CC BY
64
структурный полиморфизм стафилококковых хромосомных кассет mec (SCCmec) у представителей вида Staphylococcus epidermidis, выделенных в стационарах Российской Федерации
О.А. Дмитренко1 (odmitrenko@gmail.com), С.М. Матвеев1, А.С. Анкирская2, Л.А. Любасовская2, О.В. Ковалишена3, И.Ю. Широкова3, Д.А. Попов4
1ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва
2ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва 3ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России 4ФГБУ «Научно-исследовательский центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» РАМН, Москва
Резюме
Улучшение качества инфекционного контроля возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, невозможно без совершенствования методов видовой идентификации и внутривидовой дифференциации циркулирующих микроорганизмов. Коагулазонегативные стафилококки являются одними из ведущих этиологических агентов инфекций у пациентов с первичным или вторичным иммунодефицитом. Превалирующим видом является S. epidermidis, большинство представителей которого в настоящее время резистентны к бета-лактамным антибиотикам. Устойчивость к антибиотикам данной группы стафилококков обеспечивает комплекс генов, расположенных на геномном «острове», получившем название стафилококковой хромосомной кассеты mec (SCCmec). Представлены результаты изучения структурного разнообразия SCCmec у клинических изолятов S. epidermidis, выделенных в 2009 - 2010 годах в стационарах Москвы и Нижнего Новгорода при различных формах внутрибольничной инфекции. С использованием методов ПЦР и секвенирования идентифицированы кассеты пяти типов, в том числе II, IV, VII, VIII типов, а также композитная кассета, несущая комплекс mec класса B и два комплекса генов рекомбиназ, ранее обнаруженная у метициллинрезистентного эпидемического штамма S. aureus (REMRSA-2), циркулирующего в стационарах РФ. Композитная SCCmec выявлена у 69,6% изолятов, принадлежащих к 16 сиквенс-типам, что свидетельствует о высокой степени ее мобильности. Идентифицированы новые типы SCCmec, не зарегистрированные в международной базе данных. Выявлен и охарактеризован эпидемический штамм метициллинрезистентного S. epidermidis (MRSE), распространившийся в нескольких стационарах РФ. Показано, что представители S. epidermidis являются активным резервуаром генов, контролирующих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам. SCCmec-типирование в сочетании с мультилокусным секвенированием являются эффективными инструментами внутривидовой дифференциации S. epidermidis. Ключевые слова: внутрибольничные инфекции, коагулазонегативные стафилококки, S. epidermidis, устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, генетический контроль, стафилококковые хромосомные кассеты mec (SCCmec), молекулярно-генетический мониторинг, инфекционный контроль
Structural Polymorphism of Staphylococcal Chromosomal Cassette mec (SCCmec) in Staphylococcus epidermidis Isolated from Patients in Hospitals of the Russian Federation
O.A. Dmitrenko1 (odmitrenko@gmail.com), S.M. Matveev1, A.S. Ankirskaya2, L.A. Lyubasovskaya2, O.V. Kovalishena3, I.U. Shirokova3, D.A. Popov4
1Federal State «Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology», Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow
2 Federal State Budget Institution «Acad. V.I. Kulakov Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of Ministry of Healthcare of the Russian Federationl, Moscow
3 State Medical Academy of Nizhny Novgorod State Educational Institution of Higher Professional Training of Ministry of Healthcare of the Russian Federation
4 Federal State Budget Institution Bakoulev Scientific Center for Cardiovascular Surgery of the Russian Academy of Medical, Moscow
Abstract
Quality infectional control Improvement to pathogens associated with medical care Is Impossible without Improving the methods of species identification and intraspecific differentiation of circulating microorganisms. Coagulase-negative staphylococci are among the leading causative agents of infections in patients with primary and secondary immunodeficiencies. The predominant species is S. epidermidis, the majority of which being resistant to beta-lactam antibiotics. Antibiotic resistance in this group staphylococcus provides complex of genes located on the genomic island, denominated the staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). The results of the study of the structural diversity of SCCmec in clinical isolates of S. epidermidis, identified in Moscow's and Nizhny Novgorod's hospitals in various forms of nosocomial infection (2009 - 2010). With the use of PCR and sequencing identified five types of cassettes, including II, IV, VII, VIII type, and the composite tape, the carrier complex mec class B and two recombinase gene complex, previously detected in epidemic methicillin-resistant strain of S. aureus (REMRSA-2) circulating in the hospitals of the Russian Federation. The composite SCCmec was detected in 69.6% of the isolates belonging to sequence-16 type, which indicates a high degree of mobility. Identified new types of SCCmec, not registered in an international database. Identified and characterized epidemic methicillin-resistant strain of S. epidermidis (MRSE), which spread to several hospitals of the Russian Federation. It is shown that the representatives of S. epidermidis are active reservoir genes controlling resistance to beta-lactam antibiotics. SCCmec typing in combination with multilocus sequencing are effective tools for intraspecific differentiation of S. epidermidis.
