CC BY
18УДК 612.111.014.464
И.А.Шперлинг2*, В.В.Новицкий1, Н.В.Рязанцева1, О.Н.Филиппова1, А.Н.Михаленко1, Э.В.Сапрыкина1, О.А.Рогов2
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
ОКСИДА УГЛЕРОДА
Кафедры патофизиологии и фундаментальных основ клинической медицины ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава» 2Кафедра токсикологии и медицинской защиты Томского военно-медицинского института
Минобороны России, Томск
Экспериментально установлено, что острое воздействие на крыс оксида углерода вызывает длительный полиморфизм эритроцитов периферической крови, что свидетельствует о нарушениях функциональной активности красных клеток крови. Показана роль снижения активности Ка+,К+-АТФазы и дезорганизации липидного компартмента мембраны эритроцитов в изменении поверхностного рельефа клеток при отравлениях оксидом углерода.
Ключевые слова: оксид углерода, эритроциты, поверхностная архитектоника, Ш+^-АТФаза, липидный состав.
Введение. Большая распространенность оксида углерода (СО) в среде обитания человека определяет высокую частоту и неблагоприятные исходы отравлений данным веществом. Летальность при отравлениях СО в разных странах примерно одинакова и составляет в среднем от 12 до 16,1% [14, 15], а постинтоксикационный период характеризуется развитием длительно сохраняющихся полиорганных осложнений [11].
В патогенезе интоксикации оксидом углерода (СО) традиционно отдается предпочтение нарушению кислородтранспортирующей функции гемоглобина, обусловленному образованием карбоксигемоглобина (НЬСО), и блокированию тканевого дыхания вследствие угнетения активности ферментов дыхательной цепи [5]. Вместе с тем, в механизмах формирования гипоксиче-ского синдрома в различные периоды при отравлении СО немаловажное значение может иметь нарушение функционального статуса эритроцитов, обеспечивающего адекватное участие красных кровяных клеток в газообмене за счет их уникальной способности к обратимой трансформации при продвижении в сосудах микро-циркуляторного русла. Эта способность эритроцитов во многом определяется стабильностью ионного гомеостаза, сбалансированностью молекулярной организации белковых и липидных компонентов мембраны эритроцита [8].
Исходя из того, что изменение физико-химических свойств гемоглобина может вызы-
* Фрагмент диссертационной работы
вать струтурно-метаболическую дестабилизацию красных клеток крови [8, 9, 10], целью настоящего исследования явилась оценка структурно-функционального статуса эритроцитов периферической крови при остром отравлении СО в эксперименте.
Материал и методы исследований. Эксперименты проведены на 48 крысах-самцах линии Вистар массой 190—250 г, которых подвергали динамической затравке в течение 1,5 ч в камере с концентрацией СО 4000 мг/м3, определенной с помощью универсального газоанализатора «УГ-2». Оксид углерода получали в замкнутой системе, собранной из колбы Вюрца и газомера, методом добавления 50 мл муравьиной кислоты к 50 мл концентрированной серной кислоты. Рабочую газо-воздушную смесь готовили смешиванием полученного газа с воздухом в пропорции, рассчитанной по первоначальной концентрации СО. Животных контрольной группы помещали в затравочную камеру с пропусканием атмосферного воздуха в течение 1,5 ч.
Кровь получали методом декапитации животных, находящихся под эфирным наркозом, через 1,5 ч, 1, 3, 7, 13 и 21 сут от начала затравки; стабилизировали гепарином (50 ЕД/мл крови). Все вмешательства осуществляли с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964, 1989 гг.
Относительное содержание НЬСО (%) определяли спектрофотометрически [5].
Топографию поверхности эритроцитов исследовали методом сканирующей электрон-
ной микроскопии. Образцы готовили по методике [6]. Для этого пробы крови фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида. После отмывания эритроцитарной взвеси фосфатным буфером (рН 7,4) осуществляли постфиксацию материала 1% раствором четырехоки-си осмия. После повторного отмывания клеток фосфатным буфером проводили их обезвоживание в серии этанола возрастающей концентрации (от 30 до 100%) и в ацетоне. Приготовленную суспензию наносили на алюминиевые подложки, высушивали, напыляли ультратонким слоем серебра. Готовые образцы изучали в электронном микроскопе «СЭМ-200» при ускоряющем напряжении 35 кВ, силе тока 0,63 А, под углом наклона 35°. Для получения количественной характеристики распределения морфологических форм эритроцитов в каждом препарате подсчитывали 1000 клеток, используя классификации [3, 6, 9].
