CC BY
40
УДК 57.053
ВЛИЯНИЕ ИНДУКЦИИ РЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ Keap1/Nrí2/ARE НА КЛАССИЧЕСКУЮ АКТИВАЦИЮ МАКРОФАГОВ
Петр Михайлович КОЖИН1, Николай Константинович ЗЕНКОВ1, Анна Евгеньевна ЛЕМЗА1, Антон Владимирович ЧЕЧУШКОВ1, Наталья Сергеевна ЗАЙЦЕВА1, Наталья Валерьевна КАНдАЛИНЦЕВА2, Елена Брониславовна МЕНЬЩИКОВА1
1 НИИ экспериментальной и клинической медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2 ФГБОУ ВПО Новосибирский государственный педагогический университет 630126, г. Новосибирск, ул. Вилюйская, 28
С целью исследования влияния фенольного антиоксиданта 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосуль-фоната натрия (ТС-13), активирующего редокс-чувствительную систему Keap1/Nrf2/ARE, на классическую поляризацию макрофагов изучено его действие на экспрессию костимулирующей молекулы CD86 и продукцию оксида азота NO\ Установлено, что ТС-13 в отсутствие дополнительного праймирования IFNy и LPS, а также в низких концентрациях в присутствии IFNy и LPS угнетает экспрессию перитонеальными макрофагами мышей BALB/c поверхностного антигена CD86. Высокие концентрации (100 мкМ) ТС-13 оказывают синергичный эффект с индукторами классической активации и бактериальными агентами (БЦЖ), увеличивая экспрессию кости-мулирующих молекул. При этом ТС-13 дозозависимо стимулирует продукцию NO^ макрофагами вне зависимости от дополнительной стимуляция IFNy + LPS или БЦЖ. Полученные данные свидетельствуют, что индукция системы Keap1/Nrf2/ARE, активирующей механизмы защиты от агрессивных воздействий (в том числе изменение редокс-статуса), может как ингибировать, так и усиливать активацию макрофагов по классическому пути.
Ключевые слова: сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE, ТС-13, поляризация макрофагов, CD86, оксид азота.
Макрофаги проявляют значительную пластичность в своих физиологических реакциях, и на их фенотип существенно влияет состояние окружающей ткани. Взаимодействие с цитокина-ми 1 типа (IFNy, TNF-a, ИЛ-1а и др.), а также с бактериями или низкими концентрациями бактериальных липополисахаридов (LPS) поляризует макрофаги, переводя их в так называемое состояние классической активации (M1), или провоспа-лительное, «состояние битвы» [1, 3, 26]. При этом М1-макрофаги демонстрируют высокие уровни
фагоцитоза и продукции оксида азота (N0^) из L-аргинина, а также других активированных кислородных метаболитов (АКМ), экспрессируют на цитоплазматической мембране большое количество костимулирующих молекул и играют решающую роль в разрешении бактериальных инфекций посредством фагоцитоза и убийства патогенов, инициации и поддержании воспаления, рекрутирования таких клеток-эффекторов приобретенного иммунитета, как Т-лимфоциты [10, 24]. Напротив, цитокины 2 типа, такие как
Кожин П.М. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, e-mail: kozhinpm@gmail.com
Зенков Н.К. - д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, е-mail: lemen@centercem.ru
Лемза А.Е. - к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, е-mail: lemza.ae@yandex.ru
Чечушков А.В. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, e-mail: achechushkov@gmail.com
Зайцева Н.С. - к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, e-mail: nszaitseva@gmail.com
Кандалинцева Н.В. - к.х.н., директор Института естественных и социально-экономических наук, е-mail: aquaphenol@mail.ru
Меньщикова Е.Б. - д.м.н., зав. лабораторией молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, е-mail: lemen@centercem.ru
ИЛ-4 и ИЛ-13, переводят макрофаги в состояние М2, отличное от состояния М1 по характеру ре-цепторного аппарата, метаболическим и секреторным параметрам и условно называемое противовоспалительным (альтернативная активация, «состояние ремонта») [1, 26]. М2-макрофаги связывают с фиброзом и характеризуют по экспрессии и активности аргиназы, которая расщепляет L-аргинин до мочевины и L-орнитина, предшественника образования коллагена1 [13]. Для альтернативно активированных макрофагов также характерны высокие уровни экспрессии CD206, CD36 и низкие уровни экспрессии костимули-рующих молекул, таких как CD40 и CD86 [10]. М2-макрофаги играют важную роль в ограничении деструкции тканей хозяина при хронических инфекциях [1, 24].