Key words: hospital-acquired infections, coagulase-negative staphylococci, S. epidermidis, resistance to beta-lactam antibiotics, genetic control, staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec), molecular and genetic monitoring, infection control
Введение
В последние два десятилетия отмечается неуклонное нарастание роли коагулазоотрицательных видов стафилококка в развитии инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Особенно велик риск возникновения инфекционных осложнений, вызванных этой группой микроорганизмов, у новорожденных с низкой массой тела, пациентов отделений интенсивной терапии (ОРИТ), у перенесших пересадку костного мозга, операцию по поводу злокачественных новообразований, множественную травму, трансплантацию, а также ВИЧ-инфицированных [9, 17, 19, 21, 22].
Коагулазоотрицательные стафилококки (CoNS) вызывают около 40% случаев нозокомиальной бактериемии и являются вторым после S. aureus возбудителем инфекций в области хирургического вмешательства у пациентов ОРИТ. Согласно результатам многочисленных исследований, более 60% клинических изолятов CoNS относятся к виду S. epidermidis [17]. Кроме того, этот микроорганизм - ведущий этиологический агент, вызывающий развитие инфекционных эндокардитов, а также биоматериал-ассоциированных инфекций. Смертность при сепсисе, обусловленном эпидер-мальным стафилококком, может достигать 27 -44,7%. Экономические потери, связанные с кате-тер-ассоциированными инфекциями кровотока, вызванными S. epidermidis, только в США ежегодно превышают 2 млрд долларов [17, 22, 28]. В связи с этим чрезвычайно важными являются не только ранняя и достоверная диагностика инфекционных осложнений, ассоциированных с данным микроорганизмом, но и разработка методов внутривидовой дифференциации, позволяющих выявлять источники и пути распространения возбудителя в стационаре, определять случаи эндогенного и экзогенного инфицирования.
К настоящему времени более 70% госпитальных изолятов S. epidermidis, выделенных при бак-
териемии, являются устойчивыми к метициллину/ оксациллину и другим бета-лактамным антибиотикам. Устойчивость к антибиотикам этой группы у представителей рода Staphylococcus обусловлена приобретением гена mecA. Данный ген кодирует белок PBP2A - транспептидазу, которая обладает сниженной аффинностью к бета-лактамным антибиотикам. Наличие этого фермента позволяет микроорганизмам выживать и размножаться в присутствии антибиотиков названной группы. Ген mecA - часть комплекса mec, который включает инсерционную последовательность IS431, а также интактные или частично делегированные регуляторные гены mecl и mecR1. Комплекс mec расположен на мобильном генетическом элементе (геномном «острове»), получившем название стафилококковой хромосомной кассеты mec, или SCCmec. Этот генетический элемент характеризуется значительным полиморфизмом структуры и в различных штаммах S. aureus варьирует как по размерам (от 21 до 67 kb), так и по набору расположенных на нем генов. Помимо комплекса mec этот геномный «остров» несет набор генов реком-биназ (ccr), ответственных за интеграцию и за «вырезание» элемента из хромосомы микроорганизма. Некоторые варианты кассет могут иметь дополнительные гены антибиотикорезистентности, а также гены, кодирующие факторы патогенности [8, 14, 15]. Согласно современной классификации подобного рода мобильных генетических элементов, представленной на сайте Международной рабочей группы по классификации элементов SCCmec (IWG-SCC) (www.sccmec.org/Pages/Scc_ClassificationEN. htlm), выделяют 11 типов кассет. Разделение на типы основано как на различиях в структуре комплекса mec (шесть классов - A, B, C1, C2, D, E), так и на особенностях комплексов ccr (восемь типов). Недавно охарактеризованный XI тип SCCmec несет не ген mecA, а его гомолог, имеющий не более 70% общего с геном mecA нуклеотидного состава [24].
Помимо генов комплексов mec и ccr в ряде случаев дополнительно исследуют генетическую область J1 (от англ. «junkyard» - задворки) в составе кассет mec. Структурные различия этой области позволяют дифференцировать кассеты IV типа на подтипы.
SCCmec-типирование интенсивно используется для внутривидовой дифференциации метициллин-резистентных S. aureus (MRSA) и, наряду с другими методами молекулярно-генетического типирова-ния, такими как мультилокусное и сингл-локусное секвенирование, успешно применяется для характеристики эпидемических штаммов MRSA [11, 13]. Вместе с тем число публикаций, посвященных изучению генетического разнообразия SCCmec у CoNS, в зарубежной литературе немногочисленно [12, 20, 24]. В России подобного рода исследования ранее не проводились.
Цель настоящей работы - изучить особенности строения и распределения типов SCCmec у изолятов S. epidermidis, вызвавших различные нозологические формы внутрибольничной инфекции в стационарах страны, и оценить роль типирова-ния SCCmec для внутривидовой дифференциации представителей этого вида.
Материалы и методы
Исследовалось 46 изолятов S. epidermidis (из крови - 20 изолятов, из отделяемого пупочной раны - пять, из конъюнктивы - 17, из мочи - два, из флегмоны - один, из легких погибшего новорожденного - один изолят), выделенных в 2009 -2010 годах в Научном центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева (I), в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова (II), а также в родильных домах Нижнего Новгорода (III). Для получения чистой культуры изоляты рассевали до моноколоний на солевом агаре с маннитом (ВюМепеих, Франция), с добавлением взвеси желтка куриного яйца в конечной концентрации 5%. Коагулазную активность определяли с использованием лиофилизированной плазмы крови кролика производства НПО «Микроген». Определение чувствительности к оксациллину было проведено методом дисков согласно методическим указаниям [6], также использовали метод определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) с помощью анализатора Vitek® 2 Compact (ВюМепеих) и метод стандартных разведений с использованием агара Мюллера-Хинтона (ВюМепеих). Оценка чувствительности к антибиотикам проводилась согласно критериям CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) [10].
