обсуждение
В результате биоинформационного поиска в геноме штамма S. aureus ST228 была выявлена одна структура CRISPR/Cas-системы, отнесённая к III-A типу. Были обнаружены и визуализированы гены, кодирующие Сas-белки и полностью совпадающие с определённым III-A типом CRISPR/Cas-системы (табл. 1). CRISPR-кассета штамма S. aureus ST228 содержит меж-спейсерные повторы размером 35 н. о. (консенсусный повтор, рис. 1) и 11 последовательностей спейсеров (табл. 2). Выявленная CRISPR/Cas-система в геноме штамма S. aureus ST228 расположена приблизительно в позициях между 2 614000 и 2 636000 н. о., и размер её локуса равен 22 000 н. о. (рис. 2). Однако, как видно из рисунка, структуры cas-генов и CRISPR-кассеты разделены семью генами, относящимися, возможно, к неизвестным cas-генам. Такая конструкция CRISPR/Cas-системы может свидетельствовать о возможной роли этих генов в функциональной активности выявленной CRISPR-кассеты.
5 10 1 5 20 25 30 35
a :J 4
Рис. 1. Консенсусная структура повторов в геноме штамма S. aureus ST228
CAS-гены
gene
ii.ifc.om гшооо гио.ооо ¿езда» ¿(лда iéâom I zeaooo
gene gens CRISPR-кассета! f™ \
gene gene
CAS-гены
gene IldAgene gene
Рис. 2. Позиция и структуры cas-генов и CRISPR-кассеты в геноме исследуемого штамма S. aureus ST228
Выявленные семь сas-генов относились к следующим типам: casl-Type II, cas2-Type I-II-III, cas10-Type III-A, csm2-Type III-A, csm3-Type III-A, csm4-Type III-A, csm5-Type III-A (см. табл. 1). Как известно, CRISPR/Cas-системы III типа подразделяются на два подтипа: III-A и III-B. Для них характерно наличие белка Cas10 - самой крупной субъединицы эффекторного комплекса Csm (в случае подтипа III-A) и Cmr (в случае подтипа III-B). Кроме того, все системы III типа кодируют один белок Cas5 и, как правило, несколько паралогичных белков Cas7. Было показано, что система III-A работает как с ДНК, так и с РНК-мишенями и, соответственно, может разрушать как ДНК, так и РНК-структуры. Для успешного распознавания мише-
ней системе III-A не требуется наличие мотива РАМ. Дальнейшее изучение систем III типа обнаружило новые свойства субстратной специфичности подтипа III-A. Так, выяснилось, что система III-A S. epidermidis может работать только с транскрибирующимися протоспейсерами. Кроме того, оказалось, что комплексы Csm S. thermophilus и Thermus thermophilus имеют скрытую РНК-деградирующую активность, причём они вносят разрывы в РНК через каждые 6 нуклеотидов. Такая же активность была показана и для комплексов Cmr. Система III-A S. epidermidis не только разрушает синтезирующиеся транскрипты, но и разрезает ДНК-мишень зависимым от транскрипции образом за счёт специфических аминокислотных остатков Cas10, которые не связаны с распознаванием мишени. Гидролиз РНК, опосредуемый комплексами Csm и Cmr, катализируется не белком Cas10, а субъединицами Csm3 и Cmr4 соответственно [Sontheimer, Barrangou, 2015].
В ходе исследований также был проведён анализ разнообразия фаговых ассоциаций, выявленных через структуры спейсеров в CRISPR-кассете исследуемого штамма по эколого-географическим характеристикам и спектру их бактериальных хозяев (табл. 3). Как видно из таблицы, экологическое и географическое разнообразие выявленных фаговых рас и их бактериальных хозяев очень широко. Здесь представлен большой диапазон размеров геномов этих фагов (от 31 147 до 162 486 н. о.), отнесённых к девяти фаговым родам. Это также может свидетельствовать о том, что CRISPR/Cas-система штамма S. aureus ST228 функционально активна, что позволяет ему сохранять свой адаптивный потенциал. Представительство такого разнообразия фаговых ассоциаций может свидетельствовать и об экспрессионной активности спейсерных структур его CRISPR-кассеты. Так, в ряде работ было показано, что наличие в геноме бактерий функциональной CRISPR/Cas-системы потенциально мешает приобретению плазмид или фагов (про-фагов), несущих гены устойчивости к антибиотикам, тем самим поддерживая высокую чувствительность этих бактерий к антибактериальным препаратам [CRISPR-Cas influences ... , 2019]. Например, у бактерии S. epidermidis может наблюдаться снижение устойчивости к антибиотикам, обусловленное возможным уничтожением CRISPR-Cas-системой тех конъюгативных плазмид, которые обеспечивали эту устойчивость. Так, у S. aureus пониженное количество локусов CRISPR-Cas приводит к увеличению числа профагов, плазмид и мобильных генетических элементов в клетке, что усиливает вирулентность бактерии [Sontheimer, Barrangou, 2015]. Возможно, обладая этими свойствами, данный штамм, с одной стороны, потерял высокую устойчивость к антибиотическим агентам, а с другой - приобрёл высокую эпидемическую потенцию и вирулентные качества. Об этом может свидетельствовать его быстрое распространение в странах Центральной Европы. Являясь метицилин-резистентным клоном (ST228-MRSA-I) он также показал свой клинический потенциал, когда от него в больницах Швейцарии в течение 2008 г. тяжело заболели более 500 пациентов. Далее, возможно, вследствие антибиотикотерапии этот штамм и его варианты потеряли свою эпидемическую и патогенную мощь и стали циркулировать в ограниченной среде внутрибольничных инфекций [Short term evolution ... , 2012].