В ходе борьбы с патогенами макрофаги формируют токсическое окружение, во многом неспецифическое (в особенности это касается АКМ), и наличие механизмов самозащиты способствует повышению их жизнеспособности. К числу главных регуляторных и защитных систем клетки относится сигнальная система антиоксидант-ре-спонсивного элемента (ARE). В ее состав входит транскрипционный фактор Nrf2, образующий комплекс с ингибитором Keap1, ключевую роль в стабильности этого комплекса играют процессы окислительной/электрофильной модификации SH-групп остатков цистеина Keap1. В транскрип-ционно активной форме Nrf2 связывается с последовательностью ARE, в биологически функциональной форме входящей в промоторы более 500 генов [22], кодируемые ими ферменты участвуют в антиоксидантной защите и в детокси-кации ксенобиотиков. С одной стороны, такая активация системы Keap1/Nrf2/ARE необходима для выживания макрофагов [12], а с другой стороны, по данным ряда авторов, инициирует их переключение из провоспалительного (M1) в противовоспалительное состояние (M2), тем самым запуская процессы репарации [10, 28]. Роль Nrf2 продемонстрирована для многих заболеваний, для которых характерно нарушение функции макрофагов [27, 30, 39]. В то же время существует много противоречивых данных относительно участия №£2-зависимых процессов в изменении фенотипа клеток макрофагального ряда, а также их координации с другими регулирующими воспаление редокс-чувствительными сигнальными системами (опосредованными транскрипционными факторами NF-kB, PPARy, AP-1 и др.). Например, показано, что в определенных условиях
от активности Nrf2 напрямую зависит фагоцитарная активность макрофагов, что позволяет им более эффективно бороться с бактериальными агентами в острой фазе воспаления [14]; при таком хроническом воспалительном заболевании, как атеросклероз, Nrf2 может стимулировать как классическую, так и альтернативную активацию макрофагов, не говоря уже о других фенотипи-ческих паттернах [27]; АКМ, увеличение продукции которых служит одним из признаков M1-поляризации и индуцирует сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, в определенных условиях потенцируют М2-поляризацию [40].
Ранее нами показано, что оригинальный водорастворимый синтетический фенол 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) эффективно подавляет воспаление в острой фазе [25] и способствует ограничению микобактериального гранулематозного воспаления [5], что обусловлено не только его прямым антиоксидантным действием, но и способностью индуцировать систему Keap1/Nrf2/ ARE [4]. Целью настоящего исследования послужило изучение влияния ТС-13 на маркеры классической активации макрофагов и способности соединения модулировать М1-поляризацию.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
ТС-13 синтезирован в НИИ химии антиокси-дантов (Новосибирск), как описано ранее [6].
Исследования проведены на клетках пери-тонеального экссудата мышей линии BALB/c. Животных выводили из эксперимента декапи-тацией, в брюшную полость вводили 10 мл холодной культуральной среды RPMI-1640, через 2 мин культуральную среду, содержащую клетки перитонеального экссудата, извлекали при помощи шприца. Полученную таким образом суспензию клеток центрифугировали (10 мин, 1000 об./мин), осадок ресуспендировали в полной культуральной среде, приготовленной на основе DMEM/F12, с добавлением 10 % феталь-ной бычьей сыворотки, 1 % пенициллина, 1 % стрептомицина, 1 % глутамина. Клетки засевали в лунки 6-луночного планшета по 400 тыс. на лунку в объеме 500 мкл. Через 2 ч инкубирования (+37 оС, 5 % СО2) неприлипающую фракцию удаляли двукратной отмывкой средой DMEM/ F12. Полученную таким образом адгезионную фракцию клеток перитонеального экссудата, преимущественно содержавшую макрофаги (определяемые по морфологическим признакам),
1 Трудно представить более элегантный и простой механизм для переключения макрофага с «битвы» на «ремонт», чем такая «аргининовая развилка» [26].
инкубировали в течение 24 ч в полной культу-ральной среде с добавлением в зависимости от цели эксперимента LPS + IFNy (100 и 20 нг/мл соответственно), вакцины БЦЖ (в соотношении бактерия/макрофаг 3:1), ТС-13 (20 или 100 мкМ, отдельно или совместно с LPS + IFNy, вакциной БЦЖ). Для исследования экспрессии поверхностных антигенов или продукции NO^ клетки трижды промывали раствором Версена, оставляли в нем на 10 мин, затем механически ресуспенди-ровали, центрифугировали (5 мин, 1000 об./мин), удаляли супернатант.
