Структурно-функциональные особенности влияния новых водорастворимых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность клеток Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.33 + 576.3

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ НОВЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФЕНОЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК

Анна Евгеньевна ЛЕМЗА1, Виктор Олегович ТКАЧЕВ12,

Николай Константинович ЗЕНКОВ1, Сергей Викторович ХОЛЬШИН3,

Наталья Валерьевна КАНДАЛИНЦЕВА3, Елена Брониславовна МЕНЬЩИКОВА1

1 ФГБНУНаучно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины (НИИЭКМ)

630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

2 University of Michigan School of Medicine

MI 48109-5624, Ann Arbor, 1301 Catherine, USA

3 ФГБОУ ВПО Новосибирский государственный педагогический университет 630126, г. Новосибирск, ул. Вилюйская, 28

С целью исследования цитотоксичности структурно сходных синтетических водорастворимых серо- и селенсо-держащих монофенольных антиоксидантов изучено их влияние на жизнеспособность моноцито/макрофагопо-добных клеток U937 в нормальных условиях и при развитии окислительного стресса. Установлено, что все протестированные соединения малотоксичны (IC50 > 0,3 мМ), за исключением селенсодержащего аналога (IC50 = 80 мкМ). При этом несимметрично экранированный орто-трет-бутилом фенол с атомом бивалентной серы в пара-пропильном заместителе ТС-13 в малых дозах увеличивает количество жизнеспособных клеток in vitro как в нормальных условиях, так и при инкубации с цитотоксическими концентрациями H2O2, вероятно, за счет ингибирования апоптоза.

Ключевые слова: синтетические антиоксиданты, жизнеспособность, ТС-13.

Среди ингибиторов кислородных радикалов в биологических системах важную роль играют фенольные и полифенольные антиоксиданты (соединения вида Аг(ОН)и, в которых одна или несколько гидроксильных групп соединены с ароматическим ядром (Аг)) [4]. Фенольные антиоксиданты эффективно взаимодействуют с ги-дроперекисными радикалами жирных кислот и ненасыщенных липидов, восстанавливая их до менее реакционноспособных гидропероксидов; эффект ингибирования свободнорадикальных окислительных процессов обусловлен относительной стабильностью АгО, который практически не участвует в реакциях продолжения цепей окисления [4]. Несмотря на то что фенольные антиоксиданты широко представлены в природе, по всему миру ведутся работы по созданию новых соединений, обладающих свойствами, необходи-

мыми для решения поставленных исследователями задач. Одним из перспективных направлений такого поиска являются работы в области конструирования гидрофильных фенольных анти-оксидантов, поскольку данное свойство существенно повышает биодоступность соединений. Примерами таких соединений могут служить тролокс и TDMG, водорастворимые аналоги а- и у-токоферола соответственно [4, 9].

С другой стороны, усилия исследователей направлены на получение полифункциональных, или «гибридных», антиоксидантов комбинированного действия, сочетающих антирадикальную и антипероксидную активность, антиоксидант-ную и биологическую эффективность (противовоспалительную, антиканцерогенную, нейропро-текторную и т. д.) [1, 4, 7].

Лемза А.Е. - к.б.н., научный сотрудник, e-mail: lemza.ae@yandex.ru

Ткачев В.О. - к.м.н., старший научный сотрудник, e-mail: victor.o.tkachev@gmail.com

Зенков Н.К. - д.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail: lemen@centercem.ru

Хольшин С.В. - ст. преп., e-mail: aquaphenol@mail.ru

Кандалинцева Н.В. - к.х.н., проф., e-mail: aquaphenol@mail.ru

Меньщикова Е.Б. - д.м.н., зав. лабораторией, e-mail: lemen@centercem.ru

В НИИ химии антиоксидантов Новосибирского государственного педагогического университета ведется интенсивный поиск и скрининг новых синтетических антиоксидантов, обладающих выраженным антирадикальным действием в системах in vitro и in vivo, низкой токсичностью, высокой биодоступностью и эффективностью in vivo в отношении патологических процессов и состояний, в основе этиопатогенеза которых лежит развитие окислительного стресса [5]. В ходе этой работы создан ряд структурно сходных водорастворимых монофенолов, отличающихся наличием трет-бутильных орто-заместителей и атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе, всесторонне исследована зависимость антирадикальной, антиоксидантной и биологической активности соединений от структуры [2, 5]. Установлено, что в большинстве модельных систем in vitro и in vivo наиболее выраженной эффективностью обладает частично экранированный тиосульфонат ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия), и что активность соединения существенно зависит от длины остатка углеводородной цепи и присутствия атома бивалентной серы в пара-алкильном заместителе [3].

