CC BY
84
Вариабельность генов рекомбиназ и mecA стафилококковой хромосомной кассеты Staphylococcus haemolyticus
А. В. ПОЛОНСКАЯ', *М. А. КОРНИЕНКО', А. И. МАНОЛОВ', Н. С. КУПЦОВ', Г. Б. СМИРНОВ', Л. А. ЛЮБАСОВСКАЯ2, Т. В. ПРИПУТНЕВИЧ2, Е. А. ШИТИКОВ', Е. Н. ИЛЬИНА'
' Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА, Москва
2 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В. И. Кулакова, Москва
Variability of Recombinase Genes and Staphylococcal Cassette Chromosome mecA of Staphylococcus Haemolyticus
A. V. POLONSKAYA', *M. A. KORNIENKO', A. I. MANOLOV', N. S. KUPTSOV', G. B. SMIRNOV', L. A. LYUBASOVSKAYA2, T. V. PRIPUTNEVICH2, E. A. SHITIKOV', E. N. ILINA'
' Federal Research & Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow 2 National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V. I. Kulakova, Moscow
Коагулазо-отрицательные стафилококки (КОС), в частности Staphylococcus haemolyticus, играют важнейшую роль в этиологии внутрибольничных инфекций. Большинство КОС обладают устойчивостью к бета-лактамныш антибиотикам, которая реализуется за счёт продукции второго пенициллин-связывающего белка. Этот белок кодируется геном mecA и, совместно с генами рекомбиназ (ccr), входит в состав мобильного элемента стафилококков — стафилококковой хромосомной кассеты. В ходе исследования на коллекции из 142 геномов S.haemolyticus проведён анализ генов mecA и ccr. Ген mecA быш выявлен в 117 геномах (82,4%) и обладал выраженной консервативностью. На основании анализа последовательностей генов рекомбиназ установлено, что 118 образцов (83%) содержат ccr, причём описано 22 различных сочетания наличия гена mecA и генов рекомбиназ. Наиболее распространённым вариантом для S.haemolyticus явилось сочетание ccrA4B4 (25%). Для оценки вариабельности генов рекомбиназ предложены типо-специфические праймеры, работа который была валиди-рована на 54 клинических изолятах.
Ключевые слова: коагулазо-отрицательные стафилококки, S.haemolyticus, SCCmec, устойчивость к fi-лактамным антибиотикам
Coagulase-negative staphylococci (CNS), in particular Staphylococcus haemolyticus, play an important role in the etiology of nosocomial infections. Most CNS are resistant to beta-lactam antibiotics, which is realized through the production of the second penicillin-binding protein. This protein is encoded by the mecA gene and, together with the genes of recombinases (ccr), is part of the mobile element of staphylococci — the staphylococcal cassette chromosome. During the study, the mecA and ccr genes were analyzed using a collection of 142 genomes of S.haemolyticus. The mecA gene was detected in 117 genomes (82.4%) and had a pronounced conservation. Based on the analysis of recombinase gene sequences, it was established that 118 samples (83%) contain ccr, and 22 different combinations of the mecA and recombinase genes presence are described. The combination of ccrA4B4 was the most common for S.haemolyticus (25%). Type-specific primers were proposed, to assess the variability of recombinase genes, their performance was validated on 54 clinical isolates.
Keywords: coagulase-negative staphylococci, S.haemolyticus, SCCmec, resistance to fl-lactam antibiotics
Введение
Стафилококковая инфекция занимает одну из лидирующих позиций по частоте встречаемости в медицинской практике. При этом в последнее время наблюдается тенденция к возрастанию роли условно-патогенных коагулазо-отрицатель-ных стафилококков (КОС), а именно Б.НаетоуИ-еш, 8.гр1йггт1сИ$, Бмагпгп, в развитии внутри-больничных инфекций. КОС являются возбуди-
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а. ФНКЦ ФМБА
телями около 30% случаев внутрибольничных инфекций кровотока, ассоциированных с использованием катетеров [1], их выявляют у 30% пациентов хирургических стационаров [2] и неонаталь-ных отделений [3].
Препаратами выбора при лечении стафилококковых инфекций являются в-лактамные антибиотики (БЛА) [4, 5]. Мишень их действия — участвующие в синтезе пептидогликана карбокси- и транспептидазы, известные также как пеницил-лин-связывающие белки (ПСБ). Связывание БЛА с ПСБ ведёт к инактивации ферментативной активности последних, прекращению роста и после-
дующей гибели микробной клетки. Уровень активности конкретных БЛА в отношении отдельных микроорганизмов в первую очередь определяется аффинностью этих антибиотиков к ПСБ [6].