Мембраны эритроцитов получали гипоос-мотическим методом [12]. Содержание белка в мембране эритроцитов определяли микробиуре-товым методом. Липиды мембраны эритроцитов экстрагировали хлороформ-метаноловой смесью. Определяли абсолютное содержание общих липидов и фосфолипидов. Разделение фракций нейтральных липидов и фосфолипидов проводили методом тонкослойной хроматографии
на пластинах «Sorbfil» (Россия) в системах растворителей гептан:диэтиловый эфир:этилаце-тат (в соотношении 80:20:1,5) и хлороформ:ме-танол:вода (в соотношении 32:12,5:2), соответственно [1]. Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием стандартов («Sigma», США). Исследовали активность №+,К+-АТФазы по содержанию неорганического фосфора (Pi) в мембранных препаратах при инкубации в среде (мМ): NaCl — 125; KCl — 25; MgCl2 - 3; ЭДТА - 0,5; АТФ - 2; трис-HCl - 50 (pH - 7,4) при 37°С в течение 1 ч [4].
Результаты анализировали статистически с проверкой показателей на нормальность распределения с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Достоверностью различий (p < 0,05) определяли с использованием непараметрического U критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Через 1,5 ч после начала воздействия СО уровень HbCO в крови у экспериментальных животных был повышен в среднем до 53,7±2,6% (при 0,6±0,1% в контроле, р < 0,01). В остальные сроки наблюдения (1-21 сут) HbCO в крови у крыс опытной группы достоверно не отличался от контроля.
Исследование поверхностной архитектоники эритроцитов выявило изменение процентного соотношения отдельных морфологических форм красных кровяных клеток у крыс в течение
Таблица 1
Содержание морфологических форм эритроцитов (%) в крови у крыс после острого воздействия
оксида углерода (Х±m)
Морфологическая форма Контроль Срок исследования
1,5 ч 1 сут 3 сут 7 сут 13 сут 21 сут
Дискоциты 87,66+0,26 79,88+0,29** 75,58+0,53** 79,44+0,49** 81,84+0,17** 82,88+0,37** 84,20+0,61*
Эллипсы 0,04+0,01 0,03+0,01 0,05+0,01 0,04+0,01 0,06+0,01 0,05+0,01 0,05+0,01
Плоские диски 5,26+0,29 5,26+0,21 5,80+0,18 5,92+0,17* 5,62+0,25 5,20+0,35 5,27+0,18
Дискоциты с выростом 3,52+0,21 4,30+0,31* 4,18+0,21* 3,58+0,26 3,56+0,24 4,04+0,10* 3,90+0,12
Дискоциты с гребнем 1,48+0,08 1,56+0,09 1,68+0,09 1,40+0,11 1,12+0,07** 0,98+0,07** 1,13+0,13**
Дискоциты с множественными выростами 0,38+0,07 1,70+0,10** 1,58+0,09** 0,80+0,14** 1,04+0,08** 0,98+0,09** 0,60+0,12
Эритроциты в виде тутовой ягоды 0,08+0,01 2,92+0,15** 5,23+0,65** 2,96+0,27** 2,66+0,05** 1,06+0,04** 1,09+0,07**
Куполообразные эритроциты 0,44+0,10 0,56+0,09 1,15+0,06** 1,38+0,12** 0,98+0,04** 0,68+0,12 0,47+0,18
Сфероциты 0,64+0,10 1,92+0,07** 1,93+0,09** 1,90+0,09** 1,46+0,10** 1,40+0,11** 1,10+0,12**
