CC BY
139
УДК 616.9:579.861.2
Л.Т. БАЯЗИТОВА1, О.Ф. ТЮПКИНА1, Т.А. ЧАЗОВА1, Ю.А. ТЮРИН12, А.Ф. ШАМСУТДИНОВ13, И.Д. РЕШЕТНИКОВА1, Н.Ю. ТЮРИНА4
1Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, 420015, г. Казань, ул. Большая Красная, д. 67
2Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49 3Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18 Стоматологическая поликлиника №9, 420124, г. Казань, ул. Чистопольская, д. 43
Фенотипические и генотипические особенности антибиотикорезистентности амбулаторных и госпитальных штаммов Staphylococcus aureus
Баязитова Лира Табрисовна — кандидат медицинских наук, заведующая научно-исследовательской лабораторией микробиологии, тел. (843) 236-67-91, e-mail: bajalt@mail.ru
Тюпкина Ольга Феликсовна — старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории микробиологии, тел. (843) 236-67-91, e-mail: andt11@inbox.ru
Чазова Татьяна Александровна — младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории микробиологии, тел. (843) 236-67-91, e-mail: kazkon1@yandex.ru
Тюрин Юрий Александрович — кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией иммунологии и разработки аллергенов, ассистент кафедры биологической химии, тел. (843) 238-99-79, e-mail: immunolab@yandex.ru Шамсутдинов Антон Феликсович — младший научный сотрудник, тел. +7-909-306-72-72, e-mail: shamsutdinov@mail.ru Решетникова Ирина Дмитриевна — кандидат медицинских наук, заместитель директора по научной работе, тел. (843) 236-67-81, e-mail: reshira@mail.ru
Тюрина Наталья Юрьевна — врач-стоматолог, тел. (843) 523-44-88, e-mail: chistopolskaya@stomat9.ru
В статье представлены результаты исследования антибиотикорезистентности 191 метициллинчувствительных и метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от амбулаторных и госпитальных пациентов. Получены данные молекулярно-генетического типирования штаммов Staphylococcus aureus и установлены типы SCCmec кассет. Выявлены существенные типовые различия в генотипе MRSA штаммов, выделенных от пациентов амбулаторного и госпитального профиля. Изоляты, выделенные от амбулаторных пациентов, содержали в своем составе генетические элементы SCCmec IV a, c, d типов. В метициллинорезистентных штаммах, выделенных от пациентов госпитального профиля, были идентифицированы только SCCmec кассеты II типа. Высокой антистафилококковой активностью в отношении и MRSA, и MSSA штаммов обладали ванкомицин, фузидовая кислота и мупироцин. Метициллинрезистентные изоляты оказались более устойчивыми к антимикробным препаратам по сравнению с метициллинчувствительными культурами. Азитромицин и клиндамицин продемонстрировали умеренную антимикробную активность. Выявлена низкая активность хлорамфеникола, тетрациклина, эритромицина в отношении штаммов стафилококков.
Ключевые слова: метициллинчувствительные, метициллинрезистентные, Staphylococcus aureus, генотипирование SCCmeс.
L.T. BAYAZITOVA1, O.F. TUPKINA1, T.A. CHAZOVA1, Yu.A. TYURIN12, I.D. RESHETNIKOVA1, N.Yu. TYURINA4
1Kazan Scientific-Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 67 Bolshaya Krasnaya Str., Kazan, Russian Federation, 420015
2Kazan State Medical University, 49 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012
3Kazan (Volga Region) Federal University, 18 Kremlyovskaya Str., Kazan, Russian Federation, 420008
4Stomatological Clinic №9, 43 Chistopolskaya Str., Kazan, Russian Federation, 420124
Phenotypic and genotypic characteristics of outpatient antibiotic resistance and nosocomial Staphylococcus
aureus strains
х
Bayazitova L.T. — Cand. Med. Sc., Head of the Scientific Research Laboratory of Microbiology, tel. (843) 236-67-91, e-mail: bajalt@mail.ru
Tyupkina O.F. — Senior Researcher of the Scientific Research Laboratory of Microbiology, tel. (843) 236-67-91, e-mail: ant11@mail.ru
Chazova TA — Junior Researcher of the Scientific Research Laboratory of Microbiology, tel. (843) 236-67-91, e-mail: kazkon@yandex.ru
Tyurin Yua — Cand. Med. Sc., Head of the Scientific Research Laboratory of Immunology and Allergens Development,
Assistant of the Department of biological chemistry, tel. (843) 236-67-91, e-mail: immunolab@mail.ru
Shamsutdinov A.F. — Junior Researcher, tel. +7-909-306-72-72, e-mail: immunolab@yandex.ru
Reshetnikova I.D. — Cand. Med. Sc., Deputy Director on Research work, tel. (843) 236-67-81, e-mail: reshira@mail.ru
Tyurina N.Yu. — stomatologist, tel. (843) 523-44-88, e-mail: chistopolskaya@stomat9.ru
The article presents the results of a study of antibiotic resistance of 191 methicillin-sensitive (MSSA) and methicillin-resistant (MRSA) strains of Staphylococcus aureus (S. aureus), taken from out-hospital and hospital patients. The data were received of molecular-genetic typing of S. aureus strains and types of SCCmec cassettes were established. There were significant differences in the sample genotypes of MRSA strains taken from out-hospital and hospital patients. The straines taken from out-hospital patients contained genetic elements SCCmec IV a, c, d types. The MRSA taken from hospital patients profile contained only type II SCCmec cassettes. Vancomycin, fusidic acid and mupirocin possess high activity against both MRSA and MSSA. MRSA were more resistant to antimicrobial drugs compared to MSSA. Azithromycin and clindamycin demonstrated moderate anti-staphylococcal activity. Low activity of chloramphenicol, tetracycline, erythromycin against staphylococci strains was revealed.