Повсеместное использование БЛА привело к увеличению числа микроорганизмов, устойчивых к действию этих антибиотиков. Большинство изо-лятов КОС (70—90%) устойчивы к метициллину и всем в-лактамным антибиотикам, тогда как у S.aureus таковыми являются только 20—30% изо-лятов [7]. Устойчивость стафилококков к этим антибиотикам обусловлена продукцией второго пе-нициллин-связывающего белка (РВР2а/ПСБ2а или РВР2'/ПСБ2')[8]. Белок ПСБ2а, так же как и ПСБ, относится к классу транспептидаз и участвует в синтезе пептидогликана клеточной стенки стафилококков, при этом он имеет низкую аффинность к большинству полусинтетических пе-нициллинов и цефалоспоринов, продолжая функционировать в присутствии в-лактамных антибиотиков, нивелируя их действие.
ПСБ2а кодируется геном mecA, входящим в состав мобильного элемента — стафилококковой хромосомной кассеты (от англ. Staphylococcal cassette chromosome elements) (SCCmec). Основными компонентами SCCmec являются mec-ком-плекс и ccr-комплекс, а также дополнительный регион, так называемый J-участок. Mec-комплекс включает ген mecA, интактные или поврежденные регуляторные гены mecRl и mecl, а также ин-серционные последовательности IS431 и/или IS1272. Ccr-комплекс кодирует рекомбиназы, которые обеспечивают мобильность кассеты. Остальная часть кассеты представлена J-участками (J1, J2, J3), которые расположены по бокам и между комплексами mec и ccr, могут содержать различные гены устойчивости к тяжёлым металлам и бета-лактамным антибиотикам и псевдогены, которые не несут каких-либо значимых функций для клеток [10].
На данный момент описано три типа генов ccr. A, В и C. Каждый из трёх типов имеет несколько аллотипов. Считается, что если ccr гены обнаруживают менее 50% гомологии между собой, то они будут относиться к разным типам, а если их идентичность находится в пределах 50—85%, то к одному типу, но разным аллотипам [9].
Существуют SCCmec, не включающие ген mecA (псевдо SCCmec), но обладающие общими характеристиками SCCmec: наличием ccr генов (ccrAB или ccrC) и присутствием фланкирующих повторов, содержащих инсерционные последовательности [10].
Стафилококковые хромосомные кассеты активно используются для типирования стафилококков [11, 12], так как показано, что именно эта разновидность типирования наиболее подходит для исследования локальной эпидемиологии (для
оценки эпидемиологической ситуации по проблемным микроорганизмам в конкретном стационаре: определение родства микроорганизмов, установление источника инфекции, путей распространения микроорганизмов, исследования локальныгх вспышек).
Схема типирования SCCmec S.aureus заключается в определении типов тес-комплекса, типов и аллотипов ссг-комплекса при помощи амплификации со специфическими к каждому из элементов этих комплексов праймерами. На сегодняшний день описано 12 типов SCCmec, при этом новые типы выявляют ежегодно [13, 14].
После того, как SCCmec быши обнаружены у других видов стафилококков, например, у гемолитического и эпидермального, ранее разработанную схему стали применять и для типирования этих видов. Проблема такого подхода заключается в том, что, как показали исследования последних лет, у КОС SCCmec имеет более вариабельное строение [14]. В связи с этим схема типирования, разработанная для S.aureus, не отражает в полной мере особенности SCCmec коагулазо-отрицательных стафилококков, в том числе S.haemolyticus.
В рамках данной работы проведён анализ генов SCCmec S.haemolyticus: установлена вариабельность гена mecA, вымвлены1 основные типы рекомбиназ, а также предложена схема типирования рекомбиназ S.haemolyticus.
Материал и методы
Бактериальные изоляты. В исследование быта включена коллекция из 54 клинических изолятов S.haemolyticus. Образцы получены из ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В. И. Кулакова» (38 изолята), Смоленского государственного медицинского университета (НИИ Антимикробной химиотерапии) (7 изолятов) и Ульяновского государственного технического университета (9 изолятов). Чистые бактериальные культуры были выделены из клинического материала (кала, крови, мочи, ликвора, со-скобов из зева, бронхоальвеолярного аспирата, отделяемого конъюнктивы, с повреждённой кожи, асцитической и плевральной жидкости, аутопсийного материала) путём пересева бактериальныгх клеток на питательную среду (5% кровяной агар, Oxoid). Для всех последующих манипуляций культивирование стафилококков проводили в триптон-соевом бульоне (Tryptic Soy Broth, Oxoid) при 37°С в аэробныгх условиях. Для видовой идентификации микроорганизмов использовали метод прямого масс-спектрометрического профилирования бактериального лизата [15].