Для выделения ДНК отдельные изолированные типичные колонии выращивали в бульоне, содержащем сердечно-мозговую вытяжку (ВюМепеих). Выделение ДНК проводили согласно методике, описанной ранее [2]. Идентификация до вида проводилась с использованием секвенирования гена tuf (translation elongation factor Tu) [1].
Дифференциация SCCmec осуществлялась на основании идентификации комплексов mec, комплексов генов рекомбиназ и анализа области J1 с использованием моно- и мультиплексных ПЦР с применением праймеров и условий амплификации, предложенных Y. Kondo и соавт. [18].
Для идентификации комплекса mec класса С1 использовали праймеры, разработанные E. Ruppe и соавт. (2009) [24]. С целью возможной идентификации недавно охарактеризованной SCCmec XI типа, несущей гомолог гена mecA -ген mecALGA251, или, согласно новой номенклатуре, mecC, использовали ПЦР, разработанную M. Stegger и соавт. (2012) [25].
Все праймеры были синтезированы фирмой «Евроген» (Москва). ПЦР-амплификацию проводили в объеме 25 мкл реакционной смеси, которая включала: амплификационный буфер 2,5 мкл (10x) с pH 8,6, 2,5 мМ каждого дезоксирибону-клеотидтрифосфата (смесь dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,4 мкл Tag-полимеразы (5 ед/мкл) фирмы «Си-лекс» (Москва), по 1 мкл каждого праймера, 1 мкл ДНК-матрицы; деионизированную воду добавляли до конечного объема 25 мкл. Концентрация праймеров и количество MgCl2 могли изменяться в зависимости от свойств праймеров. Амплификацию ДНК осуществляли в термоциклере «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Москва). Визуализацию продуктов реакции осуществляли методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с добавлением этидиум-бромида.
Типирование на основе мультилокусного секве-нирования выполнили согласно протоколу, предложенному J.C. Thomas и соавт. [27].
Секвенирование отдельных амплифицирован-ных фрагментов стафилококковых хромосомных кассет после выделения из геля и последующей очистки с использованием набора GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Великобритания) выполнили в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта).
В качестве контрольных использовали штаммы EMRSA-1 (SCCmec III: комплекс mec класса A, ccr3), EMRSA-2 (SCCmec IV: комплекс mec класса B, ccr2) и EMRSA-3 (комплекс mec класса B, ccr1), полученные из Центральной лаборатории народного здравоохранения Лондона. Результаты сек-венирования были проанализированы с использованием программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ресурса NCBI (http://www.ncbi.nim. nih.gov).
Результаты и обсуждение
Идентификация генных комплексов, кодирующих синтез рекомбиназ
Были идентифицированы генные комплексы, характерные для рекомбиназ типов: 1 (ccrA1B1), 2 (ccrA2B2), 4 (ccrA4B4) и 5 (ccrC1). Содержали по два генных комплекса типов 1 и 2 - 33 (71,7%)
изолята (табл. 1 и рис. 1). Помимо комплексов ccr типов 1 и 2 один изолят (№ NN804), выделенный из крови новорожденного, нес комплекс ccr типа 5. Поскольку идентификация комплексов ccrl и ccr2 в одном и том же изоляте была возможна только при использовании моно-ПЦР для подтверждения специфичности образовавшихся ампликонов, у случайно отобранного изолята (№ Мст35) определили нуклеотидную последовательность амплико-нов, образовавшихся при использовании прайме-ров, выявляющих наличие комплексов ccrl и ссг2. Было установлено, что гомология последовательности ccrl с ранее зарегистрированными подобными последовательностями в базе генного банка составляет 70,4%, что позволяет рассматривать выявленную последовательность как новый алло-тип генов комплекса ccrl [16]. Гомология последовательности ccr2 составила 98,7%, что характерно для SCCmec IV типа. Обе последовательности занесены в генный банк под номерами KFKF154274 и KF042470 соответственно.
Идентификация комплексов mec
Были идентифицированы комплексы mec классов A, B, C2, которые образовали соответствующие ампликоны со специфичными праймерами. Доминировал комплекс mec класса B, который был обнаружен у 34 (73,9%) изолятов. С праймерами, выявляющими фрагмент комплекса mec класса C1, у имевшихся в нашей коллекции изолятов коа-гулазонегативных стафилококков, принадлежащих к различным видам, образовалось два типа ампликонов: один - размером 300 н.п., другой - более 1000 н.п. Оба ампликона были проанализированы методом секвенирования. Консенсусная последовательность для ампликона размером 300 н.п. составила 235 н.п. Была выявлена ее 100%-ная гомология с последовательностью фрагментов гена mecA и транспозона tn431 у штамма JCSC6945, представленного как типичный для идентификации комплекса mec класса C1 у SCCmec X. Таким образом, амплифицированный фрагмент оказался специфичным для комплекса mec класса C1. У пяти изолятов идентифицировать комплекс mec не удалось. Они не образовали характерных амплико-нов с праймерами, выявляющими специфические нуклеотидные последовательности известных комплексов mec. Три из них тем не менее несли ген mecA. У двух других, несмотря на устойчивость к оксациллину, выявленную при использовании фе-нотипических методов, ген mecA и его известный к настоящему времени гомолог - ген mecC - выявить не удалось.
