CC BY
112016 т 6 №2 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК: 591.443:615.37
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА КРЫС РЕПРОДУКТИВНОГО ПЕРИОДА НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ИМУНОФАНА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
И. В. Бобрышева
Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии
Государственное учреждение «Луганский государственный медицинский университет»
Адрес переписки: г. Луганск, кв. 50-летия Обороны Луганска, 1.
E-mail: inessa_lug@mail.ru.
РЕЗЮМЕ
В настоящее широко применяется иммуномодулятор имунофан, обладающий многогранным действием на иммунную и эндокринную системы. Цель исследования: изучить морфометрические изменения в тимусе белых крыс репродуктивного периода в условиях экспериментальной иммуностимуляции. Установлено увеличение относительной площади коркового вещества; плотности расположения клеток, содержания лимфобластов и больших лимфоцитов в субкапсулярной зоне, а также средних и малых лимфоцитов во внутренней зоне коркового вещества и мозговом веществе тимуса через 7-60 суток после введения имунофана.
STRUCTURAL CHANGES IN THE THYMUS OF RATS OF REPRODUCTIVE PERIOD AT ADMINISTRATION OF IMUNOFAN IN THE EXPERIMENT
I.V. Bobrysheva
SUMMARY
At the present time immunomodulator imunofan with a complex effect on the immune and endocrine systems is widely used. Aim: to study the morphometric changes in the thymus of mature white rats at the experimental immunostimulation. It was established an increase of the relative area of the cortex of thymic lobules, of the density of cells, of the content of lymphoblasts and large lymphocytes in the subcapsular zone, as well as medium and small lymphocytes in the inner zone of the cortex and medulla of thymus in 7-60 days after imunofan administration.
Ключевые слова: крысы, тимус, иммуностимуляция.
Тимус, как первичный орган иммунной системы, не только обеспечивает иммунный гомеостаз, но и определяет выраженность защитных реакций всего организма. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на действие различных факторов, сопровождаются изменением цитоар-хитектоники и микроокружения клеток [10].
Недостаточная изученность многих аспектов деятельности иммунной системы связана с отсутствием доступных способов оценки морфологических проявлений изменений функциональной активности органов, идентификации клеток, участвующих в иммунных реакциях.
При использовании препаратов с имму-нотропными свойствами необходим тщательный контроль их действия на морфо-функциональное состояние органов и тканей [10]. Поэтому изучение этого вопроса является весьма актуальным как в теоретическом, так и в клиническом аспектах.
В настоящее время в клинической практике широко применяется иммуномоду-лятор имунофан, обладающий сложным и многогранным действием на иммунную и эндокринную системы, усиливающий клеточный и гуморальный иммунитет [7].
Имеется большое число исследований, посвященных изучению влияния имунофана на органы иммунной системы. Однако до последнего времени не уделялось достаточно внимания изучению морфометрических изменений и клеточного состава морфофунк-циональных зон тимуса при иммуностимуля-ции, индуцированной введением имунофана.
Целью данного исследования является изучение морфологических и морфометриче-ских изменений в тимусе белых беспородных крыс-самцов репродуктивного периода в условиях экспериментальной иммуности-муляции, вызванной введением имунофана.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент выполнен в сертифицированной гистологической лаборатории кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГУ «Луганский государственный медицинский университет». Исследование проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах репродуктивного периода массой 150-170 г, полученных из вивария лабораторных животных университета. Моделирование иммуностимуляции проводили с помощью введения имунофана («Био-нокс», Москва, регистрационное свидетельство
UA/0318/01/01). Инъекции препарата производили один раз в день по 0,7 мкг/кг на физиологическом растворе внутримышечно 7-кратно по схеме: на 1, 3, 5, 7, 9 сутки (приказ МЗУ №604 от 24.12.2003) [3, 8]. Контролем служили крысы, получавшие 0,9% раствор натрия хлорида в эквивалентном объёме. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1, 7, 15, 30 и 60 суток после окончания введения препарата путем декапитации под эфирным наркозом [4]. Эксперимент выполнен с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) и одобрен комиссией по вопросам биоэтики ГУ «Луганский государственный медицинский университет» (протокол № 1 от 19.01.2013).