Геномные последовательности. В работе использовали данные полногеномного секвенирования 168 образцов S.haemolyticus, представленных в базе данных NCBI (BioProjects: PRJEB2655 и PRJNA267549). Изоляты выделены из образцов крови человека, с раневых поверхностей, центральных венозных катетеров и др.
Кроме того, в рамках данной работы получены полногеномные последовательности трёх изолятов S.haemolyticus (SH527, SH39 и SH864-1) методом высокопроизводительного секвенирования на приборе IonTorrent PGM (LifeTechnologies, США). Для приготовления библиотек использовали набор Ion Plus Fragment Library Kit
(Lifetechnologies, США) в соответствии с инструкциями производителя. Аннотированные последовательности изолятов представлены в базе данных NCBI под номерами JRAW00000000, JRAY00000000 и JRAX00000000.
Для подтверждения видовой принадлежности бактериальных геномов из базы NCBI использовали модуль таксономической классификации на основании уникальных видоспе-цифичных маркеров MetaPhlAn [16].
Биоинформатические методы анализа полногеномных данных. Сборка коротких геномных прочтений в контиги проведена при помощи алгоритма runAssembly (лаборатория биоинформатики, ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА).
Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили с использованием методов Parsimony и Distance программного обеспечения Seaview, version 4.6.1 [17] и Vector NTI 9.0 (Informax Inc, США).
Тип рекомбиназы определяли, сопоставляя нуклео-тидные последовательности анализируемых рекомбиназ и нуклеотидные последовательности референсных реком-биназ каждого типа (А1, А2, А3, А4, В1, В2, В3, В4, С), представленные на информационном ресурсе http://www.staphylococcus.net/.
Поиск определённых генов и белков осуществляли консольными алгоритмами Prokka [18] и BLAST [blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi].
Поиск однонуклеотидных полиморфизмов в гене mecA проводили алгоритмом VarScan [19]. В качестве референса использовался ген mecA S.haemolyticus штамма JCSC1435 (AP006716.1).
Молекулярно-генетические методы. Для выделения ДНК из бактериальных культур использовали набор «ДНК-экспресс» (ООО НПФ Литех, Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Пробы ДНК хранились при -20°C.
Детекцию гена mecA, а также генов рекомбиназ стафилококковой кассеты осуществляли методом амплификации соответствующих генов. Для детекции mecA S.haemolyticus использовали стандартные праймеры [http://www.staphylococ-cus.net/]. Подбор праймеров для типирования рекомбиназ SCCmec S.haemolyticus осуществляли с помощью программного обеспечения Oligo MFC Application (Molecular Biology Insights, Inc., 6.3.1.1) (табл. 1). Подобранные праймеры были протестированы с помощью виртуальной ПЦР, реализованной сервисом ipcress (http://www.ebi.ac.uk/about/vertebrate-genomics/software/ipcress-manual) на созданной базе полногеномных последовательностей. Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК
проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
Результаты и обсуждение
При помощи модуля MetaPhlAn проведена видовая идентификация коллекции полногеномных данных, приписанных к гемолитическому стафилококку («=168), в результате которой 29 геномов были исключены из дальнейшего анализа по причине видового несоответствия и плохого качества сборки. Таким образом, была сформирована коллекция геномных последовательностей («=142) S.haemolyticus, 3 из которых были получены в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФНКЦ ФХМ в ходе данной работы.
На основе однонуклеотидных замен в «общих» («коровых» от англ. «core» — ядро) генах для всех образцов коллекции построено филогенетическое дерево (рис. 1), иллюстрирующее высокое генетическое разнообразие среди исследуемых геномов коллекции.