Структурно-функциональные характеристики cas-, csm-генов в геноме штамма S. aureus ST228
Sequence Id NC 020537 Рosition Profile Match Gene status System Рrotein length (aa) Score i-evalue Profile coverage Sequence coverage
prot ENN589125.1 1352 1352 cas1 TypeII accessory CAS-Type-IIU 310 245 8.1e-84 0.60 1.00
prot ENN589126.1 1353 1353 cas2 TypeI-II-III accessory CAS 104 87.9 1.1e-26 1.00 0.89
prot ENN589127.1 1354 1354 cas 10 TypeIIIA mandatory CAS-Type-IIIA 810 483 6.8e-206 1.00 0.78
prot ENN589128.1 1355 1355 csm2 TypeIIIA mandatory CAS-Type-IIIA 149 83.4 2.2e-28 1.00 0.69
prot ENN589129.1 1356 1356 csm3 TypeIIIA accessory CAS-Type-IIIA 209 253.1 3e-75 1.00 0.93
prot ENN589130.1 1357 1357 csm4 TypeIIIA mandatory CAS-Type-IIIA 260 162.1 2.5e-41 1.00 0.92
prot ENN589131.1 1358 1358 csm5 TypeIIIA mandatory CAS-Type-IIIA 311 40.8 1.2e-11 0.67 0.53
Примечание. Sequence Id - название белка в полногеномной последовательности, представленной в базах данных Gen Bank; Position - позиция исследуемого белка относительно других белков S. aureus Mu3; Profile Match - совпадение исследуемого белка с аминокислотным профилем cas-белков; Gene Status - статус гена; System -тип CRISPR/Cas-системы; Protein length - длина аминокислотной последовательности; Score - показатель совпадения профилей (hmmer); Profile coverage - процент перекрытия аминокислотных профилей cas-белков с исследуемой аминокислотной последовательностью; Sequence coverage - процент перекрытия исследуемой аминокислотной последовательности с аминокислотным профилем cas-белков.
Таблица 2
Структуры спейсеров в CRISPR-кассете штамма S. aureus ST228 и детектируемые ими бактериофаги
№ Спейсеры CRISPR-кассеты Комплементарные фаги. (родовой статус) № фага в GenBank
1 TCACTTATATGGATGGCTTAAAAGAACTTAAATCAATCTGTG Staphylococcus phage IME-SA4 (unclassified Biseptimavirus) NC_029025
2 CGCCGGGCCTACAGAGAAATTAAATCAGAAG Streptococcus phage M102 NC_012884
3 TAAGCAATTTTGGGACAAGGCTAAGAAGATACGTCCCG Bacillus phage TsarBomba NC 028890
4 TTTTTTAGTAGACTTGATTCAGTCAATCAGATA Staphylococcus phage Teaml NC 025417
5 AAAGCACAAGCGTTCTTTTGAAAAAACTTT Streptococcus phage A25 NC_028697
6 GAATGATTCATTCGTCCGGTGTAGATGAAAC Arthrobacter phage Wilde KU160673
7 AAAATGTAGTTTGGAGGGATGAGAGAGCGTGAT Streptococcus phage SMP NC 008721
8 GAACAGTTTGATTTACCTTATCGCTATATT Mycobacterium phage Nicholasp3 MF140422
9 GTTATGATGTTTGGCGATATGGGTCGTCGT Gordonia phage GMA3 NC 028668
10 TAGTGGTGTTGTCTGGTGGGATTAAACAA Streptomyces phage Samisti12 MF347639
11 ATGTGAGCCAAGGCAGAACAAGGGATCATGGCC Gordonia phage GMA7 NC 028673
Структура разнообразия фаговых рас, детектируемых через спейсеры CRISPR-кассеты штамма S. aureus ST228
№ Комплементарные виды фагов Родовая принадлежность фагов Размер генома фага (н. о.) Бактерия-хозяин Источник изоляции бактерий Страна
1 Staphylococcus phage IME-SA4 unclassified Biseptimavirus 41 843 Staphylococcus haemolyticus Сточная вода Китай
2 Streptococcus phage M102 unclassified Moineauvirus 31 147 Streptococcus mutans Зубной кариес Франция
3 Bacillus phage TsarBomba Tsarbombavirus 162 486 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Почва Россия
4 Staphylococcus phage Teaml Kayvirus 140 903 Staphylococcus xylosus SMQ121 Закваска Канада
5 Streptococcus phage A25 unclassified Siphoviridae 33 900 Streptococcus pyogenes K56 Коллекция Франция
6 Arthrobacter phage Wilde unclassified Tankvirus 68 203 Arthrobacter sp. ATCC 21022 Почва США
7 Streptococcus phage SMP unclassified Siphoviridae 36 019 Streptococcus suis capsular serotype 2 Мазки из носовых ходов свиней Китай
8 Mycobacterium phage Nicholasp3 unclassified Bronvirus 75 822 Mycobacterium smegmatis mc2 155 Почва США
9 Gordonia phage GMA3 Gordonia Virus GMA3 77 779 Gordonia malaquae BEN700 Сточные воды Австралия