Идентификация особенностей строения генетической области J1.
Двадцать семь изолятов несли вариант J1a, три - содержали вариант J1b, и два изолята имели вариант J1c. Ни у одного из изолятов не был обнаружен вариантJ1d.
Идентификация SCCmec
Как видно из данных, представленных в таблице 1, у изолятов S. epidermidis по результатам идентификации генных комплексов mec и ccr были идентифицированы кассеты II, IV, VII, VIII типов, а также композитная кассета, несущая комплекс mec класса B и два комплекса генов рекомбиназ: ccrA1B1 (ccrl) и ccrA2B2 (ccr2). Доминировали изо-ляты, несущие композитную кассету. Данный тип кассет был выявлен у 32 (69,6%) изолятов, принадлежащих к различным сиквенс-типам. Преобладал вариант кассеты, несущей область Jla, который обнаружили у 25 (54,3%) изолятов.
Варианты кассеты с фрагментами Jlb и Лс обнаружили у трех и двух изолятов соответственно. У двух изолятов идентифицировать область J1 не удалось.
На втором месте по распространенности была кассета IV типа, которая несет комплекс mec класса В в сочетании с генами рекомбиназ типа 2. Этот тип кассет обнаружили у трех изолятов, при этом у двух из них область J1 была представлена вариантом J1a, а у одного изолята эту область идентифицировать не удалось. У единичных изолятов обнаружили кассеты II, V и VII типов. У двух изолятов была обнаружена кассета VIII типа, несущая комплекс mec класса А и 4-ый тип генов рекомбиназ. У изолята № Mcp211 образовался ампликон, специфичный для комплекса mec типа A. Однако ампликоны, характерные для рекомбиназ 2-го или 3-го типа, которые совместно с комплексом mec типа А образуют кассету II или III типа соответственно, не образовались. При амплификации ДНК, выделенной из этого штамма, образовался ампликон, специфичный для рекомбиназы типа 5 (С1), характерной для кассет V и VII типов. В связи с этим была проведена ПЦР с праймерами, выявляющими присутствие комплексов mec С1 и mec С2, специфичных для кассет этих типов. При использовании праймеров, определяющих наличие комплекса mec класса C1, был получен ампликон размером около 1000 н.п. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента и последующий анализ результатов секвенирования с использованием программы BLAST показали, что эта последовательность имеет 99%-ную гомологию с регуляторной областью mecRl гена mecA в штамме ST228, представленном в генном банке. Данная область специфична для комплекса mec типа А. Таким образом, результаты секвенирова-ния подтвердили наличие комплекса mec типа А у данного изолята и отсутствие у него комплекса mec класса C1, так как ген mecR1 комплекса mecCl частично делетирован. Полученные результаты позволили идентифицировать у данного изолята новый, отсутствующий в базе данных S. aureus тип кассет, содержащий комплекс mec типа A в сочетании с генами рекомбиназ типа 5 (ccrC1). У одного изолята (№ NN804) были выявлены комплекс mec класса C2 и комплекс рекомбиназ типа 5,
специфичные для кассеты V типа. Однако у этого изолята дополнительно было выявлено два комплекса генов рекомбиназ: ccrl и ссг2. Вероятно, данный изолят также содержит новый, не идентифицированный ранее тип кассет.
У пяти изолятов нам не удалось идентифицировать тип кассеты. У изолята № Mcp810-2, принадлежащего к ST59, был обнаружен комплекс рекомбиназ типов 1 и 2 и идентифицирована область J1a, но, несмотря на наличие гена mecA, идентифицировать комплекс mec не удалось. У изолята № 835-2 были идентифицированы ген mecA и комплекс ccr5. Еще у трех изолятов не смогли получить специфических продуктов амплификации ни с одним из использованных праймеров. При определении чувствительности этих изолятов к оксациллину методом дисков они проявляли к нему вариабельную устойчивость. В связи с этим их чувствительность к оксациллину исследовали методом стандартных разведений в агаре. Для изолята № 780, не содержащего генов mecA и mecC, минимальная ингибирующая концентрация превышала 0,5 мкг/мл. Рост двух других изолятов (№ Mcv12 и Mcp835-1) наблюдали только на среде с содержанием оксациллина 0,25 мкг/мл. Согласно критериям CLCI, к категории чувствительных к оксациллину следует относить изоляты CoNS, для которых МИК < 0,25 мкг/мл, к категории устойчивых - изоляты, для которых МИК > 0,5 мкг/мл. В соответствии с этими критериями данные изоляты необходимо отнести к категории резистентных к оксациллину. Только один из этих изолятов (№ Mcp835-1) нес ген mecA. Ни у одного из изолятов не обнаружили SCCmec III.