Целью настоящего исследования являлась количественная характеристика влияния фе-нольного антиоксиданта ТС-13 и его ближайших аналогов на жизнеспособность моноцито/макро-фагоподобных клеток в культуре в нормальных условиях и при развитии окислительного стресса.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2-(3'-Трет-бутил-4'-гидроксифенил)этилтио-сульфонат натрия (ТС-12), 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), 4-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)-бутилтиосульфонат натрия (ТС-14), 3-(3',5'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-17), 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифе-нил)пропилселеносульфонат натрия (СС-13), 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилсуль-фонат натрия (С-13), р-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионат калия (фенозан-ка-лий, препарат сравнения схожей структуры) синтезированы в НИИ химии антиоксидантов Новосибирского государственного педагогического университета, как описано ранее [2].

Моноцито/макрофагоподобные клетки гис-тиоцитарной лимфомы человека U937, полученные из Банка клеточных культур ФГБУН Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург), культивировали в среде, содержащей 90 % RPMI-1640 (БиолоТ, Санкт-Петербург), 10 % фетальной бы-

чьей сыворотки (Нус1опе, США), 1 % пенициллина, 1 % стрептомицина, 1 % глутамина (Invirogen, США).

Влияние исследуемых соединений на жизнеспособность клеток определяли по их способности восстанавливать бромид 3-(4,5-диме-тилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия (МТТ, Sigma-Aldrich, США) до гранул формазана (МТТ-тест) [8]. Для этого клетки и937 инкубировали (24 ч, +37 °С) с исследуемыми соединениями, затем добавляли раствор МТТ (конечная концентрация 0,5 мг/мл), через 4 ч центрифугировали (6 мин, 2000 об/мин), лизировали 100 мкл диметилсульфоксида (БиолоТ) и измеряли оптическую плотность на длине волны 540 нм (поглощение раствора формазана в диметилсуль-фоксиде), используя референс-фильтр 630 нм. Результаты выражали в долях от единицы, за единицу принимали значение медианы оптической плотности контрольных клеток.

Для исследования влияния ТС-13 на жизнеспособность, апоптоз и некроз в условиях окислительного стресса к интактным клеткам линии и937, а также к клеткам, предварительно (за 24 ч) обработанным различными концентрациями соединения, однократно добавляли пероксид водорода в конечной концентрации 0,5 мМ. Через 24 ч после добавления Н2О2 оценивали общее количество жизнеспособных клеток в МТТ-тесте, через 4 ч - количество клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза и некротически измененных. Индукцию апоптоза и некроза определяли по величине трансмембранного митохондриального потенциала А^т (с помощью 3,3'-дигексилокса-карбоцианина йодида, DiOC6, Sigma-Aldrich) и целостности клеточной мембраны (по проницаемости для йодида пропидия, Р1, Sigma-Aldrich)) соответственно [6]. Для этого к клеткам добавляли 40 нМ DiOC6, инкубировали в течение 15 мин при +37 °С, затем отмывали от избытка красителя и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в присутствии 10 мкг/мл Р1. После однократной отмывки флуоресценцию клеток (^Ет = 520 нм для DiOC6 и ^Ет = 670 нм для Р1) измеряли с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur (ВеСюп^юк^оп, США). Клетки с высоким значением интенсивности флуоресценции DiOC6 и неповрежденной клеточной мембраной принимали за жизнеспособные, клетки со сниженным А^т и непроницаемые для Р1 - за находящиеся на ранних стадиях апоптоза, клетки с нарушенной целостностью мембраны - за некротически измененные.

При моделировании острого локального воспаления крысам линии Wistar интраплантарно вводили в правую заднюю лапу 0,1 мл 10%-го рас-

твора каррагинана в физиологическом растворе. Показателем развития воспалительного процесса служил отек лапы, определяемый плетизмоме-трически через 5 ч после инъекции каррагинана и выражаемый как ((Уп - VJ/VJ х 100 %, где Va - объем правой лапы, Ул - объем левой лапы. Тестируемые соединения и препарат сравнения фенозан-калий, растворенные в 1 мл дистиллированной воды, вводили per os с помощью вну-трижелудочного зонда за 1 ч до индукции воспаления каррагинаном в дозе 100 мг/кг веса тела животного, а крысам контрольной группы - по 1 мл дистиллированной воды.

