CC BY
43
F'imi«!11! о
Онлайн-доступ к журналу: http://izvestiabio.isu.ru/ru/index.html
Серия «Биология. Экология»
2018. Т. 26. С. 3-17
Иркутского государственного университета
И З В Е С Т И Я
УДК 576.8
DOI https://doi.Org/10.26516/2073-3372.2018.26.3
Детекция и анализ структур CRISPR-Cas-систем в геноме плазмиды pYC-1 из штамма Bacillus thuringiensis YC-10
Н. А. Арефьева 1, Ю. П. Джиоев 2, А. Ю. Борисенко 2,
Л. А. Степаненко 2, Н. П. Перетолчина 2, Ю. С. Букин 3'4,
В. И. Чемерилова 1, О. Ф. Вятчина 1, О. А. Секерина 2, Ю. А. Маркова 5,
Г. В. Юринова 1, В. П. Саловарова 1, А. А. Приставка 1,
В. А. Кузьминова 1, А. C. Мартынова 1, В. И. Злобин 2
1Иркутский государственный университет, Иркутск 2Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск 3Лимнологический институт СО РАН, Иркутск
4Иркутский национальный исследовательский технический университет, Иркутск 5Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск E-mail:arefieva.n4@gmail.com
Аннотация. Описан поиск и анализ структур CRISPR-Cas-системы в геноме плазмиды pYC-1, которая является мегаплазмидой штамма Bacillus thuringiensis YC-10. Биоинформационный поиск структур CRISPR-Cas-системы включал три этапа: идентификация cas-генов, детекция CRISPR-кассет и анализ их структур. Идентификацию cas-генов проводили через их аминокислотный профиль при помощи программы MacSyFinder. Детекцию и анализ CRISPR-кассет проводили при помощи приложений CRISPRFinder, CRISPRDetect, PILER-CR, CRISPR Recognition Tool (CRT). Консенсусная структура для множественного выравнивания межспейсерных повторов получена и визуализирована в WebLogo 3. Положение консенсусной последовательности в классификации CRISPR-ассоциированных повторов определено через web-сервис CRISPRmap (v. 1.3.0). Анализ структуры CRISPR-локуса проводили, используя программную платформу Artemis (v. 17.0.1). Тип CRISPR-Cas-системы определяли в соответствии с последней версией классификации. Описаны структуры CRISPR-Cas-системы, обнаруженные в результате программного поиска. Проведён анализ структуры выявленных CRISPR-кассет. Наличие в плазмидном геноме CRISPR-Cas-системы может свидетельствовать о возможной передаче данного локуса от бактериальной хромосомы плазмиде. Выдвинуто предположение, что данные системы могут передаваться путём конъюгации в бактериальных сообществах. Отмечена высокая эффективность применения описываемого биоинформационного алгоритма для детекции структур CRISPR-Cas-систем во внехромосомных элементах генома.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, штамм YC-10, плазмиды, плазмида pYC-1, CRISPR-Cas-система, методы биоинформатики.
Для цитирования: Детекция и анализ структур CRISPR-Cas-систем в геноме плазмиды pYC-1 из штамма Bacillus thuringiensis YC-10 / Н. А. Арефьева, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, Л. А. Степаненко, Н. П. Перетолчина, Ю. С. Букин, В. И. Чемерилова, О. Ф. Вятчина, О. А. Секерина., Ю. А. Маркова, Г. В. Юринова, В. П. Саловарова, А. А. Приставка, В. А. Кузьминова, А. C. Мартынова, В. И. Злобин // Известия Иркутского государственного университета. Серия Биология. Экология. 2018. Т. 26. С. 3-17. https://doi.org/10.26516/2073-3372.2018.263
Введение
Поиск и анализ в бактериальном геноме локусов CRISPR-Cas-систем является одним из новых направлений биоинформатики. CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами с CRISPR-ассоциированными белками) - адаптивные иммунные системы бактерий и архей, обеспечивающие защиту от чужеродных генетических элементов, таких как бактериофаги, транспозоны и плазмиды [Intervening sequences ... , 2005; CRISPR provides ... , 2007, CRISPR-based adaptive ... , 2009]. Эти системы были найдены примерно у 45 % бактерий и 90 % архей, представленных в базах данных CRISPRdb (http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/) [Grissa, Vergnaud, Pourcel, 2007а, 2007б] и CRISPRI (http://crispi.genouest.org/) [CRISPI: a CRISPR ... , 2009] на август 2018 г. Всплеск интереса к ним связан с открытием молекулярных механизмов функционирования белка Cas9, являющегося эффекторной эндонукле-азой CRISPR-Ca-систем II типа. На сегодня технологии CRISPR-Cas9 эффективно применяются для направленного редактирования геномов живых систем [Doudna, Charpentier, 2014].
В организации CRISPR-Cas-систем принято выделять три структуры — CRISPR-кассеты, лидерную последовательность и кластер cas--генов. CRISPR-кассеты представляют собой набор коротких повторяющихся последовательностей размером 21-48 п. н. В промежутках между повторами находятся уникальные спейсерные сайты (26-72 п. н.), гомологичные участкам фагов и плазмид, к которым данная бактерия имеет «иммунитет» [Clustered regularly ... , 2005]. Перед CRISPR-кассетой расположена лидерная последовательность - консервативная AT-богатая область длиной 100-500 п. н., которая содержит промотор и обеспечивает однонаправленную транскрипцию CRISPR-кассеты [Bhaya, Davison, Barrangou, 2011].
