CC BY
78
Медицинская Иммунология 2008, Т. 10, № 2-3, стр. 269-272 © 2008, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОТРОПНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ IN VITRO
Клепикова С.Ю.1, Колесникова О.П.2, Просенко А.Е.3, Кандалинцева Н.В.3
1 ГОУВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Новосибирск
2 ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
3 НИИ химии антиоксидантов НГПУ, г. Новосибирск
Резюме. Проведено исследование иммунотропных свойств соединений ю-(3,5-ди-метил-4-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (Ф-11-7) и ю-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (Ф-17-7) на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки в культуре in vitro. Обнаружено, что соединения Ф-11-7 и Ф-17-7 дозозависимо подавляют пролиферацию интактных спленоцитов.
Ключевые слова: водорастворимые антиоксиданты, иммунотропные препараты.
Klepikova S.Yu., Kolesnikova O.P., Prossenko A.Ye., Kandalintceva N.V.
in vitbd immunotropicity studies of polyfunctional water-soluble antioxidants
Abstract. A study of immunotropic properties of o>-(3,5-dimethyl-4-hydroxyphenyl) propylthiosulfonate, sodium salt (F-11-7), and o>-(3,5-di-tret-butil-4-hydroxyphenyl) propylthiosulfonate, sodium salt (F-17-7) was carried out, employing an in vitro model of spontaneous and mitogen- stimulated proliferation of cultured spleen cells. It is revealed, that the F-11-7 and F-17-7 compounds are able to suppress proliferation of intact splenocytes in a dose-dependent manner. (Med. Immunol., 2008, vol. 10, N2-3, pp 269-272)
Введение
В настоящее время активированные кислородные метаболиты (АКМ) и окислительные реакции с их участием рассматриваются как универсальный механизм регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, в том числе в клетках иммунной системы [2]. Актуальной проблемой является поиск иммуноактивных соединений с относительно селективным механизмом действия, который сдерживается отсутствием адекватных моделей. Аналогичные проблемы существуют для изучения антиоксидантных свойств препаратов [3]. В единичных работах предпринимаются шаги для разработки системы оценки иммунотропных пре-
Адрес для переписки:
Клепикова Софья Юрьевна
630064, г. Новосибирск, пр. Карла Маркса, 14, к. 37. Тел.: 8(913) 904-15-78.
E-mail: klepikova.sofya@mail.ru
паратов на основе анализа взаимосвязи иммунной и антиоксидантной систем [6]. Нами ранее в модельных системах тестирования, основанных на окислении этилолеата в водно-эмульсионной среде, образовании малонового диальдегида при инкубации выделенных липопротеинов низкой плотности с ионами металлов переменной валентности и дыхательном «взрыве» грануло-цитов, стимулированном зимозаном, показана высокая антиокислительная активность соединений Ф-17-7 и Ф-11-7 [5]. Данные соединения представляют собой новые водорастворимые антиоксиданты, содержащие в своей структуре два активных фрагмента — стерически затрудненный фенольный и тиосульфонатный [4].
Целью настоящей работы является исследование иммуноактивных свойств соединений в тестах спонтанной и митоген-стимулированной пролиферации клеток селезенки в культуре in vitro.
Материалы и методы
В работе использовали здоровых половозрелых животных - самцов мышей гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1), 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г, полученных из питомника («Рассвет», г. Томск). Животные содержались в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей), на стандартном рационе, при естественном освещении. Клетки селезенки мышей CBF1 культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций («Linbro») при +37°С в атмосфере 5% СО2 и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200 000. Клетки стимулировали митогенами конканавали-ном А (СопА, «Sigma») или митогеном лаконоса (PWM, «Sigma»). Концентрации митогенов подбирали предварительным титрованием и использовали в оптимальной дозе, что составило для СопА 2 мкг/мл, а для PWM 1 мкг/мл. Соединения Ф-17-7 и Ф-11-7 в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению НЗ-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 часов до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянноволокнистые фильтры («Flow Lab») с помощью аппарата Harvester («Titertek»). Радиоактивность подсчитывали в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США).