Для блокирования неспецифического связывания перитонеальные макрофаги ресуспендиро-вали в 0,5%-м растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) в натрий-фосфатном буфере (PBS), через 30 мин инкубирования центрифугировали (5 мин, 1000 об./мин) и ресуспенди-ровали в 100 мкл 0,5%-го раствора BSA в PBS, содержащего конъюгированные с флуоресцеин-изотиоцианатом антитела к CD86 (eBioscience № 11-0862-81, США), инкубировали 30 мин при 4 °С. Затем клетки отмывали от избытка антител центрифугированием (5 мин, 1000 об./мин), удаляли супернатант и ресуспендировали в 200 мкл PBS. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton-Dickinson, США), результаты выражали в относительных единицах, нормированных на контроль. Продукцию NO^ определяли с помощью красителя 4-амино-5-метиламино-2',7'-дихлорофлуоресцеина диацетата (DAF-FM-DA, LifeTechnologies № D23842, США), который при попадании в клетку под воздействием эстераз преобразуется в DAF-FM, интенсивно флуоресцирующий при взаимодействии с NO^. Перитоне-альные макрофаги инкубировали 30 мин при 4 °С в растворе Хенкса, содержащего 5 мкМ DAF-FM-DA, затем отмывали от избытка красителя центрифугированием (5 мин, 1000 об./мин), удаляли супернатант, ресуспендировали в 200 мкл раствора Хенкса и дополнительно инкубировали 15 мин для завершения деэстерификации. Интенсивность DAF-FM-зависимой флуоресценции
(^Ex = 488 нм, ^Em = 530 нм) измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur.
Поскольку распределение величин в выборках отличалось от нормального, данные представлены в виде медианы (Me) и межквартиль-ного размаха (Qj-Q3), различия между группами оценивали с помощью дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. Связь между признаками определяли с помощью корреляционного анализа величиной коэффициента корреляции Спирмена (г) либо применяли нелинейные модели регрессии с последующим их дисперсионным анализом и определением достоверности аппроксимации с помощью критерия Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Экспрессия костимулирующей молекулы CD86, маркера поляризации макрофагов по классическому пути, прогнозируемо увеличивалась в результате 24-часового культивирования пе-ритонеальных макрофагов с индукторами Mi-поляризации LPS + IFNg (табл. 1). Под влиянием ТС-13 без дополнительного праймирования LPS + IFNg экспрессия CD86 снижалась. При инкубировании с LPS + IFNg наблюдалась концентрационная инверсия эффекта ТС-13: если в низких концентрациях соединение снижало экспрессию CD86 либо значимо (5 мкМ; Me (Q1-Q3) 0,80 (0,78-0,82) усл. ед), либо на уровне тенденции (20 мкМ, табл. 1), то в высокой концентрации (100 мкМ) ТС-13 значительно повышал величину показателя (см. табл. 1), при этом зависимость от дозы имела вид гауссовой кривой (R = 0,946, критерий Фишера F = 531,07, p = 0,0000; рис. 1, а). Культивирование перитонеальных макрофагов с БЦЖ сопровождалось значимым повышением экспрессии поверхностного антигена CD86 (см. табл. 1). Дополнительное введение в среду инкубирования ТС-13 в концентрации 20 мкМ не изменяло величину показателя, в то время как в дозе 100 мкМ ТС-13 существенно увеличивал экспрессию костимулирующей молекулы (см. табл. 1), зависимость от концентрации была
Таблица 1
Экспрессия CD86 перитонеальными макрофагами мышей BALB/c, усл. ед. (Me (Q1-Q3))
Условия инкубирования Концентрация ТС-13 в среде инкубирования
0 мкМ 20 мкМ 100 мкМ
Контроль 0,97 (0,93-1,05) 0,88* (0,87-0,91) 0,85* (0,78-0,89)
LPS + IFNg (100 + 20 нг/мл) 1,10* (1,06-1,14) 1,05 (0,88-1,20) 1,88*# (1,74-1,99)
Вакцина БЦЖ (3:1) 1,46* (1,43-1,53) 1,49* (1,46-1,50) 3,24*,t (3,05-3,44)
Примечание. Здесь и в табл. 2 обозначены статистически значимые (p < 0,05) отличия от величин соответствующих показателей: * - в контроле, # - при инкубировании с LPS + IFNg, f - при инкубировании с вакциной БЦЖ.