Объектом исследования служил тимус. Забор, фиксацию материала и изготовление парафиновых блоков выполняли согласно общепринятым методикам работы с лимфо-идными органами [1]. Для изучения структурных компонентов тимуса парафиновые срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, для идентификации клеток использовали окраску азуром II-эозином.
Детали гистологического строения исследовали с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего микроскоп Olympus CX - 41 и цифровой фотоаппарат Olympus SP 500UZ с использованием компьютерной программы «Morpholog» [9].
При исследовании тимуса изучались шесть гистологических срезов с каждого объекта, измерения проводились в шести полях зрения каждого среза, что считается достаточным для получения репрезентативных результатов [5].
Определяли относительную площадь мор-фофункциональных зон тимуса: субкапсу-лярной, внутренней кортикальной и мозгового вещества (процентное отношение данных параметров к общей площади дольки) [6].
В указанных зонах вычисляли плотность клеток, в том числе лимфоцитов и эпителио-ретикулоцитов, на условной стандартной площади (104 мкм2); лимфоэпителиальный индекс, представляющий собой отношение количества лимфоцитов к количеству эпителиоретику-лоцитов на единице площади [2]. Определяли процентное содержание клеточных элементов (лимфобластов, малых, средних и больших лимфоцитов, макрофагов, митотически делящихся, деструктивно измененных клеток, эпителиоретикулоцитов и прочих клеток) в морфофункциональных зонах тимуса (количество клеток на 100 клеток в процентах). Малые,
средние и большие лимфоциты дифференцировали, основываясь на морфометрических показателях площади ядра клеток. Согласно литературным данным [6] лимфоциты, имеющие площадь ядра от 6 до 14 мкм2, расцениваются как малые, от 14 до 22 мкм2 - как средние, и от 22 до 30 мкм2 - относятся к большим.
Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением 11-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Распределение данных было нормальным. Тип распределения определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Данные представлены в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической (М+т).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Вилочковая железа крыс репродуктивного периода состоит из долек различной величины. В центре органа находятся крупные дольки с хорошо различимым корковым и мозговым веществом (рис. 1), а по периферии - дольки меньшего размера, между которыми определяется небольшое количество жировой ткани. Дольки содержат субкапсулярную, внутреннюю зоны коркового вещества и мозговое вещество.
Рис. 1. Динамика площади сечения внутренней зоны коркового вещества долек тимуса крыс различных возрастных периодов контрольных групп. * - статистически значимые отличия от данных животных периода полового созревания при р<0,05.
Строение тимуса у крыс репродуктивного периода в процессе возрастной инволюции претерпевает ряд изменений. При морфометрическом исследовании установлено уменьшение размеров долек по сравнению с животными периода полового созревания, которое обусловлено преимущественно снижением площади коркового (рис. 1) и, в меньшей степени, площади мозгово-
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
2016, т. 6, №2
го вещества. Кроме того, наблюдается снижение плотности клеток на единице площади в субкортикальной зоне (от 4,5% до 6,61%), во внутренней зоне коркового вещества (0,99%-3,24%) и мозговом веществе (0,79%-4,71%) в разные сроки наблюдения относительно аналогичных показателей крыс периода полового созревания.
После введения животным репродуктивного периода имунофана тимус сохраняет основные морфологические особенности: дольчатое строение, хорошо различимые корковое и мозговое вещество, наличие телец Гассаля в мозговом веществе.
С помощью морфометрического исследования выявлено изменение соотношения площадей сечения морфофункциональных зон тимуса. Через 7-60 суток после окончания курса инъекций имунофана наблюдается статисти-
чески значимое увеличение площади среза, занятой субкапсулярной и внутренней зонами коркового вещества. Площадь мозгового вещества во все сроки наблюдения меньше, чем в тимусе животных контрольной группы (рис. 2).
Результаты проведенного исследования свидетельствуют также об увеличении плотности расположения клеток в морфофук-циональных зонах тимуса животных экспериментальной группы по сравнению с контрольными данными. В субкапсулярной зоне достоверные отличия между показателями плотности расположения клеток через 7-60 суток составляют 2,91%, 6,89%, 8,90%, 11,24%, тимоцитов - 4,10%, 6,09%, 10,52%, 14,95%. Лимфоэпителиальный индекс увеличивается в аналогичные сроки наблюдения на 8,12%, 7,71%, 14,61% и 24,51% соответственно.