Результаты и обсуждение
Важную роль в развитии иммуносупрессии играет усиление свободнорадикальных реакции и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран. Активация ПОЛ приводит к изменению структуры их двойного фос-фолипидного слоя, конформации и взаимного расположения мембранных рецепторов, нарушению функции транспортных и канальных белков, инактивации мембраносвязанных ферментов. АКМ, являясь продуктами ПОЛ, дезорганизуют структуру мембран различных клеток, в первую очередь гепатоцитов, эритроцитов и иммуноци-тов [7]. Образование и расходование АКМ находится под контролем многоступенчатой анти-оксидантной системы, а сами антиоксиданты являются универсальными мембраностабили-заторами. Разветвленная сеть антиоксидантов препятствует каскадному радикалообразованию в иммунокомпетентных клетках. При этом функциональные возможности иммунокомпетентных клеток определяются их внутриклеточными метаболическими процессами, среди которых ключевую роль играют процессы свободнорадикального окисления и образования АКМ [2].
100
спонтанная ConA PWM LPS
■ Ф-11-7 (20 мкг/мл) □ Ф-17-7 (20 мкг/мл)
□ Ф-11-7 (200 мкг/мл) □ Ф-17-7 (200 мкг/мл)
Рисунок 1. Влияние водорастворимых антиоксидантов Ф-11-7 и Ф-17-7 на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки in vitro
Нами ранее показано, что добавление в культуры мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных хроническим гепатитом С (ХГС) соединения Ф-17-7 в дозе 0,2 мкг/мл приводило к усилению пролиферативной активности МНК у 75% больных ХГС [8].
Возможность иммунотропных препаратов регулировать пролиферативную активность им-мунокомпетентных клеток исследовали в присутствии соединений Ф-17-7, Ф-11-7 в дозах
2 мкг/мл, 20 мкг/мл и 200 мкг/мл на спонтанную и стимулированную митогенами ConA, PWM, LPS пролиферацию Т- и В- клеток селезенки ин-тактных мышей. Полученные результаты представлены на рисунке 1.
Установили, что соединение Ф-11-7 в дозе 20 мкг/мл дозозависимо подавляет спонтанную пролиферацию на 47%, а ConA, PWM и LPS-стимулированную пролиферацию клеток селезенки соответственно на 43%, 45% и 39%, а в дозе 200 мкг/мл — спонтанную на 58%, ConA — на 75%, PWM - на 72% и LPS - на 69%.
Соединение Ф-17-7 в двух дозах подавляет спонтанную пролиферацию соответственно на 62% и 80%. В дозе 20 мкг/мл ингибиция митоген-индуцированной пролиферации равна: ConA - на 55%, PWM - на 53%, LPS - на 56%. При этом подавление ConA, PWM и LPS-стимулированной пролиферации клеток селезенки в дозе 200 мкг/мл сводится практически до ноля.
Низкие дозы соединений Ф-11-7 и Ф-17-7, по всей видимости, угнетают функциональную активность иммунокомпетентных клеток, снижая их способность адекватно отвечать на стимуляцию митогеном. Так, соединения Ф-11-7 и Ф-17-7 в дозе 2 мкг/мл не проявляют значи-
2008, Т. 10, № 2-3
Иммунотропность водорастворимых антиоксидантов
100
спонтанная ConA PWM LPS
■ Ф-11-7 (2 мкг/мл) □ Ф-17-7 (2 мкг/мл)
Рисунок 2. Влияние водорастворимых антиоксидантов Ф-11-7 и Ф-17-7 на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки in vitro
тельного эффекта на ингибицию спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации.
При обследовании крови больных ревматоидным артритом было обнаружено, что соединения Ф-11-7 и Ф-17-7 в дозе 200 мкг/мл резко подавляли спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию лимфоцитов периферической крови. Соединение Ф-11-7 ингибировало спонтанную - на 77%, ConA - на 96%, PWM - на 57%, соединение Ф-17-7 соответственно спонтанную - на 91%, ConA - на 98%, PWM - на 98%. Полученные результаты совпадают с данными предыдущих опытов, проведенных на клетках селезенки интактных мышей in vitro.
Подавление Т- и В-клеточной пролиферации возможно связано с удалением супероксидного радикала из среды культивирования водорастворимыми антиоксидантами Ф-11-7 и Ф-17-7. Известно [1], что удаление супероксидного радикала из среды культивирования с помощью СОД приводит к снижению уровня стимулированной ConA пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови человека и спленоцитов мышей [1]. Можно предположить, что исследуемые антиоксиданты действуют подобно СОД.
Таким образом, нами выявлено ингибирующее влияние соединений Ф-11-7 и Ф-17-7 в дозах 20 мкг/мл и 200 мкг/мл на пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток in vitro и в дозе 200 мкг/мл на пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека, больного ревматоидным артритом.