Cas-гены организованы в два модуля, кодирующих субъединицы адаптационного и эффекторного комплексов, обеспечивающих функционирование CRISPR-локусов [Makarova, Wolf, Koonin ... , 2013; Koonin, Makarova, Zhang, 2017]. Механизм действия CRISPR-Cas систем обычно разделяют на три стадии: 1) приобретение новых спейсеров, или адаптация; 2) транскрипция CRISPR-кассеты и процессинг пре-crPHK (пре-CRISPR РНК) на короткие направляющие crPHK-фрагменты; 3) интерференция, во время которой происходит специфическое распознавание и уничтожение чужеродных генетических элементов [CRISPR provides acquired ... , 2007; Gasiunas, Sinku-nas, Siksnys, 2014; Hille, Charpentier, 2016].
Согласно последней классификации, основанной на особенностях организации локусов и архитектуры эффекторного комплекса, CRISPR-Cas системы разделяют на два класса, объединяющих пять типов и 16 подтипов. CRISPR-Cas-системы первого класса имеют мульти-субъединичный эф-фекторный комплекс. На основании сигнатурных генов cas3 и caslO, кодирующих эндонуклеазы интерференции, здесь выделяют наиболее общие и разнообразные типы I и III. Сюда же входит наиболее редкий тип IV с сиг-
натурным геном csfl, включающим рудиментальные CRISRP-локусы, в которых отсутствуют гены адаптационного модуля (casl, cas2). Во втором классе эффекторный комплекс представлен одним мультидоменным белком: Cas9 у типа II или Cpfl у типа V [Koonin, Makarova, Zhang, 2017].
Исследования разнообразия структур и механизмов функционирования CRISPR-Cas систем лежат в основе разработки технологий направленного редактирования геномов прокариот и эукариот [Doudna, Charpentier, 2014; The révolution continues, 2017; Hsu, Lander, Zhang, 2014; Cong, Zhang, 2015]. Одним из перспективных направлений является исследование вариабельности CRISPR-локусов в геномах бактерий, архей и мобильных генетических элементов в зависимости от их эколого-географического распространения. У авторов работы уже имеются результаты по исследованию разнообразия структур CRISPR-Cas-систем в геномах условно-патогенных и патогенных бактерий, выделенных из объектов окружающей среды и от пациентов с инфекционными заболеваниями [Биоинформационный анализ ... , 2016; Детекция структур ..., 2018; Использование биоинформационных ... , 2015; Характеристика CRISPR-Cas ... , 2018; Prospects to Enhance ... , 2018]
Расшифровка структуры спейсеров в CRISPR-кассетах позволяет получить информацию об устойчивости к фагам промышленно важных бактериальных штаммов, среди которых особое место занимают штаммы вида Bacillus thuringiensis.
B. thuringiensis (Bt) - грамположительные аэробные спорообразующие бактерии из группы Bacillus cereus. Особый интерес этот вид представляет для сельского хозяйства и медицины в связи с его способностью продуцировать широкий спектр белковых токсинов. Кристалические Cry и Cyt белки (дельта-эндотоксины) и Vip-токсины обусловливают энтомопатогенные свойства штаммов Bt. Созданные на их основе инсектицидные препараты применяются в борьбе с насекомыми из отрядов Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera [Bacillus thuringiensis ... , 2014]. Разновидностью Cry-токсинов, синтезируемых штаммами Bt, являются параспорины (PS), которые обладают токсическим воздействием на раковые клетки млекопитающих [Ohba, Mizuki, Uemori, 2009; Melo, Soccol, Soccol, 2016].
Целью настоящей работы стали поиск и анализ структур CRISPR-Cas-системы в геноме плазмиды pYC-1 из штамма Bacillus thuringiensis YC-10 с использованием программных средств биоинформатики.
Материалы и методы
Материалом для исследования стал геном плазмиды pYC-1 из штамма Bacillus thuringiensis YC-10, который в 2010 г. был выделен из корней табака в провинции Хунань в Китае. Нуклеотидные последовательности бактериальной хромосомы (NZ_CP011349.1) и девяти плазмид данного штамма (табл. 1) были загружены из базы данных RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/). В самой крупной плазмиде pYC-1 обнаружены шесть генов, кодирующих инсектицидные кристаллические белки (ICP): cry1Aa, cry1Ac, cry1Ia, cry2Aa, cry2Ab и cryB1 [Complete genome ... , 2015].
Таблица 1
Характеристики плазмид, выделенных из штамма Bacillus thuringiensis YC-10
Название Номер в базе RefSeq Размер последовательности, п. н. Количество кодирующих регионов (CDS)
pYC-1 NZ CP011350.1 761 374 701
pYC-3 NZ CP011351.1 80 704 84
pYC-4 NZ CP011352.1 46 634 67
pYC-5 NZ CP011353.1 17 063 12
pYC-6 NZ CP011354.1 8 511 10
pYC-10 NZ CP011355.1 14 894 24
pYC-11 NZ CP011356.1 7129 10
pYC-20 NZ CP011357.1 90 519 114
pYC-2226 NZ CP011358.1 82 300 87
Биоинформационный поиск и анализ структур CRISPR-Cas-системы включал три этапа: идентификацию cas-генов, детекцию CRISPR-кассет и анализ их структур. Идентификацию cas-генов проводили через их аминокислотный профиль при помощи программы MacSyFinder (Macromolecular System Finder, v. 1.0.5.), работающей на базе программных пакетов HMMER v. 3.1. и makeblastdb v. 2.7.1. [MacSyFinder: A Program ... , 2014]. Для получения характеристик нефункционирующих копий CRISPR-ассоциированных генов применяли алгоритм blastx (v. 2.7.1.) по локально собранной базе данных Cas-белков. Детекцию и анализ CRISPR-кассет проводили при помощи четырёх приложений: 1) CRISPRFinder (http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/); 2) CRISPRDetect (http : //brownlabtools.otago.ac .nz/CRISPRDetect/predict_crispr _array.); 3) PILER-CR; 4) CRISPR Recognition Tool (CRT) [2007]. Консенсус-ная структура для множественного выравнивая межспейсерных повторов получена и визуализирована в WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com) [WebLogo: a sequence ... , 2004]. Положение консенсусной последовательности в классификации CRISPR-ассоциированных повторов было определено через web-сервис CRISPRmap v. 1.3.0. (http://rna.informatik.uni-freiburg.de/CRISPRmap/Input.jsp) [CRISPRmap: an automated, 2013]. Анализ структуры CRISPR-локуса проводили, используя программную платформу Artemis v. 17.0.1. [Artemis: an integrated ..., 2012]. Тип CRISPR-Cas-системы определяли в соответствии с последней версией классификации [Koonin, Makarova, Zhang, 2017].