10 Streptomyces phage Samisti12 Streptomyces virus Samisti12 133 710 Streptomyces griseus ATCC 10137 Почва США
11 Gordonia phage GMA7 Gordonia virus GMA7 73 419 Gordonia malaquae C0N60 Сточные воды Австралия
Таким образом, на основании полученных результатов выяснено, что разработанный программный алгоритм позволяет выявлять локусы CRISPR/Cas-систем в геномах бактерий, а также оценивать степень их устойчивости к чужеродным генетическим элементам (бактериофагам, плазмидам). Удалось выявить также структуры спейсеров в CRISPR-кассете исследуемого штамма и межспейсерные повторы. Используемые биоинформационные программы позволили выявить структуры и позиции cas- и csm-генов и установить тип CRISPR/cas-системы бактерии, который определён как III-A, а также идентифицировать фаги через спейсеры CRISPR-кассет исследуемого штамма S. aureus ST228. Дальнейший анализ фагов, идентичных спейсерным последовательностям CRISPR/Cas-системы, позволит оценить степень устойчивости данного штамма к выявленным специфичным фаговым расам. Полученная информация о количестве спейсеров и степени их идентичности протоспейсерам бактериофагов свидетельствует о существовании межвидовых генетических взаимодействий. Выявлено, что на анализируемый штамм S. aureus ST228 наибольшее генетическое влияние оказывали бактериофаги из родов бактерий Staphylococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Bacillus, Gordonia, Arthrobacter, Streptomyces (см. табл. 2). Ранее, также посредством использования поисковых методов биоинформатики, аналогичные результаты были получены в геномах других штаммов S. aureus [Использование биоинформационных ..., 2015; Биоинформационные алгоритмы ., 2016; Prospects to enhance ., 2018].
Заключение
Использованные в работе биоинформационные методы демонстрируют перспективные возможности для осуществления исследований структуры, функционирования и эволюции CRISPR/Cas-систем стафилококков и других бактерий. Уникальное строение CRISPR/Cas-системы S. aureus, продемонстрированное в данной работе, свидетельствует о разнообразии генов и кассет, входящих в состав генома возбудителя. Генетические отличия защитной системы внутри одного вида являются весьма значимыми с точки зрения создания методов лечения стафилококковых инфекций. Вполне возможно, что уникальное строение выявленной CRISPR/Cas-системы объясняется приспособленностью S. aureus к внутривидовым и межвидовым отношениям. За последнее время были расшифрованы тысячи геномов многих видов бактерий, бактериофагов, плазмид, в том числе и штаммов S. aureus, а потому разработанный нами алгоритм программных методов поиска локусов CRISPR/Cas-систем может быть использован и на других расшифрованных геномах многих бактерий. Это даёт возможность в дальнейшем проводить аналогичные поисковые исследования на большой выборке геномов бактерий, которая будет важна для сравнительного анализа разнообразия структур CRISPR/Cas-систем в рамках как конкретного, так и различных видов. Определение структуры спейсеров в CRISPR-кассете позволяет определять степень устойчивости бактерий к специфичным бактериофагам, что в перспективе может быть использовано для разработки технологии таргетной
фаговой терапии инфекций, вызываемых патогенными бактериями, включая «супербактерии».
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и правительства Иркутской области в рамках проекта № 17-415-380005.
Список литературы
Биоинформационные алгоритмы поиска и анализа CRISPR/Cas-систем и фаговых профилей в геноме штамма Staphylococcus aureus М1216 / А. Ю. Борисенко, Ю. П. Джиоев, А. И. Парамонов, Ю. С. Букин, Л. А. Степаненко, О. В. Колбасеева, В. И. Злобин, Е. А. Воскресенская, Л. А. Степаненко, Н. Е. Зелинская, О. В. Колбасеева, Н. В. Шмидт, И. В. Малов // Журнал инфектологии. 2016. Т. 8, № S2. С. 27-28.