2,0-
° 1,бН
чо 00 Q
U § 1'2
U
и
U &
а о,и ет
0,4
-20
—I-1-1-1—
20 40 60 80 Концентрация ТС-13, мкМ
—I-
100 120
20 40 60 80 Концентрация ТС-13, мкМ
120
Рис. 1. Зависимость экспрессии макрофагами CD86 от концентрации ТС-13 при инкубировании в присутствии LPS + IFNg (а) или вакцины БЦЖ (б) (диаграмма рассеяния). Здесь и на рис. 2 кружки - отдельные значения, сплошная линия - линейная аппроксимация, пунктирная - 95%-й доверительный интервал
линейной и достоверной (rs = 0,968, p = 0,0001; рис. 1, б).
Под действием индукторов М1-поляризации LPS + IFNg значимо усиливалась продукция маркера классической активации макрофагов оксида азота (табл. 2). Воздействие ТС-13 дозозависимо увеличивало генерацию NO^ перитонеальными макрофагами вне зависимости от праймирова-ния LPS и IFNg (rS = 0,906, p = 0,0000 и rS = 0,716,
р = 0,0027 соответственно; рис. 2, а, б). В то же время синтез N0^, существенно повышенный при наличии в среде инкубирования вакцины БЦЖ, при дополнительном введении ТС-13 снижался (20 мкМ) либо не изменялся (100 мкМ) (см. табл. 2).
Экспрессия костимулирующих молекул регулируется внутриклеточным редокс-балансом, NF-кB-, МАРК-сигнальными путями и активно-
Таблица 2
Продукция NO' перитонеальными макрофагами мышей BALB/c, усл. ед. (Me (Q1-Q3))
Условия инкубирования Концентрация ТС-13 в среде инкубирования
0 мкМ 20 мкМ 100 мкМ
Контроль 1,04 (0,92-1,06) 1,61* (1,59-1,71) 2,16* (2,00-2,49)
LPS + IFNg (100 + 20 нг/мл) 1,32* (1,22-1,34) 1,48*# (1,35-1,60) 2,03*,# (1,76-2,36)
Вакцина БЦЖ (3:1) 2,10* (1,98-2,23) 1,51*t (1,45-1,57) 1,93* (1,56-2,44)
Концентрация ТС-13, мкМ Концентрация ТС-13, мкМ
Рис. 2. Зависимость продукции макрофагами NO' от концентрации ТС-13 при инкубировании в присутствии (а) или в отсутствие LPS + IFNg (б) (диаграмма рассеяния)
стью гистондеацетилазы; увеличение экспрессии CD86 связано как с продукцией АКМ, так и с активностью системы Keap1/Nrf2/ARE [3, 8, 32]. Соединения, активирующие Кг12-зависимый сигнальный путь, весьма разнообразны, но одной из их общих характеристик является способность модифицировать сульфгидрильные группы остатков цистеина, поэтому основное внимание исследователей направлено на влияние индукторов ARE на взаимодействие между полицисте-иновым сенсором Keapl и Nrf2, от которого зависит транскрипционная активность последнего [15, 34]. С другой стороны, множество исследований показали, что помимо АКМ-опосредованной модификации ингибиторного белка Keapl, индукторы ARE влияют и на сигнальные каскады, участвующие в регуляции Nrf2. Например, структурно схожий с ТС-13 трет-бутилгидрохинон активирует PBK/Akt-сигнальный путь [23], курку-мин - путь, зависящий от MAP-киназ (p38, JNK, ERK) [9]. Одним из эффекторов этих сигнальных путей является киназа гликогенсинтазы 3 (GSK-3), которая может интегрировать их влияние на Nrf2 при Keapl-независимой активации [33]. GSK-3 фосфорилирует Nrf2, вследствие чего усиливается экспорт транскрипционного фактора из ядра и, соответственно, уменьшается транскрипция Nrf2-зависимых генов. Активация PI3K/ Akt- и/или MAPK-сигнальных путей приводит к фосфорилированию самой GSK-3, снижению ее активности и, следовательно, увеличению активности Nrf2 [36, 37].