Key words: methicillin-resistant strains (MRSA), methicillin-sensitive strains (MSSA), Staphylococcus aureus, genetic types of SCCmec.
Уровень заболеваемости инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи (ИСМП, health-care associated infections), остается достаточно высоким. Кроме социально-опосредованных факторов, связанных с санитарно-эпидемиологической обстановкой, играют роль «социально независимые» факторы, такие как селекция высоковирулентных штаммов микроорганизмов с множественной устойчивостью к антимикробным средствам — антибиотикам, антисептикам, де-зинфектантам [1, 2]. В этиологической структуре ИСМП сохраняет свою актуальность Staphylococcus aureus. В эпидемиологическом аспекте значимыми являются метициллин(оксациллин) резистентные стафилококки; в первую очередь, золотистый стафилококк (Meticillinresistant Staphylococcus aureus — MRSA) [3]. Различают нозокомиальные и внебольничные штаммы MRSA. Штаммы, приобретенные в результате пребывания в стационаре или связанные с оказанием медицинской помощи, регистрируют как HA-MRSA (health-care associated MRSA). У пациентов, не обращавшихся за медицинской помощью в последние месяцы, характерны «внебольничные» штаммы MRSA — (communiti-acquired MRSA, CA-MRSA) [4]. Штаммы CA-MRSA и HA-MRSA различаются по фенотипическим и гено-типическим характеристикам. Метициллинорези-стентность стафилококков зависит от присутствия в составе хромосомной кассеты mec-комплекса (SCCmec). Главными элементами этого комплекса являются: mecA, структурный ген, кодирующий продукцию дополнительного пенициллинсвязыва-ющего белка (ПСБ-2а); mecl и mecRl — компоненты, обуславливающие транскрипцию mecA4; mec-ассоциированная ДНК [5].
Генетической характеристикой всех MRSA, независимо от генотипов SCCmec элемента, является наличие гена mecA, обуславливающего устойчивость данных штаммов к оксациллину и бета-лак-тамным антибиотикам, и генов ccr-комплекса, которые кодируют белки осуществляющие эксцизию и сайт специфическую интеграцию mecA в геном стафилококков [6]. Мобильные генетические элементы SCCmec, к которым относятся кассеты IV и V типов, могут переноситься от одних штаммов S. aureus к другим достаточно свободно, по срав-
I хирургия_
нению с SCCmec кассетами I, II и III типов, как правило, не обладающих мобильностью [7]. Необходимо отметить, что штаммы, содержащие SCCmec IV-V типов в составе своего генома, из-за выраженной мобильности и способности к горизонтальному переносу представляют большую эпидемиологическую опасность при распространении MRSA и передачи данного признака между стафилококками, колонизирующими организм человека. Мобильные генетические элементы SCCmec I, II и III типов, как правило, присутствуют в госпитальных клонах ме-тициллинрезистентных стафилококков (HA-MRSA), характеризуются наличием генов устойчивости к антибиотикам других групп (тобрамицину, канами-цину, тетрациклину, эритромицину)[8].