н субкапсулярная зона коркового вещества □ внутренняя зона коркового вещества ■ мозговое вещество
Рис. 2. Динамика площади сечения морфофункциональных зон тимуса крыс репродуктивного периода на фоне введения имунофана в разные сроки наблюдения. * - статистически значимые отличия от данных животных периода полового созревания при р<0,05.
Во внутренней зоне коркового вещества и мозговом веществе тимической паренхимы наблюдается аналогичная тенденция изменения плотности расположения клеток. Так, плотность клеток в этих зонах выше контрольных данных на 7-60 сутки, достигая максимального значения на 15 и 30 сутки. При этом, количество тимоци-тов во внутренней зоне увеличивается на 5,87%, 8,47%, 9,14% и 5,33% на 7-60 сутки наблюдения. Лимфоэпителиальный индекс превышает контрольные значения в те же сроки наблюдения на 9,31%, 6,69%, 12,16% и 51,05% соответственно. Мозговое вещество тимуса экспериментальных животных также отвечает на введение имунофа-на повышением количества тимоцитов на единице площади. Лимфоэпителиальный индекс в мозговом веществе увеличивается на 7-60 сутки на 11,29%,18,53 %, 29,61 % и 51,74% соответственно.
Тимус животных репродуктивного периода активно реагирует на введение им-муномодулятора изменением цитоархи-тектоники морфофункциональных зон.
В субкапсулярной зоне отмечается увеличение популяции лимфоцитов на 7-60 сутки наблюдения. Относительное количество лим-фобластов превышает контрольные показатели на 10,55% (7 сутки), 11,2% (15 сутки), 6,37% (30 сутки). Количество больших лимфоцитов увеличивается по отношению к контрольным данным на 4,22%-7,14%, средних - на 6,81%-11,68% на протяжении периода наблюдения. Максимальной величины показатели достигают на 7 и 15 сутки наблюдения. Увеличивается также количество митотически делящихся клеток при одновременном снижении содержания деструктивно измененных клеток.
Анализ клеточного состава внутренней зоны коркового вещества тимуса демонстрирует увеличение содержания средних и малых лимфоцитов по сравнению с данными животных, которым вводился физиологический раствор. Наибольшее превышение контрольных показателей наблюдается на 7-15 сутки после введения имунофана, однако, и в более отдаленные сроки эти показатели превышают аналогичные в группе контрольных крыс. Так, относительное содержание средних лимфоцитов статистически значимо увеличивается на 11,34% (1 сутки), 18,25% (7 сутки), 15,48% (15 сутки) и 6,22% (30 сутки). Количество малых лимфоцитов с 7 до 60 суток выше контрольных данных на 4,27%, 8,01%, 5,85% и 5,46%. Превышают контрольные данные также показатели относительного содержания макрофагов и митотиче-ски делящихся лимфоцитов на 7, 15 и 30 сутки.
Введение имунофана животным вызывает изменения цитоархитектоники мозгового вещества, проявляющиеся увеличением доли средних и малых лимфоцитов, а также макрофагов через 7-60 суток наблюдения.
ВЫВОДЫ
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой степени реактивности тимуса белых крыс репродуктивного периода на введение иммуномодулятора. Данный факт обусловлен увеличением площади субкапсулярной и внутренней зон коркового вещества на протяжении практически всего периода наблюдения (7-60 суток); повышением плотности расположения клеток в морфофункциональных зонах паренхимы тимуса, в основном, за счет тимо-цитов; изменением цитоархитектоники (увеличением содержания лимфобластов и больших лимфоцитов в субкапсулярной зоне, а также средних и малых лимфоцитов во внутренней зоне коркового вещества и мозговом веществе).
Введение имунофана животным репродуктивного периода замедляет течение естественных инволютивных процессов в тимусе, что проявляется положительной динамикой морфометрических параметров, а также изменением цитоархитек-тоники морфофункциональных зон органа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волошин М.А. Основи iмунолопT та iмуноморфолоriT. Запорiжжя-КиTв; 2010.
2. Григорьева Е.А. Особенности строения тимуса новорожденных (анатомо-экспериментальное исследование): автореф. дис. ... канд. мед. наук. Запорожье; 2002. Доступно по: http://referatu.net.ua/referats/7569/145132.