Cреди 142 образцов коллекции выявлено 117, содержащих ген mecA (рис. 1). Относительно рефе-ренсного гена mecA штамма S.haemolyticus JCSC1435 было найдено 4 однонуклеотидных полиморфизма (SNP, от англ. «single nucleotide polymorphism»): а18301 (Thr610Thr), c737t (Gly246Glu), a675t (Arg225Ser), a667g (Tyr223His). Аналогичную референсному штамму аминокислотную последовательность имели 33 образца (28,2%). Восемь образцов имели 2 SNPs относительно mecA S.haemolyticus JCSC1435: c737t и a675t. По одному образцу (0,85%) имели соответственно один (c737t) и два SNPs (a667g и c737t). Последовательность mecA наибольшего количества образцов (73/142, 62,4%) характеризовалась одним SNP (a675t) и была гомологична последовательности штамма S.aureus N315 (NG_047938.1), которая является ре-
Таблица 1. Праймеры для идентификации генов рекомбиназ SCCmec S.haemolyticus
Ген Последовательность праймеров (5'-3') (прямой/обратный) Длина ампликона, п. о. Температура отжига, °C
ccrAl GTCAGTACAACGATATACGA 240 54
GAAAGAAGTCCTGACAAGT
ccrA2 TCAAAATGAGTCACCAACGG 750 54
TGGTTTCAATATAGGGGTA
ccrA3 TAAGCAATCAGGCAGAACGG 400 56
GTACTTGGTAGGGTTTACG
ccrA4 AGCGACGAATCAAATGTCC 540 54
GTTCAACGATATTGAGTGG
ccrBl CACCTGTTACTTATATTCTCTC 620 60
AATGGTTGGTTTGAGTGCAG
ccrB2 GTACAATCACATACATCTTAGC 632 60
TTCATATTTTTGAATACTTGGTC
ccrB3 ATAGTTGAAGACCTACATCGTC 336 60
TTTATGATTAAGTGCGTTAGCC
ccrB4 GAAGTATAGACACTGGAG 614 48
TTGATTCAATTCATCTTG
ccrC ATTTTGAATAATCCAGTC 200 50
GAAATCTCCACCAATAGG
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основании анализа од-нонуклеотидных замен всех «общих» генов для образцов коллекции и характеристика генов SCCmec для них.
ференсной при анализе генетического разнообразия гена mecA золотистого стафилококка.
В ходе анализа генов рекомбиназ было выявлено, что 118 образцов из 142 содержат в составе геномов гены кассетных рекомбиназ. Причём в
Рис. 2. Филогенетический анализ генов рекомбиназ S.haemolyticus.
Филогенетические деревья построены на основании множественного выравнивания кассетных рекомбиназ.
а - рекомбиназы типа А; б- рекомбиназы типа В; в - рекомбиназа типа С.
19 полногеномных последовательностях ген mecA был найден, а рекомбиназы известных типов выявлены не были. В случае 5 последовательностей в геномах S.haemolyticus не были выявлены ни ген mecA, ни гены рекомбиназ.
На основании множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей и построенного филогенетического дерева обнаруженные у 118 образцов рекомбиназы были разделены на три типа A, B и C. Типы А и В в свою очередь были подразделены на четыре ал-лотипа каждый (рис. 2).
Анализ филогенетических деревьев, построенных в пределах каждого из типов кассетных рекомби-наз (см. рис. 2), показал, что степень сходства между аллотипами лежит в пределах 67—80%, а внутри каждого аллотипа идентичность выше 85%. При этом нуклеотидные последовательности рекомбиназ золотистого стафилококка (показаны на рис. 2 треугольниками) довольно сильно отличаются от соответствующих аллотипов рекомбиназ гемолитического стафилококка (81—85% идентичности, что ниже
заявленной границы в 85%).
Что касается рекомбиназ типа С, то все нуклео-тидные последовательности показали идентичность более 90% (см. рис. 2).