Распределение SCCmec среди изолятов, относящихся к различным сиквенс-типам по результатам мультилокусного секвенирования
Согласно результатам мультилокусного секвенирования изоляты S. epidermidis были распределены на 21 сиквенс-тип (ST). Доминировал ST59, к которому были отнесены 19, или 40,4%, изолятов. Изоляты этого сиквенс-типа были выделены в стационарах как Москвы, так и Нижнего Новгорода. Остальные сиквенс-типы были представлены од-ним-двумя изолятами [5]. Как видно из данных, представленных в таблице 1, композитная SCCmec была обнаружена у изолятов, отнесенных к 16 сик-венс-типам, при этом она доминировала и среди изолятов наиболее распространенного ST59. Преобладал подтип кассет SCCmec-CIa. Именно этот аллельный вариант кассет был обнаружен у изолятов, отнесенных к данному сиквенс-типу, выделенных в разных стационарах Москвы и Нижнего Новгорода (табл. 2). Это позволяет говорить об эпидемическом распространении S. epidermidis сиквенс-типа ST59, несущих данный аллотип SCCmec. Кассета IV типа также была обнаружена в геноме изолятов сиквенс-типов ST4 и ST59. Кассета VIII типа была обнаружена в геноме изо-лятов двух сиквенс-типов: ST2 и ST22. Кассеты V и
VII типов были обнаружены у изолятов ST5 и ST266 соответственно. Изоляты, отнесенные по результатам секвенирования к наиболее распространенному сиквенс-типу ST59 (n = 19), содержали SCCmec разных типов: II (один изолят), IV (два изолята), а также композитный тип (14 изолятов), у двух изолятов идентифицировать SCCmec не удалось.
Новый тип кассет, у которого комплекс mec класса A сочетался c генами рекомбиназ 5-го типа, был обнаружен в геноме только одного из изолятов 22-го сиквенс-типа. Еще у одного изолята -ST2 - комплекс mec класса C2 сочетался с генами рекомбиназ трех типов: ccrl, ccr2 и ccr5.
Характеристика изолятов S. epidermidis, выделенных в разных стационарах
Как видно из данных, представленных в таблице 1, у 18 изолятов, выделенных в стационаре 1, были обнаружены кассеты нескольких аллоти-пов, в том числе SCCmec-CI (четыре подтипа), а также кассеты VII и VIII типов. Несмотря на то что SCCmec-CI доминировала, ее структура у изолятов разных сиквенс-типов была неоднородной. Так, SCCmec-CIa была обнаружена у изолятов пяти сиквенс-типов: ST6, ST20, ST59, ST174 и ST189; SCCmec-CIb - у изолятов трех сиквенс-типов: ST10, ST54 и ST264. Оба изолята ST23 несли аллотип SCCmec-CI^ а один из изолятов ST174 нес аллотип SCCmec-CI, у которого область J1 идентифицировать не удалось. Не было выявлено доминирующего сиквенс-типа, несущего определенный вариант кассет. Двадцать шесть изолятов, выделенных в стационаре 2, относились к девяти сиквенс-типам. У них были обнаружены кассеты пяти типов: II, IV (подтип «а» и неидентифицированный), SCCmec-CIa, SCCmec-CIb, SCCmec VIII, SCCmec-new (комплекс mecA, ccr5). Как видно из данных, представленных в таблицах 1 и 2, превалировали изоляты (65,3%), отнесенные по результатам MLST к сиквенс-типу 59, которые можно было дифференцировать на основании различий в структуре SCCmec. При этом 10 (62,5%) из 16 изолятов ST59 содержали SCCmec-CIa. Изоляты, выделенные в стационаре 3, принадлежали к разным сиквенс-типам и несли разные типы кассет.
Проведенные исследования позволили идентифицировать SCCmec у 41 (89,1%) тестированного изолята S. epidermidis. Полученные данные о наличии семи типов кассет (или более десяти, включая подтипы) у изученной немногочисленной выборки изолятов, выделенных в нескольких стационарах, свидетельствуют о значительном структурном разнообразии геномных «островов», кодирующих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам у представителей вида S. epidermidis. Доминирующим типом SCCmec оказался композитный тип, несущий комплекс mec класса B и два комплекса генов рекомбиназ типов 1 и 2.
Согласно современной классификации, комплекс mec класса В несут либо кассеты I типа, у ко-
Таблица 1.