Результаты и обсуждение
В геноме плазмиды pYC-1 обнаружен один CRISPR-локус протяжённостью 9 404 п. н. (рис. 1). Были идентифицированы четыре CRISPR-ассоциированных гена эффекторного модуля: cas3, cas5c/cas5d, cas8c/csd1 и четыре копии гена cas7c/csd2, три из которых не являются функционирующими. Генов адаптационного модуля (cas1, cas2, cas4), необходимых для интеграции новых спейсеров в CRISPR-кассету, в плазмиде pYC-1 найдено не было (табл. 2). Согласно современной классификации, найденная CRISPR-Cas-система относится к первому классу, типу I, подтипу C (Dvulg
subtype). Данный подтип впервые был структурно-функционально охарактеризован у B. halodurans [Cas5d protein ... , 2015]. В других плазмидах исследуемого штамма не было найдено CRISPR-структур и cas-генов. В бактериальной хромосоме обнаружены десять нефункционирующих копий гена cas3.
696 ООО1 698 ООО1 700 000' 702 0001 704 ООО1
О «Сиси О ' 1 < cas3 11 I
| CRISPR 1 у CRISPR 2
Нефункционирующие копии csd2
Рис. 1. Организация локуса CRISPR-Cas-системы в геноме плазмиды pYC-1 штамма B. thuringiensis YC-10. Схема выполнена с помощью программы SnapGene Viewer v. 4.2.1
Таблица 2
Характеристики cas-генов, выявленных в геноме плазмиды pYC-1 штамма B. thuringiensis YC-10
Гены Позиции (начало-конец, н.о.) № белка в базе данных RefSeq Размер белка (а. о.) Score (bits) E-value Query cover % совпавших аминокислот
cas7c/csd2 698 344-699 204 WP_000853368.1 286 360.1 2.9e-109 0.93 0.92
cas8c/csd1 699 207-701 126 WP_000118651.1 639 457.1 3e-138 1.00 0.97
cas5c/cas5d 701 127-701 846 WP_003319726.1 239 278.9 1.1e-84 0.99 0.84
cas3 702 052-704 421 WP_014481878.1 789 146.6 3.6e-44 0.93 0.43
Нефункционирующие копии
cas7c/csd2 695 787-696 034 WP_000853368.1 - 97.1 1.3e-25 0.18 0.93
cas7c/csd2 696 598-697 077 WP_088060687.1 - 307 1.1e-106 0.56 0.93
cas7c/csd2 697 604-698 011 WP_098665124.1 - 239 3.2e-80 0.48 0.86
Примечание: Score (bits) - вес парного выравнивания исследуемой аминокислотной последовательности с аминокислотными профилями CRISPR-ассоциированных белков; E-value - статистическая значимость выравнивания; Query cover - степень перекрытия аминокислотных профилей CRISPR-ассоциированных белков с исследуемой аминокислотной последовательностью.
При помощи четырёх поисковых алгоритмов в исследуемой плазмиде pYC-1 обнаружены две CRIPSR-кассеты, локализованные по обе стороны от последовательности cas-генов в позициях 697 170-697 531 и 704 505705 191 п. н. (см. рис.1).
Межспейсерные повторы в найденных CRISPR-кассетах имеют размер 32 п. н. (рис. 2). В первой кассете число спейсерных последовательностей составило 5, их размеры варьируют от 33 до 35 п. н. Вторая включает 10 спейсеров по 32-35 п. н. (табл. 3). Консенсусная последовательность меж-спейсерных повторов принадлежит к семейству 3, суперклассу D, ассоциированному с CRISPR-Cas-системами подтипа I-C.
2.0-
5 10 15 20 25 30
WÉeiaflo ми
Рис. 2. Консенсусная последовательность межспейсерных повторов повторов в геноме плазмиды pYC-1, полученная при помощи приложения WebLogo 3.6.0. Размер символа указывает степень вариабельности нуклеотида
Таблица 3
Спейсерные последовательности в CRISPR-кассетах в геноме плазмиды pYC-1 штамма B. thuringiensis YC-10
№ Начало Последовательность Ко- Р Размер нец
CRISPR 1
1 697 202 TTGTTTTTCACAAAGCATTAATACCAGCTACAT 697 235 33
2 697 267 TTCTTTTGATCCGTAAGAACGTTCCATTTCCAT 697 300 33
3 697 332 GTCCCTTCCATCGGCGGCAGCTCATATTCAATTAT 697 367 35
4 697 399 TCGATTCCACTTGTTCAGGCTCTTTGAATATCAT 697 433 34
5 697 465 ATCCATTTGTTGTTACTTATGAACTACCGCCAATG 697 600 35
CRISPR 2
1 704 536 CATGACTGAATTTTGTCAAAATTGTGATATTAT 704 569 33
2 704 601 TATGAGCGTTCCAGATAAATATAAACCCGAGGTA 704 635 34
3 704 667 TGAAAACGGAAAAACAATTGAGCTAGTTGCAAA 704 700 33
4 704 732 TATGGGCATTCCAGATAAATATAAACCCGAGGTA 704 766 34
5 704 798 TGGTCTAACATCTAAAGCCATTAATAACTCCTA 704 831 33
6 704 863 TGCAAAGACGATCATAACGACTGGAGCAACAAA 704 896 33
7 704 928 ATACACTTTTTTTGATTTCTTCTACTATCTTC 704 960 32
8 704 992 TTTAAAACGTGCATAACCTAACACTTTCCCATTGT 705 027 35
9 705 059 TTTTTTACTCGGATACTCTAAAGGTGTAACAATA 705 093 34
10 705 125 ATGTGGGTGACGTCATTAAATTCTCGTATCTTGT 705 159 34
Ранее CRISPR-Cas-система подтипа I-C была обнаружена в плазмиде pFR260 (KX258624.1) из штамма B. thuringiensis INTA Fr7-4 [Complete Sequence ... , 2017]. По данным авторов, в плазмиде pFR260 найдены 3 CRISPR-кассеты и 9 cas-генов, в том числе гены адаптационного модуля (casl, cas2, cas4). Гомологичная последовательность cas-генов была найдена ещё в двух плазмидах: pBT1850294 (NZ_CP014284.1) из B. thuringiensis Bt185 и pBTHD521-5 (NZ_CP010111.1) из B. thuringiensis serovar indiana HD521 [Complete Sequence ... , 2017]. Однако их CRISPR-локусы не были описаны. В настоящее время в базах научных публикаций отсутствуют работы по анализу структур CRISPR-Cas-систем в плазмидах штаммов B. thuringiensis.