На рис. 1 показан результат объединения филогенетического дерева, построенного на основе генов «коровых» белков, с наличием генов mecA и рекомбиназ трёх типов. В совокупности было вы-
В ПОМОЩЬ ПРАКТИКУЮЩЕМУВРАЧУ
Таблица 2. Распределение генов рекомбиназ и гена mecA в исследуемых выборках
Сочетание рекомбиназ и наличие гена тесА Геномная По данным анализа результатов
коллекция амплификации соответствующих генов
(и=142) у штаммов собранной коллекции (п=54)
mecA-ccг- 5 9
mecA-ccгA1B1+ 2
mecA-ccгA1B1+ccгB3+ 1
mecA-ccгA1B1+ccгA4B4+ccгC+ 1
mecA-ccгA3B3+ccгA4B4+ 3
mecA-ccгA4B4 5
mecA-ccгA4B4+ccгC+ 4
mecA-ccгB1+ 1
mecA-ccгB4+ 1
mecA-ccгC+ 2 4
mecA+ccг- 19 5
mecA+ccгA1+ 1
mecA+ccгA1B1+ 7
mecA+ccгA1B1+ccгA3B3+ 5
mecA+ccгA1B1+ccгC+ 1
mecA+ccгA1+ccгA4B4+ 4
mecA+ccгA1B1+ccгA3B3+ccгC+ 1
mecA+ccгA2+ 2
mecA+ccгA2B2+ 2
mecA+ccгA2+ccгB4+ 1
mecA+ccгA2B2+ccгA4B4+ 1
mecA+ccгA2+ccгA4B4+ 4
mecA+ccгA2B2+ccгA3B3+ccгA4B4+ccгC+ 2
mecA+ccгA3B3+ 6
mecA+ccгA3+ccгA4B4+ 1
mecA+ccгA3B3+ccгA4B4+ 3
mecA+ccгA4B4+ 35 16
mecA+ccгA4B4+ccгA2+ccгC+ 1
mecA+ccгA4B4+ccгC+ 7 5
mecA+ccгB4+ 1
mecA+ccrC+ 27 1
явлено 22 сочетания различных типов рекомби-наз и наличия или отсутствия гена mecA в исследуемых геномах (табл. 2). Наиболее представленной группой являлась группа геномов, характеризующаяся наличием гена mecA и генов рекомби-наз и €0^4 (25%, 35/142 образцов). Второй по представленности была группа геномов, в состав которых входили ген mecA, а также ген ре-комбиназы типа С (еег^ (19%, 27/142 образцов). Рекомбиназы типа А и В одинаковых аллотипов обычно присутствовали в тандеме (непосредственно рядом друг с другом). Из исключений следует отметить образец БКЯ085183 (одновременно присутствовали рекомбиназы ccrA3, ccrA4B4), БЯЯ085226 (ееШВ1, еегВ3), БЯЯ085222 (еегВ4) и БЯЯ085207 (<хгВ1).
На данный момент для типирования SCCmec гемолитических стафилококков используется схема, разработанная для золотистого стафилококка [http://www.staphylococcus.net/]. Праймеры, с помощью которых определяется наличие генов mecA и еег у Б-шют, были протестированы с помощью виртуальной ПЦР на базе полногеномных последовательностей S.haemolyticus. Проверка показала, что соответствующие праймеры с высокой точностью могут детектировать наличие гена mecA. При этом праймеры на гены рекомбиназ показали низкую степень идентичности.
В связи с этим была разработана собственная система типирования 8СС-кассеты, включающая праймеры для детекции генов рекомбиназ стафилококковой хромосомной кассеты S.haemolyticus (см. табл. 1).
Разработанная система типирования апробирована на коллекции клинических изолятов S.haemolyticus (54 изолята) (см. табл. 2). Наиболее представленным вариантом генов рекомбиназ было сочетание еегА4 и еегВ4 (30%, 16/54 изолята). Одиночная рекомбиназа ссгС была детектирована в псевдокассетах, т. е. при отсутствии гена mecA (8%, 4/54) и в одном случае совместно с геном mecA (2%, 1/54). Рекомбиназы аллотипов ееМЗ, еегВ1, ^гВ2, еегВ3 у штаммов коллекции обнаружены не были. Для выборочных штаммов результаты амплификации генов рекомбиназ были подтверждены методом секвенирования по Сэнгеру, в том числе для трёх штаммов 8И527, 8И39 и 8И864-1, подвергнутых полногеномному секвенированию. Типы рекомбиназ, определённых для этих штаммов методом амплификации с использованием предложенных праймеров, полностью совпадали с типом рекомбиназ, полученным на основании анализа геномных последовательностей этих штаммов. Кроме того, обнаружены штаммы, несущие ген mecA при отсутствии генов рекомбиназ (9,2%, 5/54) (см. табл. 2).
С развитием таких направлений медицины, как хирургия, неонатология, реаниматология, а также инвазивных технологий (гемодиализ, различные катетеры, импланты), значительно возросла роль внутрибольничных инфекций, возбудителями которых часто выступают КОС. Среди КОС превалируют штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков, в том числе и мети-циллиноустойчивые штаммы [20]. При этом КОС отличаются широким разнообразием БССтес и по всей вероятности являются резервуаром БССтес для более патогенного вида стафилококков — Б.аигет [21]. В настоящем исследовании были изучены особенности БССтес Б.каето1уН-ст, являющегося вторым по клинической значимости КОС. Кроме того, показано, что Б.Навтоуист по сравнению с другими КОС обладают повышенной тенденцией к развитию устойчивости к антибиотикам [22, 23].