Особенности структуры геномных «островов», кодирующих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам у представителей вида S. epidermidis (п = 46)
Лабораторный №/где выделен Источник выделения ST Число Ген mecA Класс mec Тип ccr Тип J1 Тип SCCmec Число
Mcv 60 (I) Кровь 2 1 + A 4 - VIII 1
NN 804 (III) Кровь 1 + С2 5, 1, 2 a New 1
Mcv 21(I) Кровь 6 1 + B 1,2 а SCC- Cía 1
Mcv 12 (I) Кровь 7* 1 - н/и н/и н/и н/и 1
Mcv 35 (I) Кровь 10 1 + B 1,2 b SCC- CIb 1
Mcp 954 (II) Кровь 16 1 + B 1,2 a SCC- CIa 1
Mcv 40 (I) Кровь 19 1 + С1 5 b VII 1
Mcv 11(I) Кровь 20 1 + B 1,2 a SCC- CIa 1
Mcp 530 (II) Mcp 211 (II) Конъюнктива Конъюнктива 22 2 + + A A 4 5 - VIII (A4) New (A5) 1 1
Mcv 48 (I) Mcv 45 (I) Кровь Кровь 23 2 + + B B 1,2* 1, 2 с c SCC- CIc SCC- CIc 1 1
Mcp 780 (II) Кровь 32* 1 - н/и** н/и - н/и 1
Mcv 6 (I) Кровь 54 1 + B 1,2* b SCC- CIb 1
(I, II, III) 59 19 + + + + + + A B B B н/и н/и 2 2 2 1,2 н/и 1,2 a н/и a н/и a II IVa IV SCC-CIa н/и н/и 1 1 1 14 1 1
Mcp 955 (II) Конъюнктива 81 1 + B 2 a IVa 1
Mcv 5 (I) Mcv 41 (I) Кровь Кровь 83 2 + + B B 1,2* 1,2 a a SCC-CIa SCC-CIa 1 1
Mcp1131 (II) Кровь 87 1 + B 1,2 н/и SCC-CI 1
Mcv 4 (I) Mcv 52 (I) Кровь Кровь 174 2 + B 1,2 н/и a SCC-CI SCC-CIa 1 1
Mcv 59 (I) Кровь 189 1 + B 1,2 a SCC-CIa 1
Mcv 30 (I) Кровь 248 1 + B 1,2 a SCC-CIa 1
Mcv 55(I) Кровь 264 1 + B 1,2 b SCC-CIb 1
Mcp 763-2 (II) Mcp 736-2 (II) Пупочная рана Конъюнктива 265 2 + B B 1,2 1,2 a a SCC-CIa SCC-CIa 1 1
Mcp 835-2 (II) Пупочная рана 266 1 + н/и 5 н/и 1
Mcp 357 Конъюнктива 269 1 + В 1, 2 a SCC-CIa 1
Примечание: изоляты S. epidermidis были выделены в:
I - Научном центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева; II - Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова; III - родильных домах Нижнего Новгорода
*Комплекс ссг удалось идентифицировать только при увеличенном количестве ДНК-матрицы **Не идентифицирован
торых он сочетается с генами рекомбиназ типа 1, либо кассеты IV типа, у которых он сочетается с генами рекомбиназ типа 2. Поскольку у многих тестированных изолятов Б. ер№егт№1'э присутствовали кассеты IV типа, можно предположить, что ре-
комбинантная кассета, несущая два комплекса генов - ссг1 и ссг2, сформировалась именно на основе кассеты IV типа путем приобретения дополнительного комплекса генов рекомбиназ. О сходстве выявленной композитной кассеты и SCCmec IV
Таблица 2.
Структурное разнообразие стафилококковых хромосомных кассет mec (SCCmec) у изолятов S. epidermidis, относящихся к ST59 (n = 19).
Город Стационар № Источник выделения Ген mecA Класс mec Тип ссг Тип J1 Тип SCCmec
Москва I McvB Кровь + B 1,2 a SCC- Cla
Mcv 5B Кровь + B 1,2 a SCC- Cla
II Mcp754 Пупочная рана + B 2 a IVa
Mcp 764-1 Пупочная рана + B 1,2* a SCC- Cla
Mcp B35-1 Пупочная рана + н/и н/и - н/и
Mcp922 Моча + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp 403 Моча + B 2 н/и** IV
Mcp B10-2 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp900 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp216 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp 261-1 Конъюнктива + B 1,2* a SCC- Cla
Mcp 1097-2 Конъюнктива + B 1,2* a SCC- Cla
Mcp B10-1 Конъюнктива + н/и 1,2 a н/и
Mcp 557 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp124 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp 36B-2 Конъюнктива + A 2 - ll
Mcp 2B6 Конъюнктива + B 1,2 a SCC- Cla
Mcp12T Ткань легких + B 1,2 a SCC- Cla
Нижний Новгород III NN B07 Флегмона + B 1,2 a SCC- Cla
Примечание: изоляты S. epidermidis были выделены в:
I - Научном центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева; II - Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова; III - родильных домах Нижнего Новгорода
*комплекс ссг1 удалось идентифицировать только при увеличенном количестве ДНК-матрицы **Не идентифицирован
свидетельствуют данные секвенирования комплекса ccr2 у изолята № Mcp754, несущего SCCmec IV типа, и у изолята № Mcp261-1 с композитным типом кассет.
Дополнительным доказательством этого предположения является наличие области J1a (характерно для кассет именно IV типа) как у изолятов, несущих кассету IV типа, так и у изолятов с композитным типом кассет. Оба типа кассет мобильны, поскольку обнаружены в геноме изолятов, принадлежащих к нескольким сиквенс-типам, согласно данным MLST.
Интересно, что еще в 2005 году нами было показано, что один из трех эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в стационарах РФ, а именно REMRSA-2, отнесенный по результатам исследования полиморфизма структуры гена, кодирующего протеин А (spa-типирование), к типу t-008, несет такой же композитный тип кассет [3, 4].