Заключение
Современные методы биоинформатики предоставляют огромные возможности для проведения модельных исследований по изучению структуры, функционирования и эволюции CRISPR-Cas систем. В настоящей работе с помощью этого подхода в геноме мегаплазмиды pYC-1 штамма Bacillus thuringiensis YC-10 был идентифицирован один локус CRISPR-Cas-системы подтипа I-C, включающей две CRISPR-кассеты и расположенную между ними последовательность cas-генов. Идентифицированный набор CRISPR-ассоциированных генов обеспечивает процессинг пре-стРНК и специфическое распознавание протоспейсеров фагов и плазмид через спейсерные последовательности. Однако в связи с отсутствием генов адаптационного модуля приобретение новых спейсеров не происходит. Наличие в плазмидном геноме CRISPR-Cas-системы может свидетельствовать о её возможной передаче от бактериальной хромосомы плазмиде. Также не исключено, что эта система может передаваться путём конъюгации как между штаммами B. thuringiensis, так и внутри рода Bacillus. Полученная информация о спейсерном составе CRISPR-кассет позволяет провести идентификацию протоспейсеров бактериофагов и чужеродных плазмид, к которым штамм B. thuringiensis YC-10 может обладать устойчивостью. Согласно полученным нами результатам, отработанный программный алгоритм позволяет эффективно проводить поиск и анализ структур CRISPR-Cas-систем в хромосомном геноме и в геноме плазмид и бактериофагов, связанных со штаммами вида B. thurin-giensis.
Список литературы
Биоинформационный анализ CRISPR-Cas системы штамма Yersinia pseudotuberculosis IP32953 / Н. П. Перетолчина, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, Е. А. Воскресенская, А. И. Парамонов, Л. А. Степаненко, О. В. Колбасеева, В. И. Злобин// Acta Biomedica Scientifica. 2016. № 5. С. 64-68.
Детекция структур CRISPR-Cas систем в геноме штамма Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 методами биоинформатики / О. В. Колбасеева, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, Л. А. Степаненко, В. И. Злобин, В. И. Колбасеева// Журнал инфектологии. 2018. Т. 10, № 2. С. 62-63.
Использование биоинформационных программных методов для поиска CRISPR-Cas систем в геномах штаммов Staphilococcus aureus / А. Ю. Борисенко, Ю. П. Джиоев, А. И. Парамонов, Ю. С. Букин, Л. А. Степаненко, О. В. Колбасеева, И. В. Злобин. // Сибирский медицинский журнал. 2015. № 2. С. 71-74.
Характеристика CRISPR-Cas систем в геноме Neisseria meningitidis FDAARGOS_214 30-31 / Л. А. Степаненко, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, В. И. Злобин, О. В. Колбасеева, И. В. Малов // Журн. инфектологии, 2018. Т. 10. № 1. С. 30-31.
An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems / K. S. Makarova, Y. I. Wolf, O. S. Alkhnbashi, F. Costa, S. A. Shah, S. J. Saunders, R. Barrangou, S. J. Brouns, E. Charpentier, D. H. Haft, P. Horvath, S. Moineau, F. J. Mojica, R. M. Terns, M. P Terns., M. F. White, A. F. Yakunin, R. A. Garrett, J. van der Oost, R. Backofen, E. V. Koonin // Nat. Rev. Microbiol. 2015. Vol. 13, N 11. P. 722-736. https://doi.org/10.1038/nrmicro3569
Artemis: an integrated platform for visualization and analysis of high-throughput sequence-based experimental data / T. Carver, S. R. Harris, M. Berriman, J. Parkhill, J. A. McQuillan. Bioin-formatics. 2012. Vol. 5, N 4. P. 464-469. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr703
Bacillus thuringiensis toxins: an overview of their biocidal activity. L. Palma, D. Munoz, C. Berry, J. Murillo, P. Caballero// Toxins (Basel). 2014. Vol. 6, N 12. P. 3296-3325. https://doi.org/10.33 90/toxins6123296
Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation// Annu. Rev. Genet. 2011. N 45. P. 273-297. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132430
Cas5d protein processes pre-crRNA and assembles into a cascade-like interference complex in subtype I-C/Dvulg CRISPR-Cas system / K. H. Nam, C. Haitjema, X. Liu, F. Ding, H. Wang, M. P. DeLisa, A. Ke// Structure. 2012. Vol. 20, N 9. P. 1574-1584. https://doi.org/10.1016/j.str.2012.06.016
Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin / A. Bolotin, B. Quinquis, A. Sorokin, S. D. Ehrlich // Microbiology. 2005. Vol. 151. P. 2551-2561. https://doi.org/10.1099/mic.0.28048-0
Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis YC-10, a novel active strain against plant-parasitic nematodes / F. Cheng, J. Wang, Z. Song, J. Cheng, D. Zhang, Y. Liu. // J. Biotechnol. 2015. Vol. 210, P. 17-18. https://doi.org/10.1016/jjbiotec.2015.06.395
Complete Sequence and Organization of pFR260, the Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4 Plasmid Harboring Insecticidal Genes / L. E. Navas, A. F. Amadio, E. M. Ortiz, D. H. Sauka, G. B. Benintende, M. F. Berretta, R. O. Zandomeni // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2017. Vol. 27, N 1. P. 43-54. https://doi.org/10.1159/000451056.
