CC BY
125
ОСОБЕННОСТИ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ПОСТИНФАРКТНОГО КАРДИОСКЛЕРОЗА
Т.Ю. Реброва, Д.С. Кондратьева, С.А. Афанасьев
НИИ кардиологии СО РАМН, Томск E-mail: [email protected]
THE PECULIARITIES OF PHOSPHOLIPID ERYTHROCYTE MEMBRANE COMPOUND IN CONDITIONS OF POST INFARCTION CARDIOSCLEROSIS
T.Yu. Rebrova, D.S. Kondratyeva, S.A. Afanasyev
Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk
Целью настоящего исследования было изучение на крысах линии Wistar изменения фосфолипидного состава мембран эритроцитов и интенсивности процессов перекисного окисления липидов при формировании экспериментального постинфарктного кардиосклероза. Содержание фосфолипидных фракций в мембранах эритроцитов оценивали методом тонкослойной хроматографии. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов судили по накоплению в плазме крови малонового диальдегида и активности антиокислительных ферментов. Показано, что в этих условиях в мембранах эритроцитов статистически значимо, более чем на 40%, снижается уровень минорного фосфолипида - фосфатидилинозитола, и, напротив, на 20% увеличивается содержание массивного фосфолипида - фосфатидилэтаноламина. При этом в плазме крови животных отмечено высокое содержание продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов, сочетающееся со значительным снижением активности антиокислительных ферментов каталазы и супероксиддисму-тазы. Сделано заключение, что формирование постинфарктного кардиосклероза происходит на фоне высокой активности свободнорадикальных реакций, что приводит к изменению фосфолипидного состава клеточных мембран и снижению компенсаторных возможностей системы эндогенных антиоксидантов. Указанные изменения формируют метаболический фон, способный влиять на процесс ремоделирования сердца.
Ключевые слова: фосфолипиды, перекисное окисление липидов, экспериментальный постинфарктный кардиосклероз.
The membrane erythrocyte phospholipid spectrum change was studied on Wistar rats in conditions of post infarct cardiosclerosis. Observation showed that in two months period after coronary occlusion post infarct cardiosclerosis forming minor - massive phospholipids balance shift in erythrocytes membranes and blood serum containing high POL products concentration takes place. Conclusion: the observed changes reveal structural and functional cell membrane complications.
These changes can be considered as factors having negative impact on post infarct heart remodeling, and showing the adaptation decrease of blood cells as well as the whole animals’ organism.
Key words: phospholipids, lipid peroxidation, experimental cardiosclerosis.
Введение
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что свободнорадикальное окисление липидов вносит весомый вклад в патогенез ишемического и реперфузион-ного повреждения миокарда [5, 13, 14]. Интенсификация процессов пероксидации липидов сопровождается зна-
чительным изменением состава и степени окисленности мембранных фосфолипидов [14], что способствует снижению активности фосфолипидзависимых энзиматических систем, а в конечном итоге приводит к нарушению целостности липидного бислоя клеточных мембран. В условиях активного течения свободнорадикальных процессов наиболее резко уменьшается количество фосфо-
липидов (ФЛ), имеющих в своем составе полиненасыщен-ные жирные кислоты - фосфатидилсерин, фосфатиди-линозитол и фосфатидилэтаноламин [2, 9]. Избирательная делипидизация мембран вызывает рост отношения холестерол / ФЛ, изменение физико-химических свойств мембран и увеличение их микровязкости. При ишемическом поражении миокарда подобные изменения в мембранах кардиомиоцитов приводят к нарушению их функциональной активности и в крайнем своем проявлении вызывают некроз клеток сердечной мышцы. По этой причине при тромболизисной терапии инфаркта миокарда, а также при проведении операций аортокоронарного шунтирования целесообразно использовать препараты, способные защитить клетки сердечной мышцы, оказывая цитопротекторное и антиоксидантное действие [1, 15]. Показано, что в постинфарктном периоде перекисное поражение клеточных мембран не ограничивается только зоной некроза, а оказывает негативное влияние и на непораженные участки сердца [14]. Индукция перекисного окисления липидов может происходить также в мембранах форменных элементов крови, при вступлении в тесный контакт с пораженным участком миокарда или взаимодействии с его метаболитами [16]. Изменения в биомембранах эритроцитов ведут к снижению деформируемости клеток, гемолизу эритроцитов, увеличению вязкости крови и ухудшению кислородтранспортной функции [9]. Возможно, что такое влияние может являться патогенетически значимым фактором постинфарктного ремоделирования миокарда, приводящего к развитию сердечной недостаточности и нарушению сердечного ритма.