Эритроциты в виде спущенного мяча 0,22+0,07 0,70+0,06** 0,90+0,18** 0,72+0,07** 0,84+0,10** 0,62+0,07** 0,67+0,17**
Дегенеративные формы 0,36+0,08 1,20+0,6** 2,00+0,8** 1,90+0,09** 1,68+0,07** 1,64+0,33** 1,60+0,12**
Примечание. Здесь и в табл. 2-3: * / ** — уровень статистической значимости различий по сравнению со значениями в контрольной группе (р < 0,05 / р < 0,01), Х — среднее значение, т — ошибка средней, количество животных в каждой группе — 8
Таблица 2
Содержание общих липидов и их фракционный состав в мембране эритроцитов у крыс после острого
воздействия оксида углерода (Х+m)
Группа животных Общие липиды, мг/мг белка Фракция общих липидов, %
общие фосфолипиды холестерин эфиры холестерина
Контрольная 1,89+0,05 44,12+1,01 38,10+0,96 16,73+1,15
Опытная 1,95+0,05 37,00+1,15** 42,14+0,85** 20,14+1,27**
Срок исследования 1,5 ч
1 сут 2,00+0,05 37,87+1,15** 44,57+1,11** 17,93+0,97
3 сут 1,97+0,06 38,51+0,82** 42,86+1,28** 20,61+1,08*
5 сут 1,85+0,06 37,24+1,21** 44,24+0,94** 20,55+1,56*
7 сут 1,79+0,06 36,75+0,76** 45,55+1,44** 20,04+1,57*
13 сут 1,84+0,07 39,58+1,27** 41,27+0,94** 18,86+1,33*
21 сут 1,87+0,05 41,49+1,04* 40,56+1,28 18,72+1,12
всего периода наблюдения (табл. 1, рисунок). Выраженная морфологическая трансформация эритроцитов отмечалась через 1 сут после воздействия СО. В этот период содержание диско-цитов по сравнению с их количеством у интакт-ных животных было снижено в среднем на 12% (р < 0,01). Среди переходных форм эритроцитов, способных к обратимой трансформации, увеличивалось содержание дискоцитов с одним (р < 0,05) и множественными выростами (р < 0,01) по сравнению с их уровнем в крови у животных контрольной группы. Численность субпопуляции необратимо трансформированных эритроцитов у крыс опытной группы значительно превосходила количество предгемолитических форм клеток у интактных крыс: число куполообразных эритроцитов — в 2,5 раза, сфероцитов — в 3 раза, клеток в виде спущенного мяча — в 4 раза, дегенеративных форм эритроцитов — в 6 раз. Примечательно, что к исходу эксперимента (21 сут) морфологическая картина красной крови не восстановилась.
Процесс морфологической трансформации эритроцитов при воздействии СО, возможно, имеет многофакторный характер. Известно, что отравления СО сопровождаются выраженной стимуляцией свободно-радикального окисления (СРО) [5], характерной не только для гипоксии, но и для постгипоксического периода, сопровождающегося реперфузионным повреждением клеток различных тканей организма [7]. Продукты СРО чрезвычайно агрессивны для ли-пидных и белковых компонентов биологических мембран. В этих условиях закономерны изменения липидного состава и нарушение белок-ли-пидных взаимодействий в мембране эритроцитов, снижение ее текучести, что приводит к изменению формы клетки [9, 13].