Концентрации 50%-го подавления жизнеспособности клеток (IC50) вычисляли интерполяцией из зависимостей «доза - ответ», полученных в результате тестирования концентраций антиокси-дантов, варьирующихся в диапазоне 0-500 мкМ, результаты представлены в виде уравнений аппроксимации диаграмм рассеяния, а также медиан и разбросов в случае соединения ТС-13. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве тестируемых объектов выбраны клетки U937, поскольку моноциты и макрофаги служат основными эффекторами и модуляторами воспаления, что важно при исследовании противовоспалительной активности соединений выбранного ряда [2, 3].

Наиболее нейтральным в отношении жизнеспособности клеток был фенозан-калий, статистически значимый эффект он оказывал лишь в концентрации 500 мкМ, но даже тогда доля погибших клеток была не более 85 % (см. таблицу). Выраженную токсичность проявляли ТС-17 (тиосульфонат с полностью экранированной функциональной ОН-группой) и С-13 (частично экранированный сульфонат): жизнеспособность клеток при обработке этими соединениями линейно снижалась, начиная с концентрации в 100 мкМ и достигая значения 15 % под действием 500 мкМ растворов соединений (см. таблицу).

Тиосульфонат с несимметрично экранированной фенольной гидроксильной группой ТС-13 не только обладал невысокой цитотоксичностью (при обработке клеток его 500 мкМ раствором доля жизнеспособных клеток составляла 65 %), но и в невысоких концентрациях достоверно уве-

личивал количество жизнеспособных клеток, при воздействии 100 мкМ раствора повышая ее на 40 % (рис. 1).

Укорочение пара-пропильного заместителя ТС-13 на одно метиленовое звено (ТС-12) отменяло стимулирующее действие низких концентраций антиоксиданта, в то же время данное соединение было менее цитотоксичным, чем остальные аналоги (ТС-17, С-13, СС-13), жизнеспособность клеток была не ниже 45 % при воздействии максимальной из протестированных дозировок 500 мкМ. Напротив, замена атома «активной» серы на селен в пара-пропильном заместителе ТС-13 приводила к существенному увеличению токсичности итогового соединения: СС-13, единственный из исследованных препаратов, достоверно снижал жизнеспособность клеток в концентрации 100 мкМ (более чем на 50 %), максимального ингибирующего эффекта соединение достигало в концентрации 200 мкМ (более чем на 80 %) с последующим выходом на плато. Интересно, что в модели острого локального воспаления in vivo обе модификации структуры ТС-13 приводили к полной потере противовоспалительной активности соединения (рис. 2).

Предпосылкой для исследования замены «активной» бивалентной серы на селен послужило теоретическое предположение, основанное на существовании семейства глутатионпероксидаз. В активный центр большинства изоформ глута-тионпероксидаз входит селеноцистеин, посредством обратимого окисления которого фермент участвует в восстановлении пероксидов, в том числе липидных; на основе низкомолекулярных селеноорганических соединений синтезированы имитаторы глутатионпероксидаз, обладающие сходным механизмом действия (в частности, эб-селен) [9]. Однако существенным ограничением медико-биологического использования селенсо-держащих соединений служит токсичность Se, что и подтверждает настоящее исследование.

Обнаруженная у ТС-13 уникальная среди тестируемых соединений способность в малых концентрациях увеличивать количество жизнеспособных клеток (см. рис. 1), очевидно, связана со стимулированием их пролиферации и/или роста. Для более детального анализа были проведены дополнительные эксперименты по исследованию влияния ТС-13 в концентрациях от 1 до 200 мкМ на жизнеспособность, апоптоз и некроз клеток U937 в условиях окислительного стресса, индуцированного экзогенным пероксидом водорода.