Землянко О. М., Рогоза Т. М., Журавлева Г. А. Механизмы множественной устойчивости бактерий к антибиотикам // Экологическая генетика. 2018. Т. 16, № 3. С. 4-17. https://doi.org/10.17816/ecogen1634-17
Использование биоинформационных программных методов для поиска CRISPR/Cas-систем в геномах штаммов Staphylococcus aureus / А. Ю. Борисенко, Ю. П. Джиоев, А. И. Парамонов, Ю. С. Букин, Л. А. Степаненко, О. В. Колбасеева, В. И. Злобин // Сибирский медицинский журнал. 2015. Т. 133, № 2. С. 71-74.
Проблема резистентности к антибиотикам возбудителей болезней, общих для человека и животных / А. Н. Панин, А. А. Комаров, А. В. Куликовский, Д. А. Макаров. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2017. № 5. С. 18-24.
Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation // Annu. Rev. Genet. 2011. N 45. P. 273-297. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132430
Burki T. K. Superbugs: An Arms Race Against Bacteria // Lancet Respir. Med. 2018. Vol. 6, N 9. P. 668. https:// doi.org/10.1016/S2213-2600(18)30271-6
CRISPI: a CRISPR interactive database / C. Rousseau, M. Gonnet, M. Le Romancer, J. Nicolas // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, N 24. P. 3317-3318. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp586
CRISPR Target: Bioinformatic prediction and analysis of crRNA targets / A. Biswas, J. N. Gagnon, S. J. J. Brouns, P. Fineran, C. Brown // RNA Biology. 2013. Vol. 10, N 5. P. 817-827. https://doi.org/10.4161/rna.24046
CRISPR-Cas influences the acquisition of antibiotic resistance in Klebsiella pneumonia / N. A. Mackow, J. Shen, M. Adnan, A. S. Khan, B. C. Fries, E. Diago-Navarro // PLoS One. 2019. Vol. 14, N 11:e0225131. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225131
Deurenberg R. H., Stobberingh E. E. The evolution of Staphylococcus aureus // Infect. Genet. Evol. 2008. Vol 8, N 6. P. 747-763. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2008.07.007
Domingo-Calap P., Delgado-Martinez J. Bacteriophages: protagonists of a postantibiotic era // Antibiotics. 2018.Vol. 7, N 3. P. 66. https://doi.org/10.3390/antibiotics7030066 Emerging Strategies to Combat ESKAPE Pathogens in the Era of Antimicrobial Resistance: A Review / M. S. Mulani, E. E. Kamble, S. N. Kumkar, M. S. Tawre, K. R. Pardesi // Front. Microbiol. 2019. N 10. P. 539. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00539
Founou R. C., Founou L. L., Essack S. Y. Clinical and economic impact of antibiotic resistance in developing countries: a systematic review and meta-analysis // PLoS ONE. 2017. Vol. 12, N 12. e0189621. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189621
Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated mi-crobial immunity // Cell. Mol. Life Sci. 2014. Vol. 71, N 3. P. 449-465. https://doi.org/10.1007/s00018-013-1438-6
Goldmann O., Medina E. Staphylococcus aureus strategies to evade the host acquired immune response // Int. J. Med. Microbiol. 2018. Vol. 308, N 6. P. 625-630. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2017.09.013
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Research. 2007. Vol. 35. P. W52-W57. https://doi.org/10.1093/nar/gkm360
High vancomycin minimum inhibitory concentrations with heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in meticillin-resistant S. aureus bacteraemia patients / J. L. Wang, C. H. Lai, H. H. Lin, W. F. Chen, Y. C. Shih, C. H. Hung // Int. J. Antimicrob. Agents. 2013. Vol. 42, N 5. P. 390-394. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2013.07.010
de Jong N. W. M., van Kessel K. P. M., van Strijp J. A. G. Immune Evasion by Staphylococcus aureus // Microbiol Spectr. 2019. Vol.7, N 2. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3-0061-2019
MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems / S. S. Abby, B. Neron, H. Menager, M. Touchon, E. P. C. Rocha // PLoS ONE. 2014. Vol. 9, N 10, P. e110726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110726
Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins / J. Bondy-Denomy, B. Garcia, S. Strum, M. Du, M. F. Rollins, Yu. Hidalgo-Reyes, B. Wiedenheft, K. L. Maxwell, A. R. Davidson // Nature. 2015. Vol. 526, N 7571. P. 136-139. https://doi.org/10.1038/nature15254
Nasal carriage as a source of Staphylococcus aureus bacteremia / C. Eiff, K. Becker, K. Machka, H. Stammer, G. Peters // N. Engl. J. Med. 2001. N 344. P. 11-16. https://doi.org/10.1056/NEJM200101043440102
Nasal carriage as a source of agr-defective Staphylococcus aureus bacteremia / D. S. Smyth, J. M. Kafer, G. A. Wasserman, L. Velickovic, B. Mathema, R. S. Holzman // J. Infect. Dis. 2012. Vol. 206, N 8. P. 1168-1177. https://doi.org/10.1093/infdis/jis483
Navidinia M. The clinical importance of emerging ESKAPE pathogens in nosocomial infections // J. Paramed. Sci. 2016. Vol. 7, N 3. P. 43-56. https://doi.org/10.22037/jps.v7i3.12584
Origin and proliferation of multiple-drug resistance in bacterial pathogens / H. H. Chang, T. Cohen, Y. H. Grad, W. P. Hanage, T. F. O'Brien, M. Lipsitch // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2015. Vol. 79, N 1. P. 101-16. https://doi.org/10.1128/MMBR.00039-14