Макрофаги вовлечены во множество важных функций организма, включая защиту от инфекционных агентов, тканевый гомеостаз, репарацию, разрешение воспаления. Интерфероны второго типа (IFNy), секретируемые Т-хелперами первого типа и NK-клетками, являются одними из главных активаторов макрофагов [21]. IFNy, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране, инициирует ТАЮ/М^^ТАЛ-сигнальный каскад, что в итоге приводит к увеличению транскрипции IFNy-зависимых генов [31]. Кроме JAK-STAT1-сигнального пути, IFNy стимулирует экспрессию генов через STATl-независимый путь и активирует различные сигнальные каскады с участием адаптерного белка MyD88 [35], киназ p38 MAPK, PI3K и PKC [31]. Основными таргетными генами IFNy являются гены, кодирующие молекулы ги-стосовместимости I и II класса, провоспалитель-ные цитокины TNF-a и ИЛ-6, противомикробные белки, такие как NO-синтаза [31]. Активация PI3K IFNy играет важную роль в индукции IFNy-зависимых генов: так, ингибирование фермента блокирует IFNy-зависимое фосфорилирование
STAT1 и снижает STAT1-опосредованную транскрипцию [29].
Исходя из полученных данных, ТС-13 оказывает различные эффекты на параметры классической активации макрофагов. В отсутствие дополнительных стимулов, а также в низких концентрациях на фоне прототипических активаторов М1-поляризации (LPS + IFNg) ТС-13 угнетает экспрессию костимулирующих молекул, очевидно, за счет активации сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE и снижения продукции АКМ, являющихся одним из индукторов CD86. Благодаря наличию лабильной связи S-S в пара-про-пильном заместителе данный фенол нестабилен в слабощелочных растворах и образует симметричные дисульфиды за счет взаимодействия тиосульфоната с образующимися при гидролизе тиолятами, что позволяет ему взаимодействовать с сульфгидрильными группами остатков цистеи-на белка Keap1 и тем самым увеличивать транскрипционную активность Nrf2. В то же время в концентрации 100 мкМ соединение действует синергично со стимуляторами классической активации и бактериальными агентами (БЦЖ), увеличивая экспрессию CD86. Такой эффект может быть опосредован ^ар^независимой индукцией Nrf2 через PI3K-путь, дополнительная активация которого усиливает IFNy-зависимое фосфорилирование STAT1 и увеличивает экспрессию костимулирующих молекул.
Основным источником оксида азота в ма-крофагальных клетках является индуцибельная NO-синтаза (iNOS), однако макрофаги экспрес-сируют и конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (eNOS) [11]. Более того, как показано в экспериментах на нокаутных по eNOS мышах, при ее отсутствии в LPS-стимулированных макрофагах почти в 2 раза снижается экспрессия iNOS и NF-kB, генерация NO^ [11]. Nrf2 может влиять на активность eNOS несколькими путями: увеличивая экспрессию фермента посредством повышения экспрессии PPARy [20], способствуя повышению антиоксидантной защиты и тем самым снимая разобщающее действие АКМ на eNOS [19], увеличивая экспрессию диметиларги-ниндиметиламиногидролаз, которые метаболизи-руют асимметричный диметиларгинин, эндогенный ингибитор eNOS [20]. Кроме того, фермент может быть активирован за счет фосфорилирова-ния через PI3K/Akt-зависимый сигнальный путь, в том числе при стимуляции LPS [38].