В настоящее время молекулярно-генетическими методами установлено, что существует достаточно четкая зависимость между принадлежностью MRSA к определенному генетическому «бэкграунду» и содержанием определенного типа SCCmec в ДНК [9]. Штаммы, содержащие SCCmec IV типа, относятся к наиболее многочисленной клональной группе CC8. Эта группа включает такие эпидемические родственные штаммы и клоны как EmRSa-2, -6, -12, -13, -14, распространенные в Великобритании, США, Германии, Франции и Нидерландах [10]. Необходимо отметить, что SCCmec Iv типа нередко выявляются у эпидермальных стафилококков (S. epidermidis), являющихся представителями нор-мобиоценоза кожи и слизистых человека и предполагается передача этого мобильного элемента от стафилококков S. epidermidis к коагулазопозитив-ным S. aureus в пределах одного биотопа организма человека [11].
Целью исследования было изучение профиля антибиотикорезистентности и молекулярно-генетическое типирование на наличие SCCmec-комплексов S. aureus, выделенных у пациентов, проходивших лечение в амбулаторно-поликлини-ческих и стационарных условиях.
Материал и методы исследования
В исследование включены 191 клинических штаммов S. aureus, выделенных в 2007-2014 гг. от амбулаторных пациентов, обследованных в по-
ликлинике ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора («амбулаторные») и пациентов, получающих лечение в стационарах г. Казани («госпитальные»). Штаммы MRSA, выделенные от амбулаторных пациентов, высеяны со слизистых оболочек носа и носовых ходов у пациентов с инфекциями верхних дыхательных путей и с участков пораженной кожи у пациентов с атопическим дерматитом. Госпитальные штаммы MRSA высеяны из раневого отделяемого, кожи у пациентов с ожоговыми травмами, из носовой полости — у больных с гнойными риносинуситами, со слизистой полости рта — у пациентов с афтозными стоматитами, перикораноритами, парадонтальными абсцессами.
Бактериологические методы
Культивирование штаммов S. aureus проводилось на 5% кровяном агаре, маннит-солевом желточном агаре («Columbia», «Conda», Испания). Идентификацию S. aureus осуществляли по морфологическим признакам, биохимическим методам в соответствии с нормативными документами. Определение профиля чувствительности к антимикробным препаратам проводилось диско-диффузионным методом с использованием среды Мюллер-Хинтона согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Скрининг метициллинорезистентности S. aureus проводился с использованием диска с нитроцефином с последующим высевом на хромогенную среду Агар chromID MRSA «Biomerioux». Интерпретацию данных антибиотикочувствительности проводили в соответствии со стандартами NCCLS 2008.
Молекулярно-генетические методы
Генотипирование S. aureus проводили по протоколу, представленному в методических рекомендациях Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006 [12]. Экстракцию геномной ДНК из штаммов осуществляли по протоколам коммерческих наборов ZR Genomic DNA II KitTM. Идентификация типов SCCmeс осуществляли методом пЦр-амплификации с использованием 12 пар праймеров (олигонуклеотидов), синтезированных в ЗАО «Синтол» (г. Москва, Россия). На первом этапе определяли специфичность набора генов, кодирующих синтез рекомбиназ (тип ccr 1, 2, 3,5). Затем определяли набор генов, входящих в состав комплекса mec (класс А или класс В, с применением праймеров MecI и IS272 (табл. 1). Результаты амплификации с определением этих наборов генов позволили идентифицировать наличие SCCmec I, II и III типов. Для идентификации присутствия SCCmec IV a, b, c, d использовали прай-меры IS272, а также T-IVa - T-IVd, при выявлении SCCmec V типа дополнительно использовали прай-меры T-V и от-type 5 (табл. 1).
ПЦР проводили с использованием стандартного состава реакционной смеси, объем одной пробы — 20 мкл. Праймеры вносили в конечной концентрации 300 нмоль, концентрация ДНК-матрицы до 1о нг. Детекцию праймер-специфических ампликонов проводили в 2% агарозном геле методом горизонтального электрофореза с использованием интеркалирующего красителя этидиум бромида и маркеров (Fermentas, DNA Ladder). Для визуализации результатов при-
Таблица l.