Cong L. Zhang F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system // Methods Mol. Bi-ol. 2015. Vol. 1239, P. 197-217. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1862-1_10
CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes / R. Barrangou, C. Fremaux, H. Deveau, M. Richards, P. Boyaval, S. Moineau, D.A. Romero, P. Horvath // Science. 2007. Vol. 315, N 5819. P. 1709-1712. https://doi.org/10.1126/science.1138140
CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats / C. Bland, T. L. Ramsey, F. Sabree, M. Lowe, K. Brown, N. C. Kyrpides, P. Hugenholtz// BMC Bioinformatics. 2007. Vol. 8, N 209. P. 1-8. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-209
CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes / J. Van der Oost, M. M. Jore, E. R. Westra, M. Lundgren, S. J. Brouns // Trends Biochem. Sci. 2009. Vol. 34, N 8. P. 401-407. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2009.05.002
CRISPI: a CRISPR interactive database / C. Rousseau, M. Gonnet, M. Le Romancer, J. Nicolas // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, N24. P. 3317-3318. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp586
CRISPRDetect: A flexible algorithm to define CRISPR arrays / A. Biswas, R. H. Staals, S. E. Morales, P. C. Fineran, C. M. Brown// BMC Genomics. 2016. Vol. 17, N 356. https://doi.org/10.1186/s12864-016-2627-0
CRISPRmap: an automated classification of repeat conservation in prokaryotic adaptive immune systems / S. J. Lange, O. S. Alkhnbashi, D. Rose, S. Will, R. Backofen // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, N 17. P. 8034-8044. https://doi.org/10.1093/nar/gkt606
Doudna J. A., Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science. 2014. Vol. 346, N 6213. P. 1258096-1258099. https://doi.org/ 10.1126/science.1258096
Edgar R. C. PILER-CR: Fast and accurate identification of CRISPR repeats // BMC Bioinformatics. 2007. Vol. 8, N 18. P. 1-6. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-18
Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity// Cellular and Molecular Life Sciences. 2014. Vol. 71, N 3. P. 449-465. https://doi.org/10.1007/s00018-013-1438-6
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Research. 2007а. Vol. 35. P. W52-W57. https://doi.org/10.1093/nar/gkm360
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to displayCRIS-PRs and to generate dictionaries of spacers and repeats // BMC Bioinformatics. 2007б. Vol. 23, N 8. P. 172. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-172
Известия Иркутского государственного университета Серия «Биология. Экология». 2018. Т. 26. С. 3-17
Hille F., Charpentier E. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2016. Vol. 371, N 1707. 12 p. https://doi.org/10.1098/rstb.2015.0496
Hsu P. D., Lander E. S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering// Cell. 2014. Vol. 157, N 6. P. 1262-1278. https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2014.05.010
Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements / F. J. M. Mojica, C. Diez-Villasenor, J. Garcia-Martinez, E. Soria// J. Mol. Evol. 2005. Vol. 60. P. 174-182.
Koonin E. V., Makarova K. S., Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems// Curr. Opin. Microbiol. 2017. Vol. 37, P. 67-78. https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.05.008
MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems / S. S. Abby, B. Neron, H. Menager, M. Touchon, E. P. C. Rocha // PLoS ONE. 2014. Vol. 9, N 10, P. e110726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110726
Makarova K. S., Wolf Y. I., Koonin E. V. The basic building blocks and evolution of CRISPR-CAS systems// Biochem. Soc. Trans. 2013. Vol. 41, N 6. P. 1392-400. https://doi.org/10.1042/BST20130038
Melo A. L., Soccol V. T., Soccol C. R. Bacillus thuringiensis: mechanism of action, resistance, and new applications: a review// Crit. Rev. Biotechnol. 2016. Vol. 36, N 2. P. 31726. https://doi.org/10.3109/07388551.2014.960793
Ohba M., Mizuki E., Uemori A. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis // Anticancer Res. 2009. Vol. 29, N 1. P. 427-433.
Prospects to Enhance Phage Therapy by Looking At CRISP Fingerprints in Bacterial Populations / V. I. Zlobin, Y. P. Dzhioev, N. P. Peretolchina, A. Y. Borisenko, L. A. Stepanenko, Y. Wang, Z. Qu, R. Pierneef, O. N. Reva // Current Trends in Biomedical Engineering & Biosciences. 2018. Vol. 10, N 5. P. 1-3.
The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit / K. Murugan, K. Babu, R. Sundaresan, R. Rajan, D. G. Sashital// Mol. Cell. 2017. Vol. 68, N 1. P 15-25. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.09.007
WebLogo: a sequence logo generator / G. E. Crooks, G. Hon, J. M. Chandonia, S. E. Brenner// Genome Res. 2004. Vol. 14, N 6. P. 1188-1190.