Prospects to Enhance Phage Therapy by Looking At CRISP Fingerprints in Bacterial Populations / V. I. Zlobin, Y. P. Dzhioev, N. P. Peretolchina, A. Y. Borisenko, L. A. Stepanenko, Y. Wang, Z. Qu, R. Pierneef, O. N. Reva // Curr. Trends Biomedical Eng. & Biosci. 2018. Vol. 10, N 5. Р. 1-3. https://doi.org/10.19080/CTBEB.2018.10.555800
Revisiting Bacterial Interference in the Age of Methicillin-resistant Staphylococcus au-reus: Insights into Staphylococcus aureus Carriage, Pathogenicity and Potential Control / P. J. Planet, D. Parker, N. L. Ruff, H. R. Shinefield // Pediatr. Infect. Dis. J. 2019. Vol. 38, N 9. P. 958-966. https://doi.org/10.1097/INF.0000000000002411
Rice L. B. Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens: no ESKAPE // J. Inf. Dis. 2008. Vol. 197, N 8. P. 1079-1081. https://doi.org/10.1086/533452
Short term evolution of a highly transmissible methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone (ST228) in a tertiary care hospital / V. Vogel, L. Falquet, S. P. Calderon-Copete, P. Basset, D. C. Blanc // PLoS One. 2012. Vol. 7, N 6:e38969. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038969
Sontheimer E. J., Barrangou R. The Bacterial Origins of the CRISPR Genome-Editing Revolution // Hum. Gene Ther. 2015. Vol. 26, N 7. P. 413-24. https://doi.org/10.1089/hum.2015.091
The magistral phage / J. P. Pirnay, G. Verbeken, P. J. Ceyssens, I. Huys, D. De Vos, C. Ameloot, A. Fauconnier // Viruses. 2018. Vol. 10, N 2. pii:E64. https://doi.org/10.3390/v10020064
Veeraraghavan B., Walia K. Antimicrobial susceptibility profile & resistance mechanisms of Global Antimicrobial Resistance Surveillance System (GLASS) priority pathogens from India // Indian J. Med. Res. 2019. Vol. 149, N 2. P. 87-96. https://doi.org/10.4103/ijmr.IJMR_214_18
Structures of the CRISPR/Cas System in the Genome of the Staphylococcus aureus ST228 Strain and Phage Races Detected by Bioinformatics
A. Yu. Borisenko1, Yu. P. Dzhioev1, L. A. Stepanenko1,
Yu. M. Zemlyanskaya1, N. P. Peretolchina1, N. A. Arefieva2,
Yu. S. Bukin 2,3 E. B. Rakova1, L. A. Kokorina1, Ya. A. Portnaya1,
O. F. Vyatchina2, A. S. Martynova2, L. A. Frantseva2, V. V. Vasiliev4, 2 2 11 G. A. Teterina , V. P. Salovarova , E. V. Simonova , V. I. Zlobin
1 Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russian Federation
2 Irkutsk State University, Irkutsk, Russian Federation 3Limnological Institute SB RAS, Irkutsk, Russian Federation
4Irkutsk Anti-plague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor, Irkutsk, Russian Federation
Abstract. In the modern world, infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacteria have become carriers of global threats to human health. Today these pathogenic bacteria have come to be referred to as "superbugs" and their number and aggressiveness is growing. This group of "superbugs" also includes Staphylococcus aureus. It is capable of infecting almost any tissue in the human body. Therefore, it became necessary to find alternative antibiotic methods of treating bacterial infections. The use of bacteriophages is again among them. We propose a new approach in the search for strain-specific (target) phages through the structures of the CRISPR/Cas-systems of bacteria. As is known, CRISPR/Cas systems are the most ancient system of "adaptive immunity" in bacteria. This system makes bacteria resistant to phages and plasmids. This approach is based on the use of methods of structural genomics and software bioinformatics modeling. Using them, an algorithm was developed to search for the structures of CRISPR/Cas systems in bacterial genomes presented in the NCBI databases and screening through their CRISPR cassettes of phages with which a particular strain could meet. The design of the developed algorithm was tested on the genome of methicillin-resistant S. aureus strain (ST228-MRSA-I) from the GenBank database. The results of the search for loci and structures of the CRISPR/Cas system in the genome of this strain showed that the identified system belongs to type III-A. It was found that the cas genes and the CRISPR cassette are located at a distance from each other and between them are located several genes that perform other functions in the genome of the S. aureus strain. It was shown that the structures of spacers in the detected CRISPR cassette are identical to protospacers of phages, the hosts of which are bacteria of the following genera - Staphylococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Bacillus, Gordonia, Arthrobacter, Streptomyces. Thus, it can be stated that the developed algorithm of software methods for searching for loci of CRISPR/Cas systems and screening for phages makes it possible to type both the system itself and through its spacers to detect and identify phage races with which a particular bacterial strain could meet. The degree of resistance of a particular bacterial strain to specific phages is also determined, which in the long term should ensure the effectiveness of targeted phage therapy for infections caused by pathogenic bacteria, including "superbugs".