Наборы праймеров, используемых для
идентификации типов SCCmec
Название праймера Тип идентифицируемого SCCmec Нуклеотидная последовательность (5'-3) Размер ампликона (bp)
T-IVa SCCmecIVa GCCTTATTCGAAGAAACCG CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG 776
T-IVb SCCmecIVb TCTGGAATTACTTCAGCTGC AAACAATATTGCTCTCCCTC 493
T-IVc SCCmecIVc ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC TTGGTATGAGGTATTGCTGG 200
T-IVd SCCmecIVd CTCAAAATACGGACCCCAATACA TGCTCCAGTAATTGCTAAAG 880
T-V SCCmecV GAACATTGTTACTTAAATGAGCG TGAAAGTTGTACCCTTGACACC 330
MecA147 Ген mecA GTGAAGATATACCAAGTGATT ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT 150
Œr-type 1 SCCmec I ATTGCCTTGATAATAGCCTCT AACCTATATCATCAATCAGTACGT 700
Œr-type 2 SCCmec II ATTGCCTTGATAATAGCCTCT TAAAGGCATCAATGCACAAACACT 1000
Œr-type 3 SCCmec III ATTGCCTTGATAATAGCCTCT AGCTCAAAAGCAAGCAATAGAAT 1600
MecI Класс А mec CAAGTGATTTGAAACCGCCT CAAAAGGACTGGACTGGAGTCCAAA 180
IS272 Класс B mec ACCGCCACTCATAACATAAGGAA TATACCAACCCGACAAC 2000
Œr-type 5 SCCmecV ATG-AAT TCAAAGAGGATGGC GATTTAGAATTGTCGTGATTGC 336
х
меняли транслюминатор (Vilber Lourmat, SCX-15 M, Франция).
В работе использованы референс-штаммы:
1. Для внутрилабораторного контроля качества антибиотикорезистентности — Staphylococcus aureus АТСС 25923.
2. Для контроля молекулярно-генетического ти-пирования SCCmec-кассет выделенные ДНК от Staphylococcus aureus M307, Staphylococcus aureus M 258, Staphylococcus aureus 252, Staphylococcus aureus 720, Staphylococcus aureus E84/5528/1, Staphylococcus aureus И-78.
Результаты исследования
У амбулаторных пациентов выделены 166 штаммов S. aureus. В данной группе частота MRSA штаммов по данным фенотипической идентификации составила 27,1%. Характерной особенностью всей совокупности выделенных от данной группы пациентов штаммов было преобладание (72,9%) мети-циллинчувствительных штаммов (MSSA), по сравнению с группой госпитальных пациентов (44,0%). У госпитальных пациентов штаммы S. aureus (n=28) характеризовались преобладанием (56,0%) мети-циллинорезистентных изолятов (MRSA). Следует отметить, что некоторые штаммы, выделенные от пациентов, как амбулаторного, так и госпитального профиля, фенотипически были умереннорезистент-ны к оксациллину, при этом молекулярно-генетиче-ский анализ ДНК полученных от данных штаммов выявил праймер специфические ампликоны mecA-гена в 30,1% случаях для амбулаторных и в 64,0% — для госпитальных изолятов (табл. 2).
На первом этапе исследования проведено определение чувствительности штаммов MRSA и MSSA к антимикробным препаратам. Результаты определения антибиотикочувствительности показали, что высокоактивными в отношении клинических изо-лятов S. aureus являются гликопептиды (ванкоми-цин), все изоляты были абсолютно чувствительны к данному препарату. Доминирующее количество штаммов были чувствительны к фузидовой кислоте: 98,02% MSSA S. aureus и 94,6% MRSA. Высокую антистафилококковую активность показал му-пироцин (94,6% изолятов MRSA и 100% штаммов MSSA). Клиндамицин оказался менее эффективным антистафилококковым препаратом (84,6% — для изолятов MSSA и 75,7% — для штаммов MRSA); доля гентамицинчувствительных изолятов составила 88,5% MSSA и 70,27% культур MRSA. Также отмечалась низкая активность MRSA к эритромицину (54,1%); к тетрациклину — 54,0% и к хлорамфени-колу — 56,7% чувствительных культур. MSSA были более чувствительными в отношении данных антимикробных препаратов. Так, 77,5% штаммов были чувствительны к хлорамфениколу, 76,9% — к тетрациклину и 71,2% — к эритромицину. Макролиды оставались активными препаратами в отношении доминирующего большинства MSSA (78,8% азитро-мицинчувствительных культур); а MrSa только в 67,5% случаев чувствительны к азитромицину.
На втором этапе исследования проведено моле-кулярно-генетическое типирование позитивных по mecA гену ДНК штаммов и установлены типы SCCmec-кассет. Генотип всех выделенных MRSA штаммов от пациентов амбулаторного и госпиталь-
Таблица 2
Результаты определения чувствительности к оксациллину и идентификации mecA гена у штаммов, выделенных от пациентов амбулаторного и госпитального профиля.
Группы пациентов Штаммы, абс.ч,%
Фенотипические Генотипические
MRSA MSSA gene mecA +
Амбулаторного профиля (п=56) 45 (27,1%) 121 (72,9%) 49 (30,1%)
Всего 166 (100%)
Госпитального профиля (п=28) 14 (56,0%) 11 (44,0%) 16 (64,0%)
Всего 25 (100%)
Рисунок.