3. Западнюк В.И., Западнюк И.П., Захария Е.А. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. К.: Вища школа; 1983.
4. Захаров А.А. Особенности ультрамикроскопического строения тимуса половозрелых белых крыс после применения имунофана. Укра'нський медичний альманах. 2009; 12(1):75-77.
5. Кащенко С.А., Золотаревская М.В. Изменения морфометрических показателей белой пульпы селезёнки крыс под воздействием иммунотропных препаратов. Укра'нський медичний альманах. 2011; 14(5):74-77.
6. Кривенцов М.А. Структурная организация тимуса крыс раннего постнатального периода при парентеральном введении спинномозговой жидкости. Укра'нський медичний альманах. 2013;16(2):40-42.
7. Лебедев В.В., Покровский В.И. Имунофан - синтетический пептидный препарат нового поколения. Вестник РАМН. 1999;4:56-61.
8. Михайлова М.Н. Морфофункциональные изменения тимуса и показатели крови после введения цикло-фосфана, имунофана и их комбинации: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Чебоксары; 2004. Доступно по: http:// www.dslib.net/citologia/morfofunkcionalnye-izmenenija-timusa-i-pokazateli-krovi-posle-vvedenija.html.
9. Патент на винахщ №9604. Овчаренко В.В. Комп'ютерна програма для морфометричних дослщжень «М^фЬю^». 19.03.2004.
10. Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Москвичев Е.В., Кострова О.Ю., Михайлова М.Н., Мухаммад Захид, Бессонова К.В. Морфологические изменения тимуса после применения полиоксидония. Фундаментальные исследования. 2012;5(1): 197-202. Доступно по: http://www. fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29875. Ссылка активна на 22.02.2016.
REFERE^ES
1. Voloshin MA. Osnovi imunologi'i' ta imunomorfologi''. Zaporizhzhya-Kiiv; 2010. (In Ukr)
2. Grigor'eva EA. Osobennosti stroenija timusa novorozhdennyh (anatomo-jeksperimental'noe issledovanie) [dissertation]. Zaporozhye: Zaporozhye State Medical University; 2002. (In Russ) Available at: http://referatu.net. ua/referats/7569/145132.
3. Zapadnjuk VI, Zapadnjuk IP, Zaharija EA. Laboratornye zhivotnye. Razvedenie, soderzhanie, ispol'zovanie v jeksperimente. K.: Vishha shkola; 1983. (In Russ)
4. Zakharov AA. Features of thymus ultrastructure of mature white rats after imunofan administration. Ukrains'kij medichnij al'manah. 2009;12(1):75-77. (In Russ)
5. Kashchenko SA, Zolotarevskaya MV. The changes of morphometric indexes of white pulp of rats' spleen under influence of immunomodulate drugs. Ukrains'kij medichnij al'manah. 2011;14(5):74-77. (In Russ)
6. Kriventsov MA. Structural organization of the thymus of the neonatal rats after parenteral administration of the cerebrospinal fluid. Ukrains'kij medichnij al'manah. 2013;16(2):40-42. (In Russ)
2016, т. 6, №2
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
7. Lebedev VV, Pokrovskii VI. Imunofan - a synthetic peptide preparation of the new generation. Vestnik RAMN. 1999;4:56-61. (In Russ)
8. Mihajlova MN. Morfofunkcional'nye izmenenija timusa i pokazateli krovi posle vvedenija ciklofosfana, imunofana i ih kombinacii [dissertation]. Cheboksary: I.N. Ulyanov Chuvash State University; 2004. (In Russ) Available at: http://www.dslib.net/citologia/morfofunkcionalnye-izmenenija-timusa-i-pokazateli-krovi-posle-vvedenija.html
9. Ovcharenko VV. Komp'yuterna programa dlya morfometrichnikh doslidzhen' «Morpholog». Patent №9604. March 19, 2004. (In Ukr)
10. Struchko GY, Merkulova LM, Moskvichev EV, Kostrova OY, Mikhaylova MN, Muhammad Zahid, Bessonova KV. Morphological changes of thymus after use polyoxidonium. Fundamental'nye issledovanija. 2012;5:197-202. (In Russ) Available at: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29875. Accessed 22.02.2016.