Цель настоящего исследования: изучить фосфолипид-ный состав мембран эритроцитов крыс и интенсивность процессов перекисного окисления липидов при формировании экспериментального постинфарктного кардиосклероза.
Материал и методы
Исследования выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г. У животных опытной группы моделировали инфаркт миокарда, с этой целью под эфирным наркозом им перевязывали левую переднюю коронарную артерию [19]. Животным контрольной группы выполняли ложную операцию без коронароокклюзии. Все экспериментальные манипуляции выполнялись в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными Министерством здравоохранения СССР (1977 г.). Через 45 суток животных забивали путем декапитации под легким эфирным наркозом, при этом проводили забор крови в пробирку с гепарином в соотношении 1:10. Мембраны эритроцитов получали, проводя гипоосмотический гемолиз стабилизированной гепарином крови с последующим центрифугированием при 7300 g в течение 15 мин [18]. Полученный осадок мембран трехкратно отмывали 0,9%-м раствором хлористого натрия и осаждали центрифугированием в аналогичных условиях. Фосфолипиды из мембран эритроцитов экстрагировали смесью Фолча [7], для этого к 0,2 мл полученных мембран добавляли 4,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1). Экст-
ракт первоначально фильтровали через бумажный фильтр. С целью очищения от нелипидных примесей в каждую пробу добавляли 1/5 часть объема 50 мМ Са02 Для разделения фаз пробы центрифугировали 15 мин при 1000 g, затем верхнюю фазу декантировали, а нижнюю количественно переносили в грушевидную колбу для упаривания на роторном испарителе. Полученный экстракт растворяли в 0,1 мл смеси хлороформ:метанол (1:1) и использовали для дальнейших определений. Разделение фосфолипидов на основные классы проводили методом тонкослойной хроматографии [17] в слое силикагеля на пластинах “SORBFIL” (АО “Сорбполимер”, Россия) в системе растворителей хлороформ-метанол-ледяная уксусная кислота-вода (60:25:1:4). Для проявления фосфоли-пидных фракций пластины опрыскивали 2-процентным спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты [7]. Сканирование пластинок осуществляли в направлении хроматографирования липидных экстрактов с последующей количественной обработкой при помощи 4.0 версии компьютерной программы “Gel-Pro Analyzer”. Нами оценивалось соотношение следующих фосфоли-пидных фракций: сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидилэтаноламин. Идентификацию этих фракций на пластинках проводили с помощью стандартов фирмы “Sigma”.
Для оценки состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови животных спектрофотометрически определяли содержание первичных продуктов пероксидации липидов - диеновых конъюгатов (ДК), а также одного из конечных продуктов - малонового диальдегида (МДА). Определение ДК и МДА проводили ранее опубликованными методами [15]. О состоянии антиоксидантной системы клеток судили по активности антиокислительных ферментов каталазы [8] и су-пероксиддисмутазы [4]. Общий белок определяли биуре-товым методом [6].
У всех включенных в исследование животных по истечении 45 суток после оперативного вмешательства осуществляли гравиметрический контроль за изменением массы левого желудочка. Также производили оценку объема повреждения миокарда [20].
Статистическую значимость различий полученных результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Через 6 недель после коронароокклюзии сердца опытных животных в сравнении с контрольными были сильно гипертрофированы и имели выраженную зону сформировавшегося рубца. Среднее значение массы сердца животных, перенесших коронароокклюзию, на 80,3±3,61% (p<0,001) превышало аналогичный показатель в группе ложнооперированных; при этом зона постинфарктного рубца составляла в среднем 11,3±0,36% от массы левого желудочка. В ранее опубликованной работе мы показали, что подобное изменение сердечной мышцы после экспериментальной окклюзии коронарной артерии однозначно свидетельствует о развитии кардио-
ТЮ. Реброва и соавт.
ОСОБЕННОСТИ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН...
склероза с характерными гистологическими и функциональными нарушениями [10].