ТС-13 оказывает дозозависимый эффект на продукцию NO^ макрофагами вне зависимости от дополнительной стимуляция IFNy и LPS, очевидно, реализуя все указанные пути стимуляции eNOS и последующей продукции оксида азота ин-
дуцибельной NO-синтазой. Аналогичный эффект соединения обнаружен нами ранее при стимуляции перитонеальных макрофагов LPS, при этом в указанном диапазоне концентраций ТС-13 инги-бировал активность аргиназы [7]. Микобактерия БЦЖ стимулировала продукцию NO^ перитоне-альными макрофагами, в присутствии 20 мкМ ТС-13 эффект снижался, но не был изменен при наличии в среде инкубирования 100 мкМ соединения, в обоих случаях генерация оксида азота была сопоставима с изолированным эффектом ТС-13 (см. табл. 2). Такие разнонаправленные эффекты можно связать с различными механизмами активации продукции NO^ микобактерией БЦЖ и ТС-13: БЦЖ стимулирует экспрессию iNOS и продукцию NO^ за счет активации NF-kB, а индукция Nrf2 снижает активность NF-kB и нивелирует его эффекты.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о неоднозначном эффекте индуктора системы Keap1/Nrf2/ARE синтетического фенола ТС-13 на активацию макрофагов по классическому пути: при его изолированном применении одни маркеры М1-поляризации увеличиваются (продукция NO^), другие снижаются (экспрессия CD86), в то время как при совместном применении с прототипическими индукторами классической активации либо наблюдался синергичный эффект, либо проявлялся феномен концентрационной инверсии. Любопытно, что ранее нами продемонстрирован аналогичный разнонаправленный эффект ТС-13: в низких концентрациях соединение увеличивало жизнеспособность макрофагоподобных клеток в обычных условиях и при окислительном стрессе, а в высоких концентрациях - снижало [2]. Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что деление макрофагов на классически и альтернативно активированные довольно схематично и применимо при анализе их функционирования в конкретные, как правило полярные, моменты течения воспаления (острая фаза - репарация, «fight or fix»), в более общем случае уместнее говорить о макрофагах, образно называемых клетками-хамелеонами [17, 18], как о континууме фенотипов [26]. Например, в моделях in vivo макрофаги могут экспрессировать и M1-, и М2-маркеры [16]; выделяют такие крупные субклассы макрофагов с гибридным либо специфическим фенотипом, как опухольассоциированные (TAMs), индуцированные микобактериальной инфекцией супрес-сорные (MIS), атеросклеротические (Mox, Mhem, M4), при этом показано, что на поздних стадиях развития атеросклеротической бляшки Nrf2 способствует переключению макрофагов с фенотипа M2 на M1 [27]. В целом можно заключить, что от
активности системы Keap1Nrf2/ARE зависит фе-нотипическая пластичность макрофагов, изменяющаяся в зависимости от окружающих условий, а также природы, интенсивности, продолжительности и момента воздействия индуктора сигнальной системы.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 14-04-00551а) с использованием оборудования ЦКП НИИ экспериментальной и клинической медицины «Современные оптические системы».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Зенков Н.К., МеньщиковаЕ.Б., Шкурупий В.А. Механизмы активации макрофагов // Успехи соврем. биологии. 2007. 127. (3). 243-256.
2. Лемза А.Е., Ткачев В.О., Зенков Н.К. и др. Структурно-функциональные особенности влияния новых водорастворимых фенольных антиоксидан-тов на жизнеспособность клеток // Сиб. науч. мед. журн. 2015. (2). 16-22.
3. Малышев И.Ю. Феномены и сигнальные механизмы репрограммирования макрофагов // Патологическая физиология и экспериментальная медицина. 2015. (2). 99-111.
4. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ткачев В.О. и др. Защитное действие ARE-индуцирующего фе-нольного антиоксиданта ТС-13 при хроническом воспалении // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2013. 155. (3). 305-309.
5. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Чечушков А.В. и др. Участие активированных кислородных метаболитов и редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в развитии гранулематоз-ного воспаления // Сиб. науч. мед. журн. 2015. (2). 32-36.
6. Просенко А.Е., Клепикова С.Ю., Кандалинце-ва Н.В. и др. Синтез и исследование антиоксидант-ных свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений // Бюл. СО РАМН. 2001. (1). 114-126.
7. Ткачев В.О., Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. и др. Синтетический водорастворимый фенольный антиоксидант регулирует метаболизм L-аргинина в макрофагах: возможная роль Nrf2/ARE // Биохимия. 2010. 75. (5). 637-643.
8. Al-Huseini L.M., Aw Yeang H.X., Sethu S. et al. Nuclear factor-erythroid 2 (NF-E2) p45-related factor-2 (Nrf2) modulates dendritic cell immune function through regulation of p38MAPK-CREB/ATF1 signalling // J. Biol. Chem. 2013. 288. 22281-22288.
9. Balogun E., Hoque M., Gong P. et al. Curcumin activates the haem oxygenase-1 gene via regulation
of Nrf2 and the antioxidant-responsive element // Biochem. J. 2003. 371. 887-895.
10. Brune B., Dehne N., Grossmann N. et al. Redox control of inflammation in macrophages // Antioxid. Redox Signal. 2013. 19. 595-637.
11. Connelly L., Jacobs A.T., Palacios-Callen-der M. et al. Macrophage endothelial nitric-oxide synthase autoregulates cellular activation and proinflammatory protein expression // J. Biol. Chem. 2003. 278. 26480-26487.