Detection and Analysis of CRISPR-Cas System Structures in Genome of Plasmid pYC-1 of Bacillus thuringiensis Strain YC-10
N. A. Arefieva 1, Yu. P. Dzhioev 2, A. Yu. Borisenko2, L. A. Stepanenko 2, N. P. Peretolchina2, Yu. S. Bukin3,4, V. I. Chemerilova1 , O. F. Vyatchina 1, O. A. Sekerina 2, Yu. A. Markova 5, G. V. Yurinova 1, V. P. Salovarova 1, A. A. Pristavka 1, V. A. Kuzminova 1, A. S. Martynova 1, V. I. Zlobin 2
Irkutsk State University, Irkutsk
2Irkutsk State Medical University, Irkutsk
3Limnological Institute SB RAS, Irkutsk
4Irkutsk National Research Technical University, Irkutsk
5Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
Abstract. The aim of this work was to search and analyze the structures of the CRISPR-Cas system in the genome of the plasmid pYC-1 from the strain Bacillus thuringiensis YC-10 using a selected algorithm of bioinformatics software. A search and analysis of the structures of the CRISPR-Cas-system in the genome of the plasmid pYC-1, which is a megaplasmid of the
strain B. thuringiensis YC-10, was carried out. The bioinformatical search for CRISPR-Cas-system structures included three stages: identification of cas-genes, detection of CRISPR-cassettes and analysis of their structures. Identification of cas-genes was carried out through their amino acid profile using the MacSyFinder program. The detection and analysis of CRISPR cassettes was performed using four applications: 1) CRISPRFinder; 2) CRISPRDe-tect; 3) PILER-CR; 4) CRISPR Recognition Tool (CRT). A consensus structure for multiple alignment of inter-spacer repeats was obtained and visualized in WebLogo 3. The position of the consensus sequence in the classification of CRISPR-associated repeats was determined through the CRISPRmap web service (v1.3.0). The analysis of the structure of the CRISPR locus was performed using the software platform Artemis (ver. 17.0.1). The type of CRISPR-Cas system was determined in accordance with the latest version of the classification [Koonin et.al. 2017]. As a result of a software search in megaplasmid pYC-1, one CRISPR locus was found, classified as Class I, type I, subtype C. Two CRISPR cassettes and four CRISPR-associated genes were identified. The analysis of the structure of CRISPR-cassettes. The decoded spacer sequences provide information about bacteriophages and foreign plasmids to which this bacterial strain may be resistant. The presence of a CRISPR-Cas system in the plasmid genome may indicate a possible transfer of a given locus from the bacterial chromosome to the plasmid. It can also be assumed that these systems can be transmitted by conjugation in bacterial communities. The bioinformatics algorithm used in this work showed a high efficiency of its use for the detection of CRISPR-Cas-system structures in extrachromosomal elements of the genome.
Keywords: Bacillus thuringiensis, strain YC-10, plasmids, plasmid pYC-1, CRISPR-Cas system, bioinformatic methods.
For citation: Arefieva N.A., Dzhioev Yu.P., Borisenko A.Yu., Stepanenko L.A., Peretolchina N.P., Bukin Yu.S., Chemerilova V.I. , Vyatchina O.F., Sekerina O.A., Markova Yu.A., Yurinova G.V., Salovarova V.P., Pristavka A.A., Kuzminova V.A., Martynova A.C., Zlobin V.I. Detection and Analysis of CRISPR-Cas System Structures in Genome of Plasmid pYC-1 of Bacillus thuringiensis Strain YC-10. The Bulletin of Irkutsk State University. Series Biology. Ecology, 2018, vol. 26, pp. 3-17. https://doi.org/10.26516/2073-3372.2018.263 (in Russian)
References
Peretolchina N.P., Dzhioev Yu.P., Borisenko A.Yu., Voskresenskaya E.A., Paramonov A.I., Stepanenko L.A., Kolbaseeva O.V., Zlobin V.I. Bioinformatsionnyi analiz CRISPR-Cas sistemy shtamma Yersinia pseudotuberculosis IP32953 [Bioinformational analysis of Yersinia pseudotuberculosis IP32953 CRISPR/cas system]. Acta Biomedica Scientifica, 2016, no. 5, pp. 64-68. (in Russian).
Kolbaseeva O.V., Dzhioev Yu.P., Borisenko A.Yu., Stepanenko L.A., Zlobin V.I., Kolbaseeva V. I. Detektsiya struktur CRISPR-Cas sistem v genome shtamma Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 metodami bioinformatiki [Detection of CRISPR/Cas system structure in genome of Pseudomonas aeruginosa strain UCBPP-PA14 using bioinformatic methods]. Zhurnal infektologii [Journal of Infectology], 2018. vol. 10, no. 2, pp. 62-63. (in Russian).
Borisenko A.Yu., Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., Bukin Yu.S., Stepanenko L.A., Kolbaseeva O.V., Zlobin I.V. Ispol'zovanie bioinformatsionnykh programmnykh metodov dlya poiska CRISPR-Cas sistem v genomakh shtammov Staphilococcus aureus [Use of bioinformatic methods for search CRISPR/Cas systems in genomes of the strains of Staphylococcus aureus]. Sibirskii meditsinskii zhurnal [Siberian Medical Journal], 2015, no. 2, pp. 71-74. (in Russian).
Stepanenko L.A., Dzhioev Yu.P., Borisenko A.Yu., Zlobin V.I., Kolbaseeva O.V., Malov I.V. Kharakteristika CRISPR-Cas sistem v genome Neisseria meningitidis FDAAR-GOS_214 30-31 [Characteristic of CRISPR/Cas systems in genome of Neisseria meningitidis FDAARGOS_214 30-31]. Zhurnal infektologii [Journal of Infectology], 2018, vol. 10, no. 1, pp. 30-31. (in Russian).