Keywords: genome of strain of Staphylococcus aureus ST228, program methods of bioinformatics, CRISPR/Cas-system, spacers, repeats, protospisers, bacteriophages.
For citation: Borisenko A.Yu., Dzhioev Yu.P., Stepanenko L.A., Zemlyanskaya Yu.M., Peretolchina N.P., Arefieva N.A., Bukin Yu.S., Rakova E.B., Kokorina L.A., Portnaya Ya.A., Vyatchina O.F., Martynova A.S., Frantseva L.A., Vasiliev V.V., Teterina G.A., Salovarova V.P., Simonova E.V., Zlobin V.I. Structures of the CRISPR/Cas System in the Genome of the Staphylococcus aureus ST228 Strain and Phage Races Detected by Bioinformatics. The Bulletin of Irkutsk State University. Series Biology. Ecology, 2020, vol. 31, pp. 3-18. https://doi.org/10.26516/2073-3372.2020.3L3 (in Russian)
References
Borisenko A.Yu., Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., Bukin Yu.S., Stepanenko L.A., Kolbaseeva O.V., Zlobin V.I., Voskresenskaya E.A., Stepanenko L.A., Zelinskaya N.E., Kolbaseeva O.V., Schmidt N.V., Malov I.V. Bioinformatsionnye algoritmy poiska i analiza CRISPR/Cas-sistem i fagovykh profilei v genome shtamma Staphylococcus aureus M1216 [Bioinformational algorithms for searching and analyzing CRISPR/Cas systems and phage profiles in the genome of the Staphylococcus aureus strain M1216]. J. Infect., 2016, vol. 8, no. S2, pp. 27-28. (in Russian)
Zemlyanko O.M., Rogoza T.M., Zhuravleva G.A. Mekhanizmy mnozhestvennoi ustoichivosti bakterii k antibiotikam [Mechanisms of multiple resistance of bacteria to antibiotics]. Ecol. Gen., 2018, vol. 16, no. 3, pp. 4-17. (in Russian). https://doi.org/10.17816/ecogen1634-17
Borisenko A.Yu., Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., Bukin Yu.S., Stepanenko L.A., Kolbaseeva O.V., Zlobin V.I. Ispol'zovanie bioinformatsionnykh programmnykh metodov dlya poiska CRISPR/Cas-sistem v genomakh shtammov Staphylococcus aureus [The use of bioinformation software methods for searching for CRISPR/Cas-systems in the genomes of Staphy-lococcus aureus strains]. Siberian Med. J., 2015, vol. 133, no. 2, pp. 71-74. (in Russian)
Panin A.N., Komarov A.A., Kulikovsky A.V., Makarov D.A. Problema rezistentnosti k antibiotikam vozbuditelei boleznei, obshchikh dlya cheloveka i zhivotnykh [The problem of antibiotic resistance of pathogens common to humans and animals]. Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya [Veterinary medicine, zootechnics and biotechnology], 2017, no. 5, pp. 1824. (in Russian)
Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu. Rev. Genet., 2011, no. 45, pp. 273-297. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132430
Burki T. K. Superbugs: An Arms Race Against Bacteria // Lancet Respir. Med., 2018, vol. 6, no. 9, pp. 668. https:// doi.org/10.1016/S2213-2600(18)30271-6
Biswas A., Gagnon J. N., Brouns S. J. J., Fineran P., Brown C. CRISPR Target: Bioin-formatic prediction and analysis of crRNA targets. RNA Biology, 2013, vol. 10, no. 5, pp. 817827. https://doi.org/10.4161/rna.24046
Rousseau C., Gonnet M., Le Romancer M., Nicolas J. CRISPI: a CRISPR interactive database. Bioinformatics, 2009, vol. 25, no. 24, pp. 3317-3318. https://doi.org/10.1093/ bioin-formatics/btp586
Mackow N.A., Shen J., Adnan M., Khan A.S., Fries B.C., Diago-Navarro E. CRISPR-Cas influences the acquisition of antibiotic resistance in Klebsiella pneumonia. PLoS One, 2019, vol. 14, no. 11:e0225131. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225131
Deurenberg R. H., Stobberingh E. E. The evolution of Staphylococcus aureus. Infect. Genet. Evol. 2008, vol 8, no. 6, pp. 747-763. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2008.07.007
Domingo-Calap P., Delgado-Martinez J. Bacteriophages: protagonists of a postantibiotic era. Antibiotics, 2018, vol. 7, no. 3, p. 66. https://doi.org/10.3390/antibiotics7030066 Mulani M.S., Kamble E.E., Kumkar S.N., Tawre M.S., Pardesi K.R. Emerging Strategies to Combat ESKAPE Pathogens in the Era of Antimicrobial Resistance: A Review. Front. Mi-crobiol, 2019, no. 10, p. 539. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00539
Founou R.C., Founou L.L., Essack S.Y. Clinical and economic impact of antibiotic resistance in developing countries: a systematic review and meta-analysis. PLoS ONE, 2017, vol. 12, no. 12. e0189621. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189621
Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated mi-crobial immunity. Cell. Mol. Life Sci., 2014, vol. 71, no. 3, pp. 449-465. https://doi.org/10.1007/s00018-013-1438-6
Goldmann O., Medina E. Staphylococcus aureus strategies to evade the host acquired immune response. Int. J. Med. Microbiol., 2018, vol. 308, no. 6, pp. 625-630. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2017.09.013
