CC BY
34
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 1-2, стр 133-136 © 2004, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СТАТУС НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ
Вологжанин Д.А., Сосюкин А.Е., Калинина Н.М.*, Гребенюк А.Н., Кузин А.А., Давыдова Е.В.
Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова,
* ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Развитие гнойно-септических процессов у пострадавших с механической травмой происходит на фоне выраженных изменении стуктурно-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов, характеризующихся деструкцией клеток и прогрессивным снижением их функциональной активности. Данные изменения выявляются практически сразу после получения травмы и достигают наибольшей выраженности к моменту манифестации осложнений на третьей неделе посттравматического периода.
Ключевые слова: нейтрофилы, структурно-метаболический статус, травматическая болезнь.
Vologzhanin D.A., Sosyukin А.Е., Kalinina N.M., Grebenyuk A.M., Kuzin A.A., Davidova E. V. STRUCTURAL-METABOLIC STATUS OF POLYMORPHONUCLEAR
NEUTROPHIL GRANULOCYTES UNDER MULTIPLE TRAUMA
Abstract. Development of sepsis and multiple organ failure in severely injured patients takes place by expressed structural-metabolic changes of polymorphonuclear neutrophil granulocytes, which were characterized by cell destruction and progressive decrease of the functional activity. In patients with posttraumatic complications progressive alterations of polymorphonuclear neutrophil granulocytes were observed immediately after trauma and than were expressed more considerably in patients without sepsis and multiple organ failure. (Med.Immunol., 2004, vol.6, № 1-2, pp 133-136)
Введение
Развитие научно-технического прогресса, происходящее в последние десятилетия, приводит не только к улучшению качества жизни, но и сопровождается значительным увеличением числа травм и увечий людей. На фойе увеличения общего количества травм существенно изменяется их структура - значительно возросла доля множественных и сочетанных повреждений, при которых гнойно-септические осложнения развиваются в 1,5-3 раза, а пневмонии -в 3 раза чаще, чем при изолированных повреждени-
Адрес для переписки:
Вологжанин Дмитрий Александрович 194044, г. Санкт-Петербург, ул. акад. Лебедева, д.6, Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, кафедра военно-полевой терапии.
Тел.: (812) 542-11-55; 8-911-913-69-86 E-mail: volog@hotbox.7v
ях [1]. Частое развитие в посттравматическом периоде гнойно-септических осложнений диктует необходимость изучения механизмов формирования при травме вторичных иммунодефицитных состояний и, прежде всего, функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов периферической крови.
Благодаря наличию рецепторов к значительному числу эндогенных медиаторов и особенностям своего строения, нейтрофилы реагируют на малейшие изменения постоянства внутренней среды, что позволяет рассматривать эти клетки и качестве своеобразного “зеркала гомеостаза” [5, 12]. Кроме того, нейтрофилы синтезируют и секретируют в кровоток множество биологически активных веществ, оказывая регуляторные влияния на различные органы и системы организма [7,9,15]. Все это позволяет нейтро-филам регулировать воспалительную реакцию, выполнять цитотоксические функции, в значительной степени определять устойчивость организма к бак-
тсриям, вирусам и простейшим, а также играть важную роль в развитии адаптивных процессов при отравлениях, травмах и других видах стрессорных воздействий [3, 4,14].
Материалы и методы
Состояние нейтрофилов периферической крови изучено в ходе комплексного клинико-лаборатор-ного обследования 42 пострадавших мужского пола в возрасте от 19 до 49 лет с тяжёлой сочетанной механической травмой (тяжесть состояния при поступлении по шкале ВПХ-СП >21 балла [2]), находящихся на лечении в хирургическом стационаре. Пострадавшие были разделены две группы. Первую группу (20 человек) составили пострадавшие с неосложнённым течением травматической болезни. У пострадавших второй группы (22 человека) посттравматичес-кий период характеризовался развитием гнойно-септических осложнений.
Комплексную оценку структурно-метаболического состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови проводили в динамике на 1 - 3,4 -14,15 - 21,22 - 28 и 29 - 35 сутки от момента получения травмы по 17 показателям, определяемым гематологическими и цитохимическими методами.