Для оценки разнообразия кассеты Б.каето1уН-ст была сформирована коллекция геномных последовательностей, в которую вошли как образцы из МСВ1, так и секвенированные в ходе исследования. Штаммы Б.Ьаето1уИст, геномы которых вошли в коллекцию, были получены из 11 различных стран, а также выделены из разных источников (крови, кала, поверхность центральных венозных катетеров), что обеспечивало представленность выборки. Кроме того, на основании филогенетического анализа «основных» генов изучаемых образцов Б.Наето1уист (см. рис. 1) можно сделать вывод о генетическом разнообразии штаммов, вошедших в коллекцию.
В большинстве анализируемых полногеномных последовательностях был обнаружен ген тесА (82,4%), что подтверждает данные о высокой доле устойчивых к метициллину штаммов. При этом нуклеотидная последовательность тесА Б.Ьаето1уИст характеризовалась высокой консервативностью, а наибольшее количество образцов несло последовательность, идентичную последовательности аналогичного гена штамма Б.аигет N315. Стоит отметить, что ранее описаны несколько вариантов последовательности тесА, обладающих гомологией на уровне 70%: тесА1 Бжшп К11, тесА2 БМШтш С8В08, тесВ Масгососсш сазе1уйсш, тесС Б.аигет ЬОЛ251 [24]. В рамках данного исследования в геномах Б.Ьаето1уИст представленных генов выявлено не было.
Вопросу типирования рекомбиназ БССтес КОС, и в частности Б.каето1уйст, посвящён ряд работ, что связано с высокой степенью генетического разнообразия БССтес КОС. Описаны случаи, когда КОС содержат в составе своего генома более одного типа ссг БССтес [25]. Было показано, что для штаммов Б.Наето1уист наиболее часто характерны ссгС [26, 27, 28, 29]. Анализ коллекции
геномов показал что, наличие рекомбиназы С и гена mecA является часто встречающейся комбинацией (19%, 27/142 образцов), но в наибольшей части геномов при наличии гена mecA в состав SCCmec входят гены рекомбиназ типа А и В, относящиеся к 4 аллотипу (25%, 35/142 образцов).
Нужно отметить, что в данном исследовании были найдены штаммы S.haemolyticus, содержащие в своем геноме ген mecA, при отсутствии генов рекомбиназ SCCmec (13,4%, 19/142). Вероятно, это связано с наличием новых типов рекомби-наз с низкой гомологией с известными рекомби-назами. Эти данные подтверждают литературные источники, которые описывают случаи нетипиру-емых SCCmec. В некоторых исследованиях процент нетипируемых штаммов S.haemolyticus достигает 63,6% [26, 27, 28]. Также были установлены штаммы, в геноме которых при наличии генов рекомбиназ SCCmec отсутствовал ген mecA, т.е. штаммы с неполной (псевдо) SCCmec кассеты.
Полученные данные свидетельствуют о высокой вариабельности комбинации рекомбиназ, входящих в состав SCCmec кассеты S.haemolyticus, и соответственно о наличии различных типов этой кассеты. В совокупности с данными о наличии неполных (псевдо) SCCmec, описанный феномен косвенно свидетельствует о высокой частоте горизонтального переноса среди КОС и в частности среди S.haemolyticus. Кроме того, явление горизонтального переноса между штаммами S.haemolyticus подтверждает рис. 1. Из рис. 1 видно, что определённые типы рекомбиназ не связаны с какими-то определёнными кластерами филогенетического дерева, сформировавшихся в процессе эволюции «общих» генов.
Анализ филогенетических деревьев, построенных в пределах каждого из типов кассетных ре-комбиназ (см. рис. 2) показал отличие рекомби-наз гемолитического стафилококка от рекомби-наз S.aureus соответствующего аллотипа (81—85% идентичности, что ниже заявленной границы в 85%). В связи с чем, для штаммов S.haemolyticus было осуществлено тестирование праймеров, используемых для типирования SCCmec. Так, прай-меры на ген mecA с высокой точностью определяют наличие этого гена у S.haemolyticus, ввиду его высокой консервативности в пределах рода Staphylococcus. Однако праймеры на различные типы рекомбиназ не обладали достаточной гомологией с нуклеотидными последовательностями рекомбиназ S.haemolyticus для прохождения реакции амплификации. В связи с этим был предложен набор праймеров, подобранный непосредственно на основании сравнения нуклеотидных последовательностей рекомбиназ S.haemolyticus. Ещё одной причиной для создание альтернативной схемы типирования рекомбиназ S.haemolyticus является описание случаев нахождения штам-
мов S.haemolyticus, содержащих в своем геноме гены рекомбиназы А и В различных аллотипов. Таким образом, праймеры были подобраны на каждый аллотип рекомбиназ отдельно (см. табл. 1) и апробированы на коллекции штаммов (54 штамма S.haemolyticus) (см. табл. 2). Как и в случае анализа геномных последовательностей, наиболее распространённым сочетанием генов рекомбиназ являлось ccrA4B4. Что касается гена рекомбиназы ccrC, то он был детектирован в редких случаях, в основном в составе псевдокассет (8%, 4/54). Нук-леотидные последовательности генов рекомби-наз ccrAl, ccrA2, ccrA4, ccrB4, ccrC, установленные на основании результатов амплификации, проведённой с использованием тестируемых
ЛИТЕРАТУРА
1. Rogers K. L, Fey P. D, Rupp M. E. Coagulase-negative staphylococcal infections. Infect Dis Clin North Am 2009; 23 (1): 73—98.