Инкубирование клеток U937 с 0,5 мМ H2O2 в течение 24 ч снижало их жизнеспособность на 40-60 % (рис. 3). Установлено, что присутствие ТС-13 защищало клетки от цитотоксиче-

Таблица

Характеристика зависимости жизнеспособности клеток линии и937 от концентрации внесенного

в среду инкубации фенольного антиоксиданта

Соединение Вид аппроксимации; уравнение Достоверность аппроксимации (Я2; р) Коэффициент корреляции Спирмена (г3; р) 1С50, мкМ

^¿Г к^соок Линейная; у = 1,0197 - 0,0003 х х 0,38; 0,0013 -0,57; 0,003828 900

Фенозан-калий

& Линейная; у = 1,0335 - 0,0007 х х 0,92; 0,0000 -0,93; 0,000000 658

^— ч ввОзИа

ТС-13*

ТР

¿г Т 8803№ Линейная; у = 1,0379 - 0,0011 х х 0,94; 0,0000 -0,98; 0,000000 438

ТС-12

ОоГ Линейная; у = 0,9802 - 0,0017 х х 0,95; 0,0000 -0,95; 0,000000 302

8803Ыа

ТС-17

£ Линейная; у = 1,0488 - 0,0018 х х 0,95; 0,0000 -0,97; 0,000000 291

803Ыа

С-13

ОН I хм

V. Экспоненциальная; у = 1,075 + 0,8810 х е -х/97,25 0,96; 0,0000 -0,81; 0,000001 80

8е803Ыа

СС-13

Примечание. Соединения расположены по мере увеличения токсичности; * - данные приведены без учета стимулирующих концентраций.

о № Ю О о о в и

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

□

т □

° медиана

100 200 300 400 500 Концентрация ТС-13, мкМ I 125 - 75 % I диапазон без выбросов

Рис. 1. Влияние ТС-13 на жизнеспособность клеток линии и937. Здесь и на рис. 2-4 светлые прямоугольники - контроль (инкубирование без антиоксидантов), темные - инкубирование с антиоксидантами; * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо при р < 0,05

80-1

70-

60-

2 ™

и £

° 40

20-

10

I

I

| ТС-13 С-13 ТС-17 ТС-12 СС-13 I«

I 3 |

I

□ медиана I 125 - 75 % I диапазон без выбросов

Рис. 2. Влияние фенольных антиоксидантов на выраженность воспалительной реакции

ского действия пероксида водорода, увеличивая количество жизнеспособных клеток, при этом кривая «доза - эффект» также имела колоколо-образный характер, но в данном случае ее купол был смещен влево, с максимально эффективной концентрацией 20 мкМ (рис. 3). Предварительная

1,1—I

я 1,0-§

« 0,9-Й

S 0,8-

О

8 °'7" ¡0,6-о

к 0 5-S ' ^ 0,4-

0,3

Ó

#*

# db

#* а

#* т É *

#*

#* „

¿#

ф

н202 -

° медиана

п-1-1-1-1-1—

0 5 10 20 50 100 Концентрация ТС-13, мкМ

200

□ 25-75%

+ + + + I диапазон без выбросов

Рис. 3. Влияние ТС-13 на жизнеспособность клеток линии и937 через 24 ч после добавления H2O2. Здесь и на рис. 4 обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия от соответствующих показателей: # - интактных клеток (культивируемых без И^^, * - клеток, культивируемых с И^2 в отсутствие ТС-13

обработка клеток ТС-13 также существенно снижала количество клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, через 4 ч после добавления к ним Н2О2 (рис. 4, а). Данный эффект зависел от концентрации ТС-13, будучи наиболее выраженным при использовании антиоксиданта в дозах 100 и 200 мкМ, в которых соединение уменьшало количество клеток со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом до 50 % от величины соответствующего показателя в контроле. В то же время предварительная обработка клеток ТС-13 не влияла на увеличение числа клеток с нарушенной целостностью клеточной мембраны через 4 ч после индукции окислительного стресса Н2О2 (рис. 4, б), т. е. на повышение количества пропидий-позитивных событий - клеток, погибших путем первичного и вторичного некроза (находящихся на поздних стадиях апоптоза).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, из ряда структурно подобных синтетических водорастворимых антиоксидан-тов наименьшее влияние на жизнеспособность клеток оказывает несимметрично экранированный орто-трет-бутилом фенол с атомом бивалентной серы в пара-пропильном заместителе ТС-13. Большая степень экранирования (ТС-17), отсутствие «активной» серы (С-13), приближе-

е

н202 -

+

##

I

#*

#*

20

100

#*

Н

N?