Подтверждением тому явились данные, полученные при изучении липидного состава мембраны эритроцитов у крыс опытной группы после воздействия СО. Анализ результатов исследования позволил говорить о продолжительном (вплоть до 21 сут эксперимента) повреждении
Группа животных Общие фос-фолипиды, мг/мг белка Фракция фосфолипидов, %
лизофосфа-тидилхолин фосфатиди-линозитолы сфингомие-лин фосфатдил-холин фосфатидил-серин фосфатидил-этаноламин
Контрольная 0,98+0,06 4,05+0,53 7,80+0,63 11,40+0,89 39,12+0,74 17,40+0,52 19,80+0,91
Опытная 0,85+0,04* 10,03+0,94** 9,30+0,64 14,41+0,55** 34,17+0,43** 18,29+0,44 13,41+0,33**
Срок исследования 1,5 ч
1 сут 0,92+0,05 9,22+0,81** 9,10+0,55 13,88+0,48** 35,24+0,66** 17,74+0,91 14,12+0,72**
3 сут 0,94+0,05 8,71+0,91* 8,54+0,69 13,00+0,77 36,71+0,59** 17,55+0,48 15,29+0,64**
5 сут 0,81+0,03* 7,33+0,59** 8,19+0,34 13,14+0,95 37,19+0,44* 17,92+0,51 16,34+0,28**
7 сут 0,78+0,04* 7,58+0,83** 7,71+0,64 14,03+0,81* 36,49+0,77* 18,34+0,69 15,85+0,77**
13 сут 0,83+0,03* 5,34+0,51* 8,11+0,73 12,91+0,72 38,22+0,72 17,94+0,55 17,50+0,91*
21 сут 0,88+0,04 4,91+0,67 7,93+0,58 11,95+0,43 38,75+0,47 17,98+0,49 18,47+0,52
Таблица 3
Общее количество фосфолипидов и их фракционный состав в мембране эритроцитов у крыс после
острого воздействия оксида углерода, (Х+m)
\ —1/- ' ' ■ - <3 о -ftj ■ je
щ о г '
Рис. Поверхностная архитектоника эритроцитов у крыс после острого воздействия оксида углерода (4000 мг/м3 - 1,5 ч)
А - контроль (х2500); Б - через 1,5 ч после начала затравки (х2000); В - через 1 сут (х4000); Г - через 21 сут (х3500). На микрофотографиях представлены двояковогнутые дис-коциты, дискоциты с одним, множественными выростами, эритроциты в виде тутовой ягоды, дегенеративные формы эритроцитов, куполообразные эритроциты, сфероциты
липидного компартмента мембраны эритроцитов (снижение уровня фосфатидилэтанолами-на и фосфатидилхолина, увеличение содержания лизофосфолипидов, холестерина и его эфи-ров) (табл. 2, 3). Дезорганизация липидного слоя эритроцитарной мембраны может приводить к нарушению трансбислойной асимметрии распределения фракций фосфолипидов, изменению антиокислительной активности мембранных липидов, увеличению микровязкости мембраны красных кровяных клеток, а также дисбалансу основных транспортных систем, нарушение активности которых закономерно ведет к дизрегуляции ионного гомеостаза [8].
Исследование активности Ма+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов у крыс опытной группы выявило достоверное снижение изучаемого параметра, определяемое в течение всего периода наблюдения (21 сут), что указывало на важную роль ионных нарушений в механизмах модификации поверхности эритроцитов при отравлениях СО. Выраженное угнетение активности фермента отмечалось в период максимального содержания НЬСО в крови (0,08±0,01 мкмоль Р/мг белка-ч при 0,32+0,01 мкмоль Р/мг белка-ч в контроле, р < 0,01), сохраняясь снижен-
ной до 7-х сут эксперимента включительно (0,09+0,01 мкмоль Р/мг белка-ч, р < 0,01). Механизмы снижения активности Ма+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов при отравлении СО могут быть сопряжены как с дезорганизацией липидного бислоя клеточной мембраны, так и с прямым влиянием продуктов СРО на молекулу фермента [2].
Заключение. Выявленный полиморфизм эритроцитов периферической крови у крыс после острого воздействия СО свидетельствует о нарушениях функциональной активности красных клеток крови у экспериментальных животных в течение длительного времени. Нарушение микрореологических свойств эритроцитов при отравлениях СО можно считать фактором, способствующим усугублению гипоксического состояния как в токсигенную, так и в соматическую фазы острого отравления, что чревато развитием осложнений и резистентностью к проводимой терапии в различные сроки лечения.
Список литературы
1. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. — М.: Мир, 1990. — 424 с.
2. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Крамаренко Г.Г. Является ли Na+,K+ -АТФаза мишенью окислительного стресса? // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996. — № 3. — С. 275-278.
3. Ионов Б.В., Чернух А.М. Морфологическая характеристика эритроцитов артериальной и венозной крови крысы по данным сканирующей электронной микроскопии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1981. — Т. 92. — № 12. — С. 749-751.
4. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Ш+-К+-АТФ-азы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия, 1984. — № 7.- С. 1089-1094.
5. Клиническая токсикология детей и подростков / Под ред. И.В.Марковой, В.В. Афанасьева, Э.К. Цыбулькина. Часть 2. — СПб. : Интермедика, 1999. — 400 с.
6. Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови. — Таллин: Валгус, 1984. — 116 с.
7. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. — М.: МАИК «Наука / Интерпериодика», 2001. — 343 с.
8. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. — Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. — 202 с.
9. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. и др. Атлас. Клинический патоморфоз эритроцитов.- Томск, 2003.
10. Новицкий В.В., Шперлинг И.А., Жаткин О.А. и др. Изменения морфофункционального статуса эритроцитов при экспериментальных мет-гемоглобинемиях // Токсикологический вестник, 2004. - № 1. - С. 16-20.
11. Choi I.S. Carbon monoxide poisoning: systemic manifestations and complications // J. Korean Med. Sci, 2001. - V. 16. - № 3. - Р. 253-261.
12. Dodge J.T., Mitchell Q.C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghost of human erythrocytes // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1963. - V. 100. - P. 119130.
13. Moor D.J., Sills R.H., Mendelsohn R. Conformational order of specific phospholipids in human erythrocytes: correlations with changes in cell shape // Biochemistry, 1997. - V. 36. - № 3. - P. 660-664.
14. Ostapenko Y.N., Matveev S.B., Gassimova Z.M. et al. Epidemiology and medical aid at acute poisoning in Russia // Przegl. Lek., 2001. - V. 58. - № 4. - P. 293-296.
15. Riddex L., Dellgar U. The ice storm in eastern Canada // Prehospital Disaster Med., 2001. - V. 16. - № 1. - P. 50-52.
Материал поступил в редакцию 01.08.05.
I.A.Shperling2, V.V.Novitskiy1, N.V.Ryazantseva1, O.N.Filipova1, A.N.Mikhalenko1, E.V.Saprykina1,
O.A.Rogov2
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATUS OF ERYTHROCYTES IN PERIPHERIC BLOOD AT ACUTE
EXPOSURE TO CARBON MONOXIDE
Chair of pathophysiology and fundamental principles of clinical medicine, State-owned Establishment «Siberian State
Medical University», Roszdrav 2Chair of Toxicology and Medical Defense, Military Medical Institute of Tomsk, Ministry of Defense of Russia, Tpmsk
It was established in experiments that an acute exposure of rats to carbon monoxide induces long polymorphism of erythrocytes in peripheral blood which gives evidence that the functional activity of blood red cells is disturbed. It is shown the role of decreased activity of Na+, K+-ATPhase and disorganization of erythrocytes membrane lipid department in transformation of surface relief of cells at intoxication by carbon monoxide.
УДК 612.017.1.014.46
П.Ф.Забродский, В.Г.Мандыч, В.Г.Германчук
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ ТОКСИЧНЫМИ ХИМИКАТАМИ НА ПАРАМЕТРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА
Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты
В экспериментах на беспородных крысах установлено, что острая интоксикация токсичными химикатами (ТХ) ипритом, люизитом в дозе 0,5 DL50 снижает параметры неспецифической резистентности организма, оцениваемые по летальности животных от экспериментальной инфекции, среднелетальной дозе Proteus vulgaris и средне-эффективному времени жизни, а зарином и веществом VX — увеличивает их через 36 ч после отравления. Острое воздействие ТХ вызывает супрессию антителообразования (зарин и VX — преимущественно к Т-зависимому антигену), снижение активности естественных клеток-киллеров, антителозависимой клеточной цитотоксичности и формирования гиперчувствительности замедленного типа. ТХ в эквилетальных дозах в порядке уменьшения им-мунотоксичности располагались в последовательности: иприт, люизит, VX, зарин.
Ключевые слова: токсичные химикаты, неспецифическая резистентность организма, гуморальный иммунный ответ, клеточная иммунная реакция, иммунотоксичность.
Введение. В настоящее время токсичные химикаты (ТХ) иприт, люизит, вещество VX, зарин подлежат уничтожению согласно международным соглашениям на специальных промышленных объектах [1]. Не исключена возможность аварий на данных объектах, а также
массовые поражения людей при транспортировке и хранении ТХ. Позитивные шаги международного сообщества, в том числе и России, в области ликвидации и полного запрета химического оружия (ХО) не уменьшили реальность его использования в террористичес-