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Nucl. Acids Res., 2007, vol. 35, pp. W52-W57. https://doi.org/10.1093/nar/gkm360
Wang J.L., Lai C.H., Lin H.H., Chen W.F., Shih Y.C., Hung C.H. High vancomycin minimum inhibitory concentrations with heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylo-coccus aureus in meticillin-resistant S. aureus bacteraemia patients. Int. J. Antimicrob. Agents, 2013, vol. 42, no. 5, pp. 390-394. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2013.07.010
Abby S.S., Neron B., Menager H., Touchon M., Rocha E.P.C. MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems. PLoS ONE, 2014, vol. 9, no. 10, p. e110726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110726
Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S., Du M., Rollins M.F., Hidalgo-Reyes Y., Wiedenheft B., Maxwell K.L., Davidson A.R. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins. Nature, 2015, vol. 526, no. 7571, pp. 136-139. https://doi.org/10.1038/nature15254
Smyth D.S., Kafer J.M., Wasserman G.A., Velickovic L., Mathema B., Holzman R. S. Nasal carriage as a source of agr-defective Staphylococcus aureus bacteremia. J. Infect. Dis., 2012, vol. 206, no. 8, pp.1168-77. https://doi.org/10.1093/infdis/jis483
Eiff C., Becker K., Machka K., Stammer H., Peters G. Nasal carriage as a source of Staphylococcus aureus bacteremia. N. Engl. J. Med., 2012, no. 344, pp. 11-16. https://doi.org/ 10.1056/NEJM200101043440102
de Jong N.W.M., van Kessel K.P.M., van Strijp J.A.G. Immune Evasion by Staphylo-coccus aureus. Microbiol Spectr., 2019, vol. 7, no. 2. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3-0061-2019
Navidinia M. The clinical importance of emerging ESKAPE pathogens in nosocomial infections. J. Paramed. Sci., 2016, no. 7, pp. 4978. https://doi.org/10.22037/jps.v7i3.12584
Chang H.H., Cohen T., Grad Y.H., Hanage W.P., O'Brien T.F., Lipsitch M. Origin and proliferation of multiple-drug resistance in bacterial pathogens. Microbiol. Mol. Biol. Rev,. 2015, vol. 79, no. 1, pp. 101-16. https://doi.org/10.1128/MMBR.00039-14
Planet P.J., Parker D., Ruff N.L., Shinefield H.R. Revisiting Bacterial Interference in the Age of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Insights into Staphylococcus aureus Carriage, Pathogenicity and Potential Control. Pediatr. Infect. Dis. J., 2019, vol. 38, no. 9, pp. 958-966. https://doi.org/10.1097/INF.0000000000002411
Zlobin V.I., Dzhioev Y.P., Peretolchina N.P., Borisenko A.Y., Stepanenko L.A., Wang Y., Qu Z., Pierneef R., Reva O.N. Prospects to Enhance Phage Therapy by Looking At CRISP Fingerprints in Bacterial Populations. Current Trends in Biomedical Engineering & Biosciences, 2018, vol. 10, no. 5, pp. 1-3. https://doi.org/10.19080/CTBEB.2018.10.555800
Rice L. B. Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens: no ESKAPE. J. Inf. Dis, 2008, vol. 197, no. 8, pp. 1079-1081. https://doi.org/10.1086/533452
Vogel V., Falquet L., Calderon-Copete S.P., Basset P., Blanc D.C. Short term evolution of a highly transmissible methicillin-resistant Staphylococcus aureus clone (ST228) in a tertiary care hospital. PLoS One, 2012, vol. 7, no. 6:e38969. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038969
Sontheimer E.J., Barrangou R. The Bacterial Origins of the CRISPR Genome-Editing Revolution. Hum. Gene Ther., 2015, vol. 26, no. 7, pp. 413-24. https://doi.org/10.1089/hum. 2015.091
Pirnay J.P., Verbeken G., Ceyssens P.J., Huys I., De Vos D., Ameloot C., Fauconnier A. The magistral phage. Viruses, 2018, vol. 10, no. 2, pii: E64. https://doi.org/10.3390/v10020064 Veeraraghavan B., Walia K. Antimicrobial susceptibility profile & resistance mechanisms of Global Antimicrobial Resistance Surveillance System (GLASS) priority pathogens from India. Indian J. Med. Res., 2019, vol. 149, no. 2, pp. 87-96. https://doi.org/10.4103/ijmr. IJMR 214 18
Борисенко Андрей Юрьевич ассистент
Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: 89500720225@mail.ru
Джиоев Юрий Павлович кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: alanir07@mail.ru
Степаненко Лилия Александровна кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: steplia@mail.ru
Землянская Юлия Михайловна старший преподаватель, Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: yuliyazemlya84@mail.ru
Перетолчина Надежда Павловна младший научный сотрудник Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: nadinellenz@gmail.com
Арефьева Надежда Александровна студент
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1
e-mail: arefieva.n4@gmail.com
Букин Юрий Сергеевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Borisenko Andrei Yurievich Assistant
Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: 89500720225@mail.ru