Общее число лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание нейтрофилов определяли с помощью гематологического анализатора крови «Coulter micro Diffis» (США) и меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ окраски мазков краской Романов-ского-Гимза. Суммарное цитохимическое выявление катионных белков в нейтрофилах проводили с помощью лизосомально-катионного теста, предложенного В.Е. Пигаревским (1988). Содержание липидов в клетках оценивали с использованием Судана черного Б по методу H.L. Sheehan и G.W. Storey (1947). Цитохимическое определение миелопероксидазы осуществляли методом R.C. Graham и M.J. Karnovsky (1966). Интрацеллюлярное выявление щелочной фосфатазы проводили методом азосочетания по L.S. Kaplow (1968) в нашей модификации: а-нафтил-фосфат натрия заменен на нафтол- AS-BS-фосфат, а диазоль синий “О” - на прочный синий RR; фиксация мазков проводилась в парах 40 % формалина; ядра клеток окрашивали нейтральным красным.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования показали, что у пострадавших, посттравматический период которых характеризовался развитием гнойно-септических осложнений, уже с первых суток после травмы в крови резко возрастает количество нейтрофильных гранулоцитов, представленных преимущественно гипер-
сегментированными зрелыми формами [таблица]. Увеличение числа нейтрофилов сопровождается появлением среди них клеток с изменёнными цитохимическими характеристиками: на фоне уменьшения содержания катионных белков и угнетения активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы резко возрастает количество нейтрофильных гранулоцитов с токсической зернистостью. Продолжающееся воздействие экстремальных факторов на фоне нарушения созревания приводит к появлению клеток с цитоморфологическими изменениями: фрагментацией ядер клеток, увеличением числа клеток с наличием телец Деле, явлениями вакуолизации, дегрануляции, разрывами мембран.
В последующие 10 сут. содержание нейтрофильных гранулоцитов в группе пострадавших с осложнённым течением травматической болезни возрастает. Несмотря на то, что среди них преобладают клетки, ядро которых состоит из трёх сегментов, то есть наиболее зрелые формы, наблюдается снижение содержания катионных белков, активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы продолжает падать. Содержание клеток с токсической зернистостью в три раза превышает аналогичный показатель в группе пострадавших с неосложнённым течением травматической болезни. По-прежнему выявляется большое число клеток с нарушениями морфологической структуры.
Согласно учению о травматической болезни 14-е сутки посттравматического периода - срок, когда заканчивается период относительной адаптации и начинается период поздних осложнений. Как правило, именно к этому сроку происходит манифестация гнойно-септических процессов. Анализ результатов обследования пострадавших с осложнённым посттравматическим периодом позволяет предположить, что к этому времени система неспецифической резистентности, основным представителем которой является иейтрофильный грануло-цит, практически исчерпывает свои основные резервы, что и является одним из условий развития осложнений. Подтверждением этого могут служить результаты исследования состояния нейтрофильных гранулоцитов с 15 по 28 сут. с момента получения травмы. Несмотря на увеличение потребности в эффекторных клетках за счёт изменения интенсивности воспалительного процесса, содержание нейтрофильных гранулоцитов начинает снижаться. При этом у пострадавших с осложнённым посттравматическим периодом количество катионных белков, активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы продолжают неуклонно снижаться, а количество клеток с токсической зернистостью остаётся стабильно высоким. Цитоморфология нейтрофилов продолжает характеризоваться деструктивными изменениями в виде фрагментации ядер и разрывов мембран.
Интересным, на наш взгляд, является характер изменения содержания липидов в цитоплазме иейт-рофилов у пострадавших с осложнённым течением болезни. Известно, что липиды являются своеобразным посредником между внутренним пространством клетки и межклеточной средой [13]. При этом нейт-рофильные гранулоциты не только поглощают липиды из внеклеточной среды по типу пиноцитоза или эвдоцитоза, но могут и самостоятельно синтезировать их. В эксперименте показано, что в условиях лечебного голодания нейтрофилы крови способны к интрацеллюлярной метаболической адаптации, ключевым моментом которой является переключение энергообмена с гликолитического пути, в норме присущего нейтрофилам, на окислительный тип. Установлено, что при этом в качестве энергетического субстрата они утилизируют свои собственные липиды [6].