Данные об иммуноактивных свойствах in vitro и in vivo антиоксидантов многочисленны и достаточно противоречивы. По данным [10], лимфоциты крови, инкубированные in vitro c 1 x l0-9 M в-каротина и стимулированные ConA, проявляли усиление пролиферации, а по данным [13], в-каротин в дозе от 1 x 10-6 до 1 x 10-5 М - ин-
гибирует пролиферацию лимфоцитов in vitro. Стимуляторная активность в-каротина на лимфоцитарный бластогенез показана на разных видах животных. В/м введение от 20 до 40 мг в-каротина зрелым [11] и новорожденным морским свинкам усиливает пролиферацию лимфоцитов крови. Аналогично, увеличение ConA- и LPS-индуцированной пролиферации лимфоцитов наблюдали у крыс, содержащихся на диете с 2% содержанием в-каротина по весу и аналогом в-каротина [9]. В то же время показано, что ресвератрол дозозависимо подавляет ConA и LPS-индуцированную пролиферацию спленоцитов [12], но в низких дозах (0,75-6 мкмоль/л) приводит к ее усилению [14].
Список литературы
1. Вольский Н.Н., Кашлакова Н.В., Козлов В.А. Влияние супероксидного радикала на пролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном // Цитология. — 1988. — № 7. — С.899-901.
2. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщико-ва Е.Б. Окислительный стресс. — М.: Наука, 2001. - 315 с.
3. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные биоантиоксиданты. — Новосибирск: СО РАМН, 2003. — С. 7-11.
4. Кандалинцева Н.В., Дюбченко О.И., Клепикова С.Ю., Терах Е.И., Просенко А.Е. Синтез полифункциональных водорастворимых антиоксидантов на основе ю-(4-оксиарил) галогеналка-нов // Тез. докл. III Международной конф. «Современные проблемы органической химии». — Новосибирск: СО РАН, 2001. — С. 95.
5. Просенко А.Е., Клепикова С.Ю., Кандалинцева Н.В., Дюбченко О.И., Зенков Н.К. Синтез и исследование антиоксидантных свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений // Бюллетень СО РАМН. — 2001. — № 1. — С. 114-119.
6. Тутельян А.В. Разработка системы оценки иммунотропных препаратов природного и синтетического происхождения на основе анализа взаимосвязи иммунной и антиоксидантной защиты // Аллергология и иммунология. — 2004. — Т. 5, № 2. — С. 289-299.
7. Утешев Б.С., Быстрова Н.А., Бровкина И.Л., Авакян А.Р. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие витаминов А и Е при воздушном и иммерсионном охлаждении // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2001. — Т. 64, № 1. — С. 60-63.
8. Фридлянд И.Ф., Просенко А.Е., Клепикова С.Ю., Кандалинцева Н.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние антиоксидантов на функциональную активность
мононуклеарных клеток периферической крови больных вирусным гепатитом С // Мед. иммунология. — 2001. — Т. 3, № 2. — С. 243.
9. Bendich A., Shapiro S.S. Effect of в-carotene and canthaxanthin on the immune responses of the rat // J. Nutr. — 1986. — N 11. — P. 2254-2262.
10. Daniel L.R., Chew B.P., Tanaka T.S., Tjoelk-er L.W. In vitro effects of в-carotene and vitamin A on peripheral blood mononuclear cell proliferation // J. Dairy Sci. — 1990. — N 3. — P. 74-911.
11. Hoskinson C.D., Chew B.P., Wong T.S. Effects of в-carotene (BC) and vitamin A (VA) on mitogen-induced lymphocyte proliferation in the pig in vivo // Fed. Am. SOC. Exp. Biol. J. — 1989. — N 3. — P. 663.
12. Sharma S., Chopra K., Kulkarni S.K., Agre-wala J.N. Resveratrol and curcumin suppress immune
response through CD28/CTLA-4 and CD80 co-stimulatory pathway // Clin. Exp. Immunol. — 2006. — N 5. — P. 147, 155-163.
13. Tjoelker L.W, Chew B.P., Tanaka T.S., Danie L.R. Bovine vitamin A and в-carotene intake and lactational status. Responsiveness of mitogen-stimulated peripheral blood lymphocytes to vitamin A and в-carotene challenge in vitro // J. Dairy Sci. — 1988. — N 1. — P. 71, 3120-3127.
14. Wen-Liang Z