О4

« вн

х

я б Н

и ° п в 5

о

Е 4Н

Я с о

&2-

о

5

Я 3-

0

#

И

200

# #

0 0 5 20 100 200

Концентрация ТС-13, мкМ + + + - + + + +

□ медиана I 125 - 75 % I диапазон без выбросов

+

Рис. 4. Влияние ТС-13 на относительное количество клеток со сниженным трансмембранным митохон-дриальным потенциалом (а) и пропидий-позитивных клеток (б) (в % от общего количества проанализированных клеток)

ние ее к бензольному ядру (ТС-12) или замена на атом селена (СС-13) приводит к однозначному, но выраженному в разной степени увеличению токсичности соединения. При этом в малых дозах (до 200 мкМ) ТС-13 повышает жизнеспособность клеток in vitro как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса, что, очевидно, связано с его способностью подавлять развитие апоптоза.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 14-04-00551а), с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты // Рос. хим. журн. 2007. 51. (1). 3-12.

2. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Кандалинце-ва Н.В. и др. Антиоксидантные и противовоспалительные свойства новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений // Биохимия. 2007. 72. (6). 790-798.

3. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Кандалинце-ва Н.В., Просенко А.Е. Структурно-функциональные особенности противовоспалительного действия новых водорастворимых серосодержащих

фенольных антиоксидантов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2009. (5). 521-524.

4. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Кандалин-цева Н.В. Фенольные антиоксиданты в биологии и медицине. Saarbrücken: LAP LAMBERT Acad. Publishing, 2012. 496 с.

5. Просенко А.Е., Клепикова С.Ю., Кандалинце-ва Н.В. и др. Синтез и исследование антиоксидант-ных свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений // Бюл. СО РАМН. 2001. (1). 114-126.

6. Nury T., Zarrouk A., Vejux A. et al. Induction of oxiapoptophagy, a mixed mode of cell death associated with oxidative stress, apoptosis and autophagy, on 7-ketocholesterol-treated 158N murine oligodendrocytes: impairment by alpha-tocopherol // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. 446. 714-719.

7. Tailor N., Sharma M. Antioxidant hybrid compounds: a promising therapeutic intervention in oxidative stress induced diseases // Mini Rev. Med. Chem. 2013. 13. 280-297.

8. Van Meerloo J., Kaspers G.J., Cloos J. Cell sensitivity assays: the MTT assay // Methods Mol. Biol. 2011. 731. 237-245.

9. Yoshida E., Watanabe T., Takata J. et al. Topical application of a novel, hydrophilic gamma-tocopherol derivative reduces photo-inflammation in mice skin // J. Invest. Dermatol. 2006. 126. 1633-1640.

EFFECT OF NOVEL WATER-SOLUBLE PHENOLIC ANTIOXIDANTS ON CELL VIABILITY: STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIPS

Anna Evgen'evna LEMZA1, Viktor Olegovich TKACHEV12,

Nikolay Konstantinovich ZENKOV1, Sergey Viktorovich KHOL'SHIN3,

Natal'ya Valer'evna KANDALINTSEVA3, Elena Bronislavovna MENSHCHIKOVA1

1 Scientific Center for Clinical and Experimental Medicine of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2

2 University of Michigan School of Medicine

MI 48109-5624, Ann Arbor, 1301 Catherine, USA

3 Novosibirsk State Pedagogical University 630126, Novosibirsk, Viluyskaya str., 28

In order to investigate cytotoxicity of structurally similar synthetic water-soluble sulfur- and selenium-containing monophenolic antioxidants, their effect on the viability of monocyte/macrophage U937 cells has been studied in normal conditions and under oxidative stress. All tested compounds showed low toxicity (IC50 > 0.3 mM), with the exception of selenium-containing analog (IC50 = 80 mM). At that, partially hindered phenol with one ortho-tert-butyl and a bivalent sulfur atom in the para-propyl substituent TS-13 at low doses increased the number of viable cells in vitro in normal conditions and when incubated with the cytotoxic concentrations of H2O2, probably due to inhibition of the apoptotic processes.

Key words: synthetic antioxidants, viability, TS-13.

Lemza A.E. - candidate of biological sciences, researcher, e-mail: lemza.ae@yandex.ru Tkachev V.O. - candidate of medical sciences, senior researcher, e-mail: victor.o.tkachev@gmail.com Zenkov N.K. - doctor of biological sciences, leading researcher, e-mail: lemen@centercem.ru Khol'shin S.V - sinior lecturer, e-mail: aquaphenol@mail.ru

Kandalintseva N.V. - candidate of chemical sciences, professor, e-mail: aquaphenol@mail.ru Menshchikova E.B. - doctor of medical sciences, head of the laboratory, e-mail: lemen@centercem.ru