Поскольку мы не обнаружили публикаций в зарубежной научной литературе, в которых упоминалось бы наличие подобного генетического элемен-
та у S. aureus, выделенных в других странах мира, полученные данные позволяют предположить, что REMRSA-2 сформировался именно в стационарах России в конце 90-х годов прошлого века в результате приобретения композитной SCCmec от S. epidermidis. Интересно, что недавно появились сообщения о выделении изолятов S. epidermidis, несущих несколько комплексов рекомбиназ [24], а исследователи из Швеции также обнаружили у S. epidermidis SCCmec, несущую два комплекса генов ccr - типов 1 и 2 - и комплекс mec класса B [26]. Дальнейшее, более детальное исследование структурных особенностей композитной кассеты у разных видов стафилококка, выполненное методом секвенирования, так же как и исследование более ранних изолятов S. epidermidis, позволит подтвердить или опровергнуть высказанную гипотезу.
Особого внимания заслуживает и обнаружение изолятов S. epidermidis, несущих кассету VIII типа, представленную комплексом mec класса A и генами ccr типа 4. Как недавно было показано, отличительной особенностью кассет mec II, III и VIII ти-
Рисунок 1.
Электрофореграмма результатов тестирования ДНК клинических изолятов S. epidermidis на одновременное присутствие генов комплексов тсг 2-х типов
пов, которые в своей структуре имеют комплекс mec класса A, является наличие в его составе гена psm-mec, кодирующего синтез фенолрастворимого модулина альфа-типа - цитолитического токсина, мишенью действия которого являются нейтрофилы.
В отличие от S. aureus, большая часть изолятов которого в коровой части генома несет ген, кодирующий фенол-растворимый модулин именно альфа-типа, у CoNS присутствует ген, кодирующий синтез фенолрастворимого модулина бета-типа, который существен для формирования биопленок, но обладает значительно меньшей цитолитической активностью по сравнению c альфа-типом. Приобретение дополнительного гена, кодирующего синтез высокоактивного цитолитического токсина, может приводить к повышению вирулентности микроорганизма, поэтому интеграция кассеты VIII типа - крайне важное генетическое событие, способствующее формированию S. epidermidis как патогена [23].
Немаловажен и факт выявления изолятов S. epidermidis, у которых не удалось идентифицировать тип SCCmec. Эти данные свидетельствуют о наличии еще неизвестных типов кассет и механизмов резистентности к оксациллину у CoNS. С учетом возможности межвидовой передачи устойчивости к метициллину от S. epidermidis к S. aureus в организме больного во время антибиотикотерапии [7] результаты исследования еще раз подчеркива-
ют роль S. epidermidis как резервуара генов анти-биотикорезистентности и источника новых кассет mec для S. aureus.
Выводы
1. Выявлено значительное разнообразие стафилококковых хромосомных кассет mec у представителей вида S. epidermidis - возбудителей внутрибольничных инфекций.
2. Подтверждена значимость CoNS как резервуара новых SCCmec и генов антибиотикорезистент-ности для представителей рода Staphylococcus.
3. Идентифицирован эпидемический штамм MRSE, показано его распространение в нескольких стационарах РФ.
4. Выявлены новые типы SCCmec.
5. Охарактеризован новый аллотип генов комплекса рекомбиназ ccrl.
6. SCCmec-типирование S. epidermidis целесообразно включить в схему инфекционного контроля возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в стационарах РФ как один из этапов молекулярно-генетиче-ского мониторинга.
Результаты исследования были частично доложены на XIII Международном конгрессе МАКМАХ/ ESCMID по антимикробной химиотерапии (Москва, 18 - 20 мая 2011 г.). Ш
Литература
1. Воронина О.Л., Кунда М.С., Дмитренко О.А. и др. Оценка видового разнообразия коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009 - 2010 гг. // Журнал микробиологии. 2011. № 1. С. 3 - 8.
2. Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Прохоров В.Я. и др. Молекулярно-генетическое типирование метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в разных регионах Российской Федерации, на основании изучения размеров продукта амплификации и последующего ре-стрикционного анализа коагулазного гена // Журнал микробиологии. 2005. № 4. С. 46 - 52.
3. Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Исследование полиморфизма тесДНК у метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка, выделенных в стационарах разных регионов России // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 3. С. 11 - 17.
4. Дмитренко О.А. Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину: Автореф. дис. ... д.м.н. - М.: 2008. - 43 с.
5. Дмитренко О.А., Воронина О.Л., Кунда М.С. и др. Особенности популяционной структуры множественно-устойчивых к антибиотикам коагулазоне-гативных стафилококков в стационарах различного профиля // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2011. Т. 13. № 2. Приложение 4. С. 14.
6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. МУК 4.2.1890-04. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с.
7. Bloemendaal A.L., Brouwer E.C., Fluit A.C.. Methicillin resistance transfer from Staphylococcus epidermidis to methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in a patient during antibiotic therapy // PLoS One. 2010. V. 5 (7). P. e11841.
8. Chatterjee S.S., Chen L., Joo H.-S. et al. Distribution and regulation of the mobile genetic element-encoded phenol-soluble modulin psm-mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus // PLoS One. 2011. V. 6. Iss. 12. P. e28781.