Из представленных в таблице 1 результатов хроматографического анализа липидных экстрактов эритро-цитарных мембран видно, что через 6 недель после перевязки коронарной артерии состав фосфолипидных фракций мембран эритроцитов животных опытной группы существенно отличался от группы ложнооперирован-ных. Так, в пробах опытной группы выявлялось статистически значимое, более чем на 40%, уменьшение содержания минорного фосфолипида - фосфатидилинозитола, и, напротив, увеличение на 20% содержания структурного фосфолипида - фосфатидилэтаноламина.
Согласно литературным данным, снижение содержания фосфатидилинозитола в структуре мембран может происходить вследствие его большого расходования в качестве предшественника вторичного мессенджера внутриклеточных процессов - диацилглицерола [2], а также деградации в результате усиления свободнорадикального окисления полиненасыщенных жирных кислот, которыми богат данный фосфолипид [9]. Подобные изменения могут свидетельствовать о снижении адаптационных возможностей как отдельных клеток, так и всего организма в целом [11]. С этих позиций выявленное нами увеличение доли легко окисляемого ненасыщенного фосфа-тидилэтаноламина в опытной группе животных (табл. 1) можно расценивать как результат компенсаторных процессов, происходящих в клеточных мембранах в постин-фарктном периоде. Это предположение хорошо согласуется с представленными в литературе данными модельных экспериментов, когда добавление в состав искусственных липидных везикул фосфатидилэтаноламина способствовало восстановлению ионтранспортирующей функции очищенной Са2+-АТФазы [3, 21]. Положительный эффект от включения в состав мембранных везикул фосфатидилэтаноламина был показан и в отношении активности другого ионтранспортирующего фермента -Ш,К-АТФазы [3].
Как было отмечено, уменьшение процентного содержания фосфатидилинозитола может происходить в результате интенсификации ПОЛ [14]. В связи с этим мы оценили содержание продуктов пероксидации липидов и активность ферментативных антиоксидантов в сыворотке крови животных рассматриваемых групп. Результаты этих исследований представлены в таблице 2. Видно, что для животных опытной группы было характерно повышенное по сравнению с группой ложнооперирован-ных животных содержание МДА и ДК. Прирост этих показателей составил 20 и 90% соответственно. Высокое содержание ДК в плазме крови животных, выявленное нами по истечении шести недель после окклюзии коронарной артерии, позволяет предположить, что спровоцированное инфарктом увеличение активности процессов ПОЛ запускает свободнорадикальные реакции непосредственно в липидах плазмы и клеточных элементах крови. Определение активности каталазы и СОД показало снижение этих показателей у животных с постинфар-ктным кардиосклерозом на 22 и 89% соответственно относительно значений в контрольной группе. Полученные результаты вполне укладываются в представления о том,
Таблица 1
Соотношение исследуемых фракций фосфолипидов (%) в мембранах эритроцитов контрольных крыс и на фоне экспериментального кардиосклероза
Показатели Группы животных
Ложнооперированные Животные с постин-
животные (контроль), фарктным кардиоскле-
п=10 розом, п=10
Сфингомиелин 13,84+0,36 14,36+0,76
Фосфатидилхолин 20,78+0,46 21,60+1,86
Фосфатидилсерин 20,56+1,02 18,69+1,80
Фосфатидилинозитол 13,99+1,03 8,36+0,39**
Фосфатидилэтаноламин 30,83+1,07 36,98+3,14*
Примечание: * - статистически значимые различия с группой ложноопери-рованных животных (* - р<0,05; ** - р<0,01); п - количество животных в группе.
Таблица 2
Содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность антиокислительных ферментов в плазме крови животных исследуемых групп
Показатели Группы животных
Ложнооперированные Животные с постин-
животные (контроль), фарктным кардиоскле-
п=10 розом, п=10
Диеновые конъюгаты, 1,03+0,08 1,96+0,09*
ДЕ232/мл
Малоновый диальдегид, 20,99+2,03 25,58+2,26*
мкмоль/л
Каталаза, мккатал/л 20,52+1,63 15,92+0,95**
Супероксиддисмутаза, 0,86+0,05 0,09+0,01**
ммоль/мин^л
Примечание: * - статистически значимые различия с группой ложноопери-рованных животных (* - р<0,05; ** - р<0,01); п - количество животных в группе.
что состояние окислительного стресса сохраняется по прошествии 45 суток после моделирования инфаркта миокарда, поскольку, согласно данным литературы, увеличенное образование активных форм кислорода и перекисей липидов способствует снижению активности антиоксидантных ферментов [12].