Динамическое увеличение содержания липидов в нейтрофилах, наблюдаемое нами у пострадавших с осложнённым течением травматической болезни, позволяет предположить, что, с одной стороны, это может быть следствием деградации мембран этих клеток. Вместе с тем, это может свидетельствовать об определённых затруднениях в использовании запаса липщюв в качестве «аварийного энергосубст-
рата», поскольку потребность в энергии остаётся крайне высокой.
Таким образом, результаты, полученные в ходе исследования, в очередной раз позволяют подчеркнуть важность исследования механизмов неспецифической резистентности при травматической болезни. Показано, что огромное количество нейтрофнльных гранулоцитов, циркулирующих в периферической крови пострадавших с осложнённым течением травматической болезни, фактически оказывается функционально несостоятельным в связи со структурно -метаболическими особенностями клеток. Выявление этих особенностей может стать высокочувствительным и ранним признаком развития гнойно-септических осложнений, что позволит учитывать их в прогнозировании течения травматической болезни.
Список литературы
1. Гуманеико Е.К. Актуальные проблемы сочетанных травм (клинические и патогенетические аспекты) // Клиническая медицина и патофизиология. -СПб., 1995. - С.9-21.
2. Гуманеико Е.К., Бояринцев В.В., Супрун Т.Ю., Ляшедько П.П. Объективная оценка тяжести травм. -СПб, 1999.- 110с.
Табл. ДИНАМИКА КОЛИЧЕСТВЕННЫХ И ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ НЕЙТРОФНЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПОСТРАДАВШИХ С РАЗЛИЧНЫМ ТЕЧЕНИЕМ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ (Х±тх)
Показатель Течение травматической болезни Время от момента получения травмы, сут.
0-3 4-14 15-21 22-28 29-35
Количество лейкоцитов, х109/л Неосложнённое Осложнённое 5,21 ±6,21 12,68±8,28* 8,64*3,15 14,20*6,80* 6,75*3,24 12,56*5,83* 7,23*3,26 10,37*3,42* 6,00*1,78 17,17*6,13*
Количество нейтрофилов, х109/л Неосложнённое Осложнённое 7,30*0,10 13,84±3,33* 6,07*0,90 12,68*3,55* 5,31*0,9 10,22*2,4* 4,09*1,70 8,27*2,55* 3,32*0,91 13,28*7,15*
Индекс сегментирован». Неосложнённое Осложнённое 0,23±0,09 0,41 ±0,11' 0,23*0,11 0,32*0,14 0,25*0,15 0,23*0,16 0,19*0,10 0,16*0,02 0,15*0,03 0,27*0,18
Фрагментация ядра клеток,% Неосложнённое Осложнённое 4,86*1,21 7,66*1,92* 3,90*1,37 7,05*1,87* 4,00*0,70 6,00*2,08* 3,57*1,61 6,50*0,70* 3,28*0,48 7,00*1,73
Тельца Деле, % Неосложнённое Осложнённое 3,43*1,62 5,58*1,38* 2,50*1,08 4,36*1,49* 2,60*1,14 2,85*1,07 2,00*0,81 3,50*2,12 1,57*0,53 4,33*0,57*
Вакуолизация,% Неосложнённое Осложнённое 4,28±0,95 6.82*1,80* 3,00*1,05 5,47*1,67* 2,80*0,83 3,85*1,86 2,71*0,76 8,00*1,41 2,42*0,53 4,66*1,52
Дегрануляция,% Неосложнённое Осложнённое 3,57±1,39 6.08*1,44* 2,50*0,97 5,16*2,00* 2,80*0,83 3,14*1,95 2,00*0,81 6,00*1,41 1,42*0,53 3,04*1,15
Разрывы мембран,% Неосложнённое Осложнённое 3,57*1,71 6,51*1,42* 2,40*1,17 5,11*1,73* 2,40*0,89 3,85*0,90* 2,42*0,78 5,00*0,01* 1,71*0,48 3,66*1,52
Содержание катионных белков, уел. ед. Неосложнённое Осложнённое 0,95*016 0,98*0,24 1,27*0,18 1,10*0,22* 1,20*0,32 1,16*0,37 1,26*0,28 0,80*0,11* 1,42*0,21 0,98*0,40