12. Crook-McMahon H.M., Olahova M., Button E.L. et al. Genome-wide screening identifies new genes required for stress-induced phase 2 detoxification gene expression in animals // BMC Biol. 2014. 12. 64.
13. Gharib S.A., Johnston L.K., Huizar I. et al. MMP28 promotes macrophage polarization toward M2 cells and augments pulmonary fibrosis // J. Leukoc. Biol. 2014. 95. 9-18.
14. Harvey C.J., Thimmulappa R.K., Sethi S. et al. Targeting Nrf2 signaling improves bacterial clearance by alveolar macrophages in patients with COPD and in a mouse model // Sci. Transl. Med. 2011. 3. 78ra32.
15. Holland R., Fishbein J.C. Chemistry of the cysteine sensors in Kelch-like ECH-associated protein 1 // Antioxid. Redox Signal. 2010. 13. 1749-1761.
16. Kigerl K.A., Gensel J.C., Ankeny D.P. et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord // J. Neurosci. 2009. 29. 13435-13444.
17. Kolattukudy P., Sirakova T., Kapoor N. Macrophage: How the chameleon responds to the environment? // Macrophage. 2015. 2. e927.
18. Lee E., Kilfeather S.A. Airway macrophages and dendritic cells // Cellular Mechanisms in Airways Inflammation / Eds. C.P. Page, K.H. Banner, D. Spina. Basel; Boston; Berlin: Birkhäuser Basel, 2000. P. 199222.
19. Li H., Horke S., Forstermann U. Vascular oxidative stress, nitric oxide and atherosclerosis // Atherosclerosis. 2014. 237. 208-219.
20. Luo Z., Aslam S., Welch W.J., Wilcox C.S. Activation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 coordinates dimethylarginine dimethylaminohydrolase/ PPAR-g/endothelial nitric oxide synthase pathways that enhance nitric oxide generation in human glomerular endothelial cells // Hypertension. 2015. 65. 896-902.
21. MacMicking J.D. Recognizing macrophage activation and host defense // Cell Host Microbe. 2009. 5. 405-407.
22. Malhotra D., Portales-Casamar E., Singh A. et al. Global mapping of binding sites for Nrf2 identifies novel targets in cell survival response through ChIP-Seq profiling and network analysis // Nucleic Acids Res. 2010. 38. 5718-5734.
23. Martin D., Rojo A.I., Salinas M. et al. Regulation of heme oxygenase-1 expression through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and the
Nrf2 transcription factor in response to the antioxidant phytochemical carnosol // J. Biol. Chem. 2004. 279. 8919-8929.
24. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization // Front. Biosci. 2008. 13. 453-461.
25. Menshchikova E., Tkachev V., Lemza A. et al. Water-soluble phenol TS-13 combats acute but not chronic inflammation // Inflamm. Res. 2014. 63. 729740.
26. Mills C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease // Crit. Rev. Immunol. 2012. 32. 463-488.
27. Mimura J., Itoh K. Role of Nrf2 in the pathogenesis of atherosclerosis // Free Radic. Biol. Med. 2015. 88. 221-232.
28. Naito Y., Takagi T., Higashimura Y. Heme oxygenase-1 and anti-inflammatory M2 macrophages // Arch. Biochem. Biophys. 2014. 564. 83-88.
29. Nguyen H., Ramana C.V., Bayes J., Stark G.R. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase in interferon-g-dependent phosphorylation of STAT1 on serine 727 and activation of gene expression // J. Biol. Chem. 2001. 276. 33361-33368.
30. Palanisamy G.S., Kirk N.M., Ackart D.F. et al. Evidence for oxidative stress and defective antioxidant response in Guinea pigs with tuberculosis // PLoS One.
2011. 6. e26254.
31. PlataniasL.C. Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated signalling // Nat. Rev. Immunol. 2005. 5. 375-386.
32. Rangasamy T., Williams M.A., Bauer S. et al. Nuclear erythroid 2 p45-related factor 2 inhibits the maturation of murine dendritic cells by ragweed extract // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2010. 43. 276-285.
33. Rojo A.I., Medina-Campos O.N., Rada P. et al. Signaling pathways activated by the phytochemical nordihydroguaiaretic acid contribute to a Keap1-independent regulation of Nrf2 stability: Role of glycogen synthase kinase-3 // Free Radic. Biol. Med.