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что ремоделирование сердца в процессе формирования постинфарктного кардиосклероза сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и изменением содержания в мембранах эритроцитов как минорных, метаболически значимых (фосфатидилинозитола), так и фракций структурных фосфолипидов (фосфатидилэтанола-мина). Развитие аналогичных процессов в мембранах кардиомиоцитов будет отражаться на функциональном состоянии клетки, ее энергетическом метаболизме и в итоге служить причиной дальнейшей дегенерации сердечной мышцы.
Литература
1. Афанасьев С.А., Вечерский Ю.Ю., Ласукова Т.В., Пономаренко И.С., Чернявский А.М. Возможности коррекции репер-фузионного синдрома при операции аортокоронарного шунтирования // Грудн. и серд.-сосуд. хир. - 2003. - № 1. -С. 66-69.
2. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембрано-логия. - Петрозаводск : Изд-во КарНЦ РАН, 2006.- 226 с.
3. Болдырев А.А., Лопина ОД., Рубцов А.М., Свинухова И.А. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФа-зы. - М. : Изд-во Моск. ун-та, 1983. - 125 с.
4. Брусов О.С., Герасимов А.М., Панченко Л.Ф. Влияние природных ингибиторов радикальных реакций на автоокисление адреналина // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1976. -№ 1. - С. 33-34.
5. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. Образование гидроксильных радикалов при реперфузии миокарда после экспериментальной ишемии различной длительности // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2001. - № 6. - С. 629-633.
6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М. : Мир., 1991. - 544 с.
7. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - Минск : Беларусь, 2000. -Т. 2. - 463 с.
8. Каралюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
9. Коновалова Т.Т., Смирнова И.П. Роль липидов в структурно-функциональной организации клеточных мембран при патогенезе и их коррекция у больных ишемической болезнью сердца // Сибирский медицинский журнал (Томск). -2005.- Т. 55, № 6.- С. 8-14.
10. Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П., Шахов В.П. Инотропная реакция миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом на экстрасистолические воздействия // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2005. - Т. 139, № 6. -С. 613-616.
11. Курашвили Л.В., Васильков В.Г. Липидный обмен при неотложных состояниях. - Пенза : Частная типография Тугу-шева С.Ю., 2003. - 198 с.
12. Ланкин В.З., Вандышев Д.Б., Тихазе А.К. Влияние гиперок-сии на активность супероксиддисмутазы и глутатионперок-сидазы в тканях мышей // Докл. АН СССР. - 1981.- Т. 259, № 1. - С. 229-231.
13. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы // Кардиология. - 2000. - № 7. - С. 48-60.
14. Литвицкий П.Ф. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при его регионарной ишемии и последующем возобновлении коронарного кровотока // Патол. физиол. и экс-пер. тер. - 2002. - № 2. - С. 2-12.
15. Защита миокарда триметазидином от реперфузионных повреждений при тромболитической терапии острого инфаркта миокарда / Т.Ю. Реброва, С.А. Афанасьев, В.А. Пер-чаткин, И.В. Максимов, В.А. Марков // Экспер. и клин. фар-макол. -2004.- № 67 (2).- С. 27-30.
16. Фатенков В.Н., Зарубина Е.Г., Милякова М.Н. Нарушения в структуре мембран эритроцитов у больных инфарктом миокарда // Кардиология. - 2002. - №6. - С. 54.
17. Хиггинс Д.А. Выделение и анализ липидных компонентов мембран// Биологические мембраны. Методы / под ред. Дж Финдлея, У. Эванза - М. : Мир, 1990. - С. 150-195.
18. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes // Arch. Biochem. Biophys. - 1962. - Vol. 201. -P. 119-130.
19. Gomez A.M., Guatimosim S., Dilly K.W. et al. Heart failure after myocardial infarction: altered excitation-contraction coupling // Circulation. - 2001. - No. 104(6). - Р 688-693.
20. Schultz J.E.J., Hsu A.K., Nagase H. et al. TAN-67, a 81-opioid receptor agonist, reduces infarct size via activation of Gi/o proteins and KATP channels // Am. J. Physiol. - 1998. i-/o Vol. 274. - P 909-914.
21. Suju M., Davila M., Poleo G. et al. Phosphatidylethanol stimulates the plasma-membrane calcium pump from human erythrocytes // Biochem. J.- 1996. - Vol. 317. - P. 933-938.
Поступила 22.04.2010