Нейтрофилы с токсич. зернистостью, % Неосложнённое Осложнённое 40,71*34,16 91,25*3,10* 28,60*31,39 89,05*5,79* 29,80*12,07 88,42*4,29* 27,71*26,07 53,0*45,25 14,57*9,21 85,66*5,13*
Содержание липидов, усл.ед. Неосложнённое Осложнённое 2,04*0,21 2,16*0,24 2,19*0,31 2,23*0,35 2,31*0,11 2,33*0,39 2,27*0,12 2,62*0,08* 2,37*0,20 2,43*0,27
Активность миелолероксидазы, усл.ед. Неосложнённое Осложнённое 1,10* 0,07 0,74*0,19* 1,13*0,06 0,65*0,31* 1,07*0,10 0,70*0,33* 1,07*0,21 0,30*0,10* 1,19*0,02 0,50*0,24*
Активность щелочной фосфатазы, усл.ед. Неосложнённое Осложнённое 1,04*0,02 0,96*0,16 1,08*0,07 0,85*0,17* 0,91*0,31 0,61*0,17 1,02*0,22 0,56*0,12* 1,12*0,07 0,57*0,05*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателем при неосложнённом течении посттравматического периода.
3. Долгушин И.И., Зурочка А.В., Чупичев А.В. Регуляторные пептиды нейтрофилов (нейтрофилоки-ны) // Иммунология. - 1995 . - № 4. - С. 40-45.
4. Мазинг Ю.А. Морфофункциональные основы антимикробной активиости фагоцитов: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук / НИИЭМ РАМН. - СПб., 1995.- 46 с.
5. Маяиский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о ней-трофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989, - 344 с.
6. Наумова Т.А. Функциональное состояние системы нейтрофилов при голодании (лабораторное исследование): Автореф. дис. ... канд. биол. наук. -М.,1982,- 23с.
7. Нестерова И.В., Колесникова Н.В. Цитокино-вая регуляция и функционирующая система нейт-рофильных гранулоцитов // Гематология и транс -фузиология. - 1999. - Т. 44, Mb 2. - С. 43-47.
8. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест // Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов: Сб. науч. тр. - Л., 1988. - С. 87-101.
9. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении // Иммунология. - 1995. - № 4. - С. 34-40.
10. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horseradish
peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique / / J. Histochem. Cytochem. - 1966. - Vol. 14, № 4.
- P. 291-302.
11. Kaplow L.S. Leukocyte alkaline phosphatase cytochemistry: application and methods // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1968. - Vol. 155. - P. 911-928.
12. Klebanoff S.G., Clark R.A. The Neutrophil: Function and Clinical Disorders. - Amsterdam: North Holland Publ. Co., 1978. - 313 p. Kaplow L.S. Leukocyte alkaline phosphatase cytochemistry: application and methods//Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1968. -Vol. 155.-P. 911-928.
13. Murphy P. The Neutrophil. - Oxford: Plenum Med. Press, 1976. - 217 p.
14. Opdenakker G., Fibbe W.E., van Damme J. The molecular basis of leukocytosis // Immunology Today.
- 1998. - Vol. 19, № 4. - P. 182-189.
15. Prior C., Townsend P.J., Hughes D.A., Haslam P.L. Induction of lymphocytes proliferation by antigen-pulsed human neutrophils // Clin, and Exp. Immunol.
- 1992. - Vol. 87, № 3. - P. 485-492.
16. Sheehan H.L., Storey G.W. An improved method of staining leukocyte granules with Sudan black B //J. Path. Bact. - 1947. - № 59. - P. 336-342.
поступила в редакцию 15.03.2003 принята к печати 25.03.2004