Распределение типов SCCmec кассет, присутствующих в геноме исследуемых штаммов Staphylococcus aureus
ного профиля при одномоментном исследовании продемонстрировал существенные типовые различия (рис. 1). Анализ распределения типов SCCmec-кассет, присутствующих в геноме исследуемых штаммов S. Aureus, показал (см. рис.), что штаммы, выделенные от амбулаторных пациентов, содержали в своем составе генетические элементы SCCmec IV a, c, d типов.
В штаммах MRSA, выделенных от пациентов госпитального профиля, были идентифицированы только SCCmec кассеты II типа, как правило, характерные для госпитальных клонов MRSA [12].
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что высокой антистафилококковой активностью в отношении и MRSA и MSSA штаммов обладали ванкомицин, фузидовая кислота и мупи-роцин. Метициллинрезистентные изоляты проявили большую устойчивость к антимикробным препаратам по сравнению с метициллинчувствительными культурами. Азитромицин и клиндамицин продемонстрировали умеренную антистафилококковую активность. Выявлена низкая активность хлорам-феникола, тетрациклина, эритромицина.
Молекулярно-генетическое типирование MRSA выявило существенные различия в структуре SCCmec кассет. Изоляты метицилинрезистентных штаммов S. aureus, выделенные от пациентов госпитального профиля в составе своего генома содержали SCCmec кассеты II типа, а штаммы от амбулаторных пациентов — IV тип SCCmec.
Существует необходимость организации эффективного надзора и контроля за циркуляцией штаммов CA-MRSA и HA-MRSA, в конкретном регионе, особенно на локальном уровне — в лечебно-профилактическом учреждении, что позволит разработать меры профилактики роста множественной
резистентности S. aureus, проводить адекватную антимикробную терапию и санитарно-противоэпи-демические мероприятия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Семина H.A., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г. Особенности эпидемиологии и эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями на современном этапе // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2006. — №4. — С. 22-26.
2. Тутельян А.В., Писарев В.М., Гапонов А.М., Акимкин В.Г. Перспективы научных исследований в области профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2010. — №2. — С. 10-12.
3. Chambers H. The Changing epidemiology of Staphylococcus aureus? // Emerg. Inf. Dis. — 2001. — №7. — P. 178-182.
4. Palavecino E. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections // Clin. Lab. Med. — 2004. — №24. — Р. 403-418.
5. Ito T., Kuwahara K., Hiramatsu K. Staphulococcal cassette chromosome mec (SScmec) analysis of MRSA // Methods Mol Biol. — 2007. — Vol. 391. — P. 87-102.
6. Katayama J., Ito T., Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus // Antimicrob. Agents Chemother. — 2000. — Vol. 44. — P. 1549-1555.
7. Fey P.D., Said-Salim B., Rupp M.E. et al. Comparative molecular analysis of community- or hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Antimicrob Agents Chemother. — 2003. — Vol. 47. — P. 96-203.
8. Okuma K., Iwakawa K., Turnidge J.D., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community // J. Clin. Microbiol. — 2002. — Vol. 40. — P. 4289-4294.
9. Robinson D.A., Enright M.C. Evolutionary models of the emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Antimicrob Agents Chemother. —2003. — Vol. 47. — P. 3926-3934.
10. Wielders C.L., Brisse S., de Graaf-Miltenburg L.A. et al. In-vivo transfer of mecA DNA to Staphylococcus aureus // Lancet. — 2001. — Vol. 357. — P. 1674-1675.
11. Hiramatsu K., Longzhu C., Kuroda M., Ito T. The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Trend Microbiol. — 2001. — Vol. 9. — P. 486-493.
12. Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus — возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипиро-вание: Методические рекомендации. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. — 43 с.
НОВОЕ В МЕДИЦИНЕ. ИНТЕРЕСНЫЕ ФАКТЫ
россииские ученые разработали уникальные хирургические нити
На сегодняшний день хирурги активно используют кетгут - саморассасывающуюся нить из очищенной ткани животных. Но в ближайшее время в Томске заработает первое в России предприятие, производящее аналог - шовный материал из полимеров гликолевой и молочной кислот. В данный момент нити тестируют. Еще совсем недавно - до 2010 года - технологиями производства глиоксаля располагали только семь стран в мире. Из глиоксаля синтезируется гликолевая кислота, а на основе этой кислоты два полимера - полигликолид и полилактид. Это основа биоразлагаемых материалов.
Источник: Meddaily.ru
ирурги