2012. 52. 473-487.
34. Saito R., Suzuki T., Hiramoto K. et al. Characterizations of three major cysteine sensors of Keap1 in stress response // Mol. Cell. Biol. 2015. [Epub ahead of print]. doi 10.1128/MCB.00868-00815.
35. Sun D., Ding A. MyD88-mediated stabilization of interferon-g-induced cytokine and chemokine mRNA // Nat. Immunol. 2006. 7. 375-381.
36. Thornton T.M., Pedraza-Alva G., Deng B. et al. Phosphorylation by p38 MAPK as an alternative pathway for GSK3b inactivation // Science. 2008. 320. 667-670.
37. Van Weeren P.C., de Bruyn K.M., de Vries-Smits A.M. et al. Essential role for protein kinase B (PKB) in insulin-induced glycogen synthase kinase 3 inactivation. Characterization of dominant-negative mutant of PKB // J. Biol. Chem. 1998. 273. 1315013156.
38. Yao H., Han X. The cardioprotection of the insulin-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway // Am. J. Cardiovasc. Drugs. 2014. 14. 433-442.
39. Zhang M., An C., Gao Y. et al. Emerging roles of Nrf2 and phase II antioxidant enzymes in neuroprotection // Prog. Neurobiol. 2013. 100. 30-47.
40. Zhang Y., Choksi S., Chen K. et al. ROS play a critical role in the differentiation of alternatively activated macrophages and the occurrence of tumor-associated macrophages // Cell Res. 2013. 23. 898-914.
INDUCTION OF REDOX-SENSITIVE Keap1/Nrf2/ARE SYSTEM ALTERS CLASSICAL ACTIVATION OF MACROPHAGES
Peter Mikhaylovich KOZHIN1, Nikolay Konstantinovich ZENKOV1, Anna Evgen'evna LEMZA1, Anton Vladimirovich CHECHUSHKOV1, Natal'ya Sergeevna ZAITSEVA1, Natal'ya Valer'evna KANDALINTSEVA2, Elena Bronislavovna MENSHCHIKOVA1
1 Research Institute for Experimental and Clinical and Medicine 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
2 Novosibirsk State Pedagogical University 630126, Novosibirsk, Viluyskaya str., 28
The aim of the study was to investigate the effect of phenolic antioxidant 3-(3'-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)propyl thiosulfonate sodium (TS-13), which induces redox-sensitive Keap1/Nrf2/ARE system, on classical polarization of macrophages. The influence of TS-13 on expression of costimulatory molecule CD86 and nitric oxide (NO^) production by peritoneal macrophages of BALB/c mice has been studied. TS-13 has been found to inhibit surface antigen CD86 expression in the absence of additional priming with IFNy and LPS, as well as in low concentrations in the presence of IFNy and LPS. High concentrations (100 ^M) of TC-13 have a synergistic effect with inducers of classical activation and bacterial agents (BCG) and increase expression of costimulatory molecules. Further, TS-13 dose-dependently stimulates the production of NO^ by macrophages, regardless of the additional stimulation of IFNy + LPS or bCg. The data suggest that the induction of Keap1/Nrf2/ARE system, which activates the defense mechanisms against aggressive influences (including changes in redox status), can both inhibit and enhance macrophage activation by the classical pathway.
Key words: Keap1/Nrf2/ARE signal system, TS-13, macrophage polarization, CD86, nitric oxide.
Kozhin P.M. - researcher, laboratory of molecular mechanisms of free radical processes, e-mail: kozhinpm@gmail.com
Zenkov N.K. - doctor of biological sciences, leading researcher, laboratory of molecular mechanisms of free radical processes, e-mail: lemen@centercem.ru
Lemza A.E. - candidate of biological sciences, researcher, laboratory of molecular mechanisms of free radical processes, e-mail: lemza.ae@yandex.ru
Chechushkov A.V. - researcher, laboratory of molecular mechanisms offree radical processes, e-mail: achechushkov@gmail.com
Zaitseva N.S. - candidate of biological sciences, researcher, laboratory of molecular mechanisms offree radical processes, e-mail: nszaitseva@gmail.com
Kandalintseva N.V. - candidate of chemical sciences, director of Institute of Natural, Social and Economic Sciences, e-mail: aquaphenol@mail.ru
Menshchikova E.B. - doctor of medical sciences, head of the laboratory of molecular mechanisms of free radical processes, e-mail: lemen@centercem.ru