9. Cheung G.Y., Otto M. Understanding the significance of Staphylococcus epidermidis bacteremia in babies and children // Curr. Opin. Infect. Dis. 2010. doi:10.1097/QC0.0b013e328337fecb.
10. Performance standarts for antimicrobial susceptibility testing eighth information supplement, CLSI document. - Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI), Wane, PA, USA, 2009.
11. Enright M.C., Robinson D.A., Randle G. et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // PNAS. 2002. V. 99. P. 7685 - 7692.
12. Garza-Gonzalez E., Lopez D., Pezina C. et al. Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec structures in coagulase-negative staphylococci and relationship to drug resistance // J. Med. Microbiol. 2010. V. 59 ( 3). Р. 323 - 329.
13. Grundmann H., Aanensen D.M., van Wijngaard C.C. et al. Geographic distribution of Staphylococcus aureus causing invasive infections in Europe: a molecular-epidemiological analysis // PLOS Medicine. 2010. V. 7 (1). P. e1000215.
14. Ito T., Katayama Y., Hiramatsu K. Cloning and nucleotide sequence determination of entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. V. 45 (6). P. 1449 - 1458.
15. Ito T., Katayama Y., Asada K. et al. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45 (5). P. 1323 - 1336.
16. International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for reporting novel SCCmec elements // Antimicrob. Agents and Chemother. 2009. V. 53 (12). P. 4961 - 4967.
17. Kanafani Z.A., Fowler V.G. Staphylococcus aureus infections: new challenges from old pathogen // Enfermed. Inf. Microbiol. Clin. 2006. V. 24 (3). Р. 182 - 193.
18. Kondo Yo, Ito T., Ma Xiao Xue et al. Combination of multiplex PCRs for Staphylococcus cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr and major differences in junkyard regions // Antimicrob. Agents and Chemother. 2007. V. 51 (1). Р 264 - 274.
19. Krediet T.G., Mascini E.M., van Rooij E. et al. Molecular epidemiology of coagulase-negative staphylococci causing sepsis in a neonatal intensive care unit over an 11-year period // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42 (3). Р. 992 - 995.
20. Mombach Pinheira Machado A.B., Reiter K.C., Paiva R.M., Barth A.L. Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) types I, II, III and IV in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brasil // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56. Pt. 10. Р. 1328 - 1333.
21. Otto M. Staphylococcus epidermidis - the «accidental» pathogen // Nat. Rev. Microbiol. 2009. V. 7 (8). Р. 555 - 567.
22. Otto M. Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections // Semin. Immunopathol. 2012. V. 34 (2). P. 201 - 214.
23. Queck S.Y., Khan B.A., Wang R. et al. Mobile genetic element-encoded cytolysin connects virulence to methicillin resistance in MRSA // PLoS Pathog. 2009. V. 5 (7). P. e1000533.
24. Ruppe E., Barbier F., Mesli Y. et al. Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec structures in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus strains among out patients from four countries // Antimicrob. Agents and Chemother. 2009. V. 53 (2). Р. 442 - 449.
25. Stegger M., Andersen P.S., Kearns A. et al. Rapid detеction and typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus harboring either mecA or the new mecA homologue mecA LGA25±// J. Clin. Microbiol. 2012. V. 18 (4). P. 395 - 400.
26. Swenson K., Hellmark B., Soderquist B. Characterization of SCCmec elements in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis isolated from blood cultures from neonates during three decades // APMIS. 2011. V. 119 (12). Р. 885 - 893.
27. Thomas J.C., Vargares M.R., Miragaia M. et al. Improved multilocus sequence scheme for Staphylococcus epidermidis // J. Clin. Microbiol. 2007. V. 45 (2). Р. 616 - 619.
28. Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S.M. et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study // Clin. Infect. Dis. 2004. V. 39. Р. 309 - 317.
информация воз
Всемирный день борьбы с гепатитом
Ежегодно 28 июля по инициативе ВОЗ в мире отмечают Всемирный день борьбы с гепатитом, цель которого - привлечь внимание к вирусным гепатитам, показать какую серьезную угрозу здоровью людей они в себе таят. Дата выбрана не случайно - это день рождения лауреата Нобелевской премии профессора Баруха Самюэля Бламберга, открывшего вирус гепатита В.
Девиз Всемирного дня 2013 года: «Это гепатит. Знайте его. Защищайтесь от него».
Во Всемирный день борьбы с гепатитом открывается возможность привлечь внимание к проблемам вирусных гепатитов и к тому, как и какими путями они решаются, в частности - к эффективности вакцинопрофилактики.
По оценкам экспертов, в мире около 240 млн человек страдает хроническим гепатитом В (ГВ) и примерно 150 млн - хроническим гепатитом С (в России за 6 мес 2013 г. соответственно - 8728 и 28 622 человека),
Веротность развития хронического ГВ: у детей до шести лет составляет 80 - 90% и у детей первого года жизни - 30 - 50%; у здоровых взрослых -менее пяти процнтов.
15 - 25% взрослых людей, инфицированных вирусом ГВ в детстве, умирают от рака или цирроза печени, обусловленных ГВ - ежегодно около 600 тыс. человек.
Источник: www.who.int