2. Rahman A., Hosaain M.A., Mahmud C, Paul S.K., Sultana S, Haque N. et al. Species distribution of coagulase negative staphylococci isolated from different clinical specimens. Mymensingh Med J 2012; 21 (2): 195—199.
3. Venkatesh M. P., Placencia F, Weisman L. E. Coagulase-Negative Staphylococcal Infections in the Neonate and Child: An Update. Semin Pediatr Infect Dis 2006; 17 (3): 120—127.
4. Coleman K. Diazabicyclooctanes (DBOs): a potent new class of non-/?-lactam /^-lactamase inhibitors. Curr Opin Microbiol 2011; 14 (5): 550—555.
5. Poole K. Resistance to beta-lactam antibiotics. Cell Mol Life Sci 2004; 61 (17): 2200—2223.
6. Сидоренко C.B., Яковлев C.B. Бета-лактамные антибиотики. РМЖ 1997; 21: 2.
7. Malhas A.M., Lawton R., Reidy M, Nathwani D, Clift B.A. Causative organisms in revision total hip & knee arthroplasty for infection: Increasing multi-antibiotic resistance in coagulase-negative Staphylococcus and the implications for antibiotic prophylaxis. Surgeon 2015; 13 (5): 250—255.
8. Laverdiere M. Trends in antibiotic resistance of staphylococci over an eight-year period: differences in the emergence of resistance between coagulase positive and coagulase-negative staphylococci. Microb Drug Resist 1998; 4 (2): 119—122.
9. Rolo J., Worning P., Nielsen J.B., Bowden R., Bouchami O., Damborg P. et al. Evolutionary origin of the staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). Antimicrob Agents Chemother 2017; 61 (6) pii: e02302-16.
10. Shore A.C., Coleman D.C. Staphylococcal cassette chromosome mec: Recent advances and new insight. Int J Med Microbiol. 2013; 303 (6-7): 350—359.
11. Романов A.B., Дехнич A.B. Типирование MRSA: какие методы являются оптимальными для решения различных задач? Клиническая Микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2011. — Т. 13. —№ 2. — С. 168—176. / Romanov A.V., Dekhnich A.V. Tipirovanie MRSA: kakie metody yavlyayutsya optimal'nymi dlya resheniya razlich-nykh zadach? Klinicheskaya Mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2011; 13 (2): 168—176. [in Russian]
12. Shore A.C., Deasy E.C., Slickers P. et al. Detection of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Type XI Carrying Highly Divergent mecA, mecl, mecRl, blaZ, and ccr Genes in Human Clinical Isolates of Clonal Complex 130 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2011; 55 (8): 3765—3773.
13. Zhang Y., Agidi S., LeJeune J.T. Diversity of staphylococcal cassette chromosome in coagulase-negative staphylococci from animal sources. J Appl Microbiol 2009; 107 (4): 1375—1383.
14. Wu Z., Li F., Liu D., Xue H., Zhao X. Novel Type XII Staphylococcal Cassette Chromosome mec Harboring a New Cassette Chromosome Recombinase, CcrC2. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59 (12): 7597—7601.
15. Корниенко M. A., Ильина E. H., Боровская A. Д., Эдельштейн M. B., Сухорукова M. B., Кострцева M., Говорун B. МПрямое бактериальное профилирование посредством MALDI масс-спектрометрии как метод быстрой классификации штаммов Staphylococcus aureus.
праймеров, были определены и соответствовали референсным.
Выражение признательности.