Makarova K.S., Wolf Y.I., Alkhnbashi O.S., Costa F., Shah S.A., Saunders S.J., Bar-rangou R., Brouns S.J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J., Terns R.M., Terns M.P., White M.F., Yakunin A.F., Garrett R.A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E.V. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol., 2015, vol. 13, no. 11, pp. 722-736. https://doi.org/10.1038/nrmicro3569
Carver T., Harris S.R., Berriman M., Parkhill J., McQuillan J.A. Artemis: an integrated platform for visualization and analysis of high-throughput sequence-based experimental data. Bioinformatics, 2012, vol. 5, no. 4, pp. 464-469. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr703
Palma L., Munoz D., Berry C., Murillo J., Caballero P. Bacillus thuringiensis toxins: an overview of their biocidal activity. Toxins, 2014, vol. 6, no. 12, pp. 3296-3325. https://doi.org/10.33 90/toxins6123296
Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu. Rev. Genet., 2011, no. 45, pp. 273-297. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132430
Nam K.H., Haitjema C., Liu X., Ding F., Wang H., DeLisa M.P., Ke A. Cas5d protein processes pre-crRNA and assembles into a cascade-like interference complex in subtype I-C/Dvulg CRISPR-Cas system. Structure, 2012, vol. 20, no. 9, pp. 1574-1584. https://doi.org/ 10.1016/j.str.2012.06.016.
Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005, vol. 151, pp. 2551-2561. https://doi.org/10.1099/mic.0.28048-0
Cheng F., Wang J., Song Z., Cheng J., Zhang D., Liu Y. Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis YC-10, a novel active strain against plant-parasitic nematodes. J. Bio-technol, 2015, vol. 210, pp. 17-18. https://doi.org/10.1016/jjbiotec.2015.06.395
Navas L.E., Amadio A.F., Ortiz E.M., Sauka D.H., Benintende G.B., Berretta M.F., Zandomeni R.O. Complete Sequence and Organization of pFR260, the Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4 Plasmid Harboring Insecticidal Genes. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2017, vol. 27, no. 1, pp. 43-54. https://doi.org/10.1159/000451056
Cong L., Zhang F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods Mol. Biol., 2015, vol. 1239, pp. 197-217. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1862-1_10
Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007, vol. 315, no. 5819, pp. 1709-1712. https://doi.org/10.1126/science.1138140
Bland C., Ramsey T.L., Sabree F., Lowe M., Brown K., Kyrpides N.C., Hugenholtz P. CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats. BMC Bioinformatics, 2007, vol. 8, no. 209, pp. 1-8. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-209
van der Oost J., Jore M.M., Westra E.R., Lundgren M., Brouns S.J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem. Sci., 2009, vol. 34, no. 8, pp. 401 -407. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2009.05.002
Rousseau C., Gonnet M., Le Romancer M., Nicolas J. CRISPI: a CRISPR interactive database. Bioinformatics, 2009, vol. 25, no. 24, pp. 3317-3318. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp586
Biswas A., Staals R.H., Morales S.E., Fineran P.C., Brown C.M. CRISPRDetect: A flexible algorithm to define CRISPR arrays. BMC Genomics, 2016, vol. 17, no. 356. https://doi.org/10.1186/s12864-016-2627-0
Lange S.J., Alkhnbashi O.S., Rose D., Will S., Backofen R. CRISPRmap: an automated classification of repeat conservation in prokaryotic adaptive immune systems. Nucleic Acids Res., 2013, vol. 41, no. 17, pp. 8034-8044. https://doi.org/ 10.1093/nar/gkt606
Doudna J.A., Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science, 2014, vol.346, no. 6213, pp. 1258096-1258099. https://doi.org/! 0.1126/science. 1258096
Edgar R.C. PILER-CR: Fast and accurate identification of CRISPR repeats. BMC Bioin-formatics, 2007, vol. 8, no. 18, pp. 1-6. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-18
Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity. Cell. Mol. Life Sci., 2014, vol.71, no. 3, pp. 449-465. https://doi.org/10.1007/s00018-013-1438-6
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Nucleic Acids Res., 2007, vol. 35, pp. W52-W57. https://doi.org/10.1093/nar/gkm360
Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRIS-PRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics, 2007, vol. 23, no. 8, pp. 172. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-172
Hille F., Charpentier E. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2016, vol.371, no. 1707, pp.20150496. DOI: 10.1098/rstb.2015.0496
Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, vol. 157, no. 6, pp. 1262-1278. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.010
Mojica F.J. M., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol., 2005, vol. 60, pp. 174-182.
Koonin E.V., Makarova K.S., Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr. Opin. Microbiol., 2017, vol. 37, pp. 67-78. https://doi.org/10.1016Zj.mib.2017.05.008
Abby S. S., Neron B., Menager H., Touchon M., Rocha E. P. C. MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems. PLoS ONE, 2014, vol. 9, no. 10, e110726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110726
Makarova K.S., Wolf Y.I., Koonin E.V. The basic building blocks and evolution of CRISPR-CAS systems. Biochem. Soc. Trans., 2013, vol.41, no. 6, pp. 1392-400. https://doi.org/10.1042/BST20130038
Melo A.L., Soccol V.T., Soccol C.R. Bacillus thuringiensis: mechanism of action, resistance, and new applications: a review. Crit. Rev. Biotechnol., 2016, vol. 36, no. 2, pp. 31726. https://doi.org/10.3109/07388551.2014.960793
Ohba M., Mizuki E., Uemori A. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res., 2009, vol. 29, no. 1, pp. 427-433.
Zlobin V.I., Dzhioev Y.P., Peretolchina N.P., Borisenko A.Y., Stepanenko L.A., Wang Y., Qu Z., Pierneef R., Reva O.N. Prospects to Enhance Phage Therapy by Looking at CRISP Fingerprints in Bacterial Populations. Current Trends in Biomedical Engineering & Biosciences, 2018, vol. 10, no. 5, pp. 1-3.