Dzhioev Yuri Pavlovich Candidate of Sciences (Biology), Senior Research Scientist, Head of Laboratory Irkutsk State Medical University, 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: alanir07@mail.ru
Stepanenko Lilia Alexandrovna Candidate of Sciences (Medicine), Senior Research Scientist Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: steplia@mail.ru
Zemlyanskaya Julia Mikhailovna, Senior Lecturer
Irkutsk State Medical University, 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: yuliyazemlya84@mail.ru
Peretolchina Nadezhda Pavlovna Junior Research Scientist Irkutsk State Medical University, 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: nadine1lenz@gmail.com
Arefieva Nadezhda Aleksandrovna Student
Irkutsk State University
1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation
e-mail: arefieva.n4@gmail.com
Bukin Yuri Sergeevich Candidate of Sciences (Biology), Senior Research Scientist
Лимнологический институт СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, Улан-Баторская, 3 e-mail: bukinys@lin.irk.ru
Ракова Елена Борисовна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: lenova_@mail.ru
Кокорина Любовь Александровна ассистент
Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: lubovkokorina1990@yandex.ru
Портная Яна Алексеевна еЖуудент
Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: portnaya.yana.1997@yandex.ru
Вятчина Ольга Федоровна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1
e-mail: olgairk3@rambler.ru
Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033, Russian Federation e-mail: bukinys@lin.irk.ru
Rakova Elena Borisovna Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: lenova_@mail.ru
Kokorina Lyubov Aleksandrovna Assistant
Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: lubovkokorina1990@yandex.ru
Portnaya Yana Alekseevna Student
Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation e-mail: portnaya.yana.1997@yandex.ru
Vyatchina Olga Fedorovna Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State University Russia, 664003, Irkutsk, st. Karl Marx, 1 e-mail: olgairk3@rambler.ru
Мартынова Алена Сергеевна Martynova Alena Sergeevna,
магистрант Undergraduate
Иркутский государственный университет Irkutsk State University Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003, e-mail: martynovalen@mail.ru Russian Federation
e-mail: martynovalen@mail.ru
Францева Лада Андреевна Frantseva Lada Andreevna
студент Student
Иркутский государственный университет Irkutsk State University Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003, e-mail: ladafrantseva@yandex.ru Russian Federation
e-mail: ladafrantseva@yandex.ru
Васильев Валерий Владимирович
научный сотрудник
Иркутский научно-исследовательский
противочумный институт Сибири
и Дальнего Востока
Россия, 664047, г. Иркутск,
ул. Трилиссера, 78
e-mail: marmakeda_007@mail.ru
Vasiliev Valery Vladimirovich Research Scientist
Irkutsk Anti-plague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor 78, Trilisser st., Irkutsk. 664047, Russian Federation
e-mail: marmakeda 007@mail.ru
Тетерина Галина Александровна Teterina Galina Aleksandrovna
аспирант Graduate Student
Иркутский государственный университет Irkutsk State University Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003, e-mail: galina.teterina.91@mail.ru Russian Federation
e-mail: galina.teterina.91@mail.ru
Саловарова Валентина Петровна доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Симонова Елена Васильевна
доктор биологических наук, профессор,
Иркутский государственный
медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск,
ул. Красного Восстания, 1
e-mail: ev.simonova@yandex.ru
Salovarova Valentina Petrovna
Doctor of Sciences (Biology),
Professor, Head of Department
Irkutsk State University
1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation
e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Simonova Elena Vasilievna
Doctor of Sciences (Biology), Professor,
Irkutsk State Medical University
1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk,
664003, Russian Federation
e-mail: ev.simonova@yandex.ru
Злобин Владимир Игоревич доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заведующий кафедрой, директор НИИ биомедицинских технологий
Иркутский государственный медицинский университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 e-mail: vizlobin@mail.ru
Zlobin Vladimir Igorevich
Doctor of Sciences (Medicine), Professor,
Academician of RAS, Head of Department,
Director of the Research Institute
of Biomedical Technologies
Irkutsk State Medical University
1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation
e-mail: vizlobin@mail.ru
Дата поступления: 07.12.2019 Received: December, 07, 2019