Работа финансировалась грантами Российского Научного Фонда 15-15-00158 и Российским фондом фундаментальных исследований 15-0408158. За счёт финансирования гранта 15-1500158 была собрана коллекция S.haemolyticus, проведены видовая идентификация и тестирование праймеров на рекомбиназы SCCmec. Работа по анализу геномных последовательностей, а также полногеномное секвенирование трёх изолятов S.haemolyticus проведены за счёт финансирования гранта 15-04-08158.
Биомедицинская химия. — 2012. — № 5. — С. 501—513. / Kornienko M. A., Il'ina E. N., Borovskaya A. D., Edel'shtejn M. V., Sukhorukova M. V., Kostrtseva M., Govorun V. M.Pryamoe bakterial'noe profilirovanie posredstvom MALDI mass-spektrometrii kak metod bystroj klassifikatsii shtammov Staphylococcus aureus. Biomeditsinskaya khimiya 2012; 5: 501—513. [in Russian]
16. Nicola S., Levi W., Ballarini A. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012; 9: 811—814.
17. Galtier N., Gouy M., Gautier C. SeaView and Phylo_win, two graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny. Comput Applic Biosci 1996,12: 543—548.
18. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 2014; 30 (14): 2068—2069.
19. KoboldtD.C., Chen K., Wylie T., Larson D.E., McLellan M.D., Mardis E.R. et al. VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples. Bioinformatics 2009; 25 (17): 2283—2285.
20. Diekema D.J., Pfaller M.A., Schmitz F.J, Smayevsky J, Bell J, SENTRY Partcipants Group. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis 2001; 32 Suppl 2: S114—132.
21. Hanssen A.M., Ericson Sollid J.U. SCCmec in staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 46: 8—20.
22. Hope R., Livermore D.M., Brick G., et al. Non-susceptibility trends among staphylococci from bacteraemias in the UK and Ireland, 2001— 06. J Antimicrob Chemother 2008; 62: ii65—74.
23. Krediet T.G., Mascini E.M., van RooijE., Vooswijk J., Paauw A., Gerards L.J. et al. Molecular epidemiology of coagulase-negative staphylococci causing sepsis in a neonatal intensive care unit over an 11-year period. J Clin Microbiol 2004; 42 (3): 992—995.
24. Hiramatsu K., Tomasz A., de Lencastre H., Perreten V., Holden M.T., Coleman D.C. Guidelines for reporting novel mecA gene homologues.Ito T, International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). Antimicrob Agents Chemother 2012; 56 (10): 4997—4999.
25. Zong Z., Peng C., Lu X. Diversity of SCCmec Elements in Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococci Clinical Isolates. PLoS One. 2011; 6 (5): e20191.
26. Iravani Mohammad Abadi M., Moniri R., Khorshidi A., Piroozmand A., Mousavi S.G., Dastehgoli K., Mirzaei Ghazikalayeh H. Molecular Characteristics of Nasal Carriage Methicillin-Resistant Coagulase Negative Staphylococci in School Students. Jundishapur J Microbiol 2015 Jun 27; 8 (6): e18591.
27. Salgueiro V.C., AzevedoM.B., lorioN.L., Amorim EdeL., dosSantosK.R. Staphylococcal cassette chromosome mec elements in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from a Brazilian neonatal care unit. Pediatr Infect Dis J 2014; 33 (10): 1089—1090.
28. Sz.cz.uka E., Krajewska M., Lijewska D., Bosacka K., Kaznowski A. Diversity of staphylococcal cassette chromosome mec elements in nosocomial multiresistant Staphylococcus haemolyticus isolates. J Appl Genet 2016; 57 (4): 543—547.
29. Ito T., Ma X.X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K. Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48 (7): 2637—2651.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Полонская Алина Вадимовна — лаборант-исследователь лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва Мария Андреевна Корниенко — к. б. н., научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва
Манолов Александр Иванович — к. б. н., младший научный сотрудник лаборатории биоинформатики ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва Никита Сергеевич Купцов — лаборант-исследователь лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва Георгий Борисович Смирнов — д. б. н., профессор, член-корреспондент РАН, главный научный сотрудник лаборато-
рии молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва Егор Александрович Шитиков — к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва
Елена Николаевна Ильина — д. б. н., профессор РАН, заместитель директора по научной работе ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва Людмила Анатольевна Любасовская — к. м. н., заведующая отделением клинической фармакологии отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В. И. Кулакова» Минздрава России, Москва Татьяна Валерьевна Припутневич — д. м. н., заведующая отделом микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В. И. Кулакова» Минздрава России, Москва