Murugan K., Babu K., Sundaresan R., Rajan R., Sashital D.G. The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit. Mol. Cell., 2017, vol. 68, no. 1, pp. 15-25. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.09.007
Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res., 2004, vol. 14, no. 6, pp. 1188-1190.
Арефьева Надежда Александровна студент
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: arefieva.n4@gmail.com
Arefieva Nadezhda Aleksandrovna Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
tel.: (3952)42-27-17
e-mail: arefieva.n4@gmail.com
Джиоев Юрий Павлович
кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник,
заведующий лабораторией,
НИИ биомедицинских технологий
Иркутский государственный медицинский
университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 тел.: (3952) 24-29-86 e-mail: alanir07@mail.ru
Борисенко Андрей Юрьевич аспирант
Иркутский государственный медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 тел.: (3952) 24-29-86 e-mail: 89500720225@mail.ru
Степаненко Лилия Александровна кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник НИИ биомедицинских технологий Иркутский государственный медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 тел.: (3952) 24-29-86 e-mail: steplia@mail.ru
Перетолчина Надежда Павловна аспирант
Иркутский государственный медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 тел.: (3952) 24-29-86 e-mail: nadine1lenz@gmail.com
Букин Юрий Сергеевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Лимнологический институт СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3
Иркутский национальный исследовательский технический университет Россия, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83
Dzhioev Yuri Pavlovich
Candidate of Sciences (Biology), Senior
Research Scientist, Head of Laboratory
Research Institute of Biomedical Technologies
Irkutsk State Medical University
1, Krasnogo Vosstaniya st., Irkutsk, Russian
Federation, 664003
tel.: (3952) 24-29-86
e-mail: alanir07@mail.ru)
Borisenko Andrei Yurievich Graduate Student Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation, tel.: (3952) 24-29-86 e-mail: 89500720225@mail.ru
Stepanenko Lilia Alexandrovna Candidate of Sciences (Medicine), Senior Research Scientist, Research Institute of Biomedical Technologies Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, 664003, Russian Federation tel.: (3952) 24-29-86 e-mail: steplia@mail.ru
Peretolchina Nadezhda Pavlovna
Graduate Student
Irkutsk State Medical University
1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk,
664003, Russian Federation
tel.: (3952) 24-29-86
e-mail: nadine1lenz@gmail.com
Bukin Yuri Sergeevich Candidate of Sciences (Biology), Senior Research Scientist Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664003, Russian Federation Irkutsk National Research Technical University
83, Lermontov st., Irkutsk, 664074, Russian Federation tel.: (3952) 42-65-04
тел.: (3952) 42-65-04 e-mail: bukinys@lin.irk.ru
Чемерилова Валентина Ивановна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: valchem@yandex.ru
Вятчина Ольга Федоровна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный университет Россия 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: olgairk3@rambler.ru
Секерина Ольга Александровна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного
Восстания, 1
тел.: (3952) 24-38-43
e-mail: o.sekerina@ismu.baikal.ru
Маркова Юлия Александровна доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-67-21 e-mail: juliam06@mail.ru
Юринова Галина Валерьевна кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: yurinova@yandex.ru
Саловарова Валентина Петровна доктор биологических наук, профессор,
e-mail: bukinys@lin.irk.ru
Chemerilova Valentina Ivanovna Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation tel.: (3952)42-27-17 e-mail: valchem@yandex.ru
Vyatchina Olga Fedorovna Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation, tel.: (3952)42-27-17 e-mail: olgairk3@rambler.ru
Sekerina Olga Aleksandrovna Candidate of Biological Sciences, Associate Professor Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, Russian Federation, 664003 tel.: (3952) 24-38-43 e-mail: o.sekerina@ismu.baikal.ru
Markova Julia Aleksandrovna
Doctor of Sciences (Biology), Senior
Research Scientist, Head of Laboratory
Siberian Institute of Plant Physiology and
Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
Russian Federation
tel.: (3952) 42-67-21
e-mail: juliam06@mail.ru
Yurinova Galina Valerievna Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation, tel.: (3952)42-27-17 e-mail: yurinova@yandex.ru
Salovarova Valentina Petrovna Doctor of Sciences (Biology), Professor,
заведующая кафедрой
Иркутский государственный университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1
тел.: (3952)42-27-17
e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Приставка Алексей Александрович кандидат биологических наук, доцент Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: pristavk@gmail.com
Кузьминова Валерия Михайловна студент
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: ewwwrye@gmail.com
Мартынова Алена Сергеевна студент
Иркутский государственный университет Россия, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952)42-27-17 e-mail: martynovalen@mail.ru
Злобин Владимир Игоревич доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заведующий кафедрой, директор, НИИ биомедицинских технологий Иркутский государственный медицинский университет
Россия, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1 тел.: (3952) 24-29-86 e-mail: vizlobin@mail.ru
Head of Department
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
tel.: (3952)42-27-17
e-mail: vsalovarova@rambler.ru
Pristavka Alexey Alexandrovich Candidate of Sciences (Biology), Associate Professor Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation, tel.: (3952)42-27-17 e-mail: pristavk@gmail.com
Kuzminova Valeria Mikhailovna Student
Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003, Russian Federation, tel.: (3952)42-27-17 e-mail: ewwwrye@gmail.com
Martynova Alena Sergeevna Student
Irkutsk State University
1, K. Marx st., Irkutsk, 664003,
Russian Federation,
tel.: (3952)42-27-17
e-mail: martynovalen@mail.ru
Zlobin Vladimir Igorevich
Doctor of Sciences (Medicine), Professor,
Academician of RAS, Head of Department,
Director, Research Institute of Biomedical
Technologies
Irkutsk State Medical University 1, Krasnogo Vosstania st., Irkutsk, Russian Federation, 664003 tel.: (3952) 24-29-86 e-mail: vizlobin@mail.ru
Дата поступления: 14.08.2018 Received: August, 14, 2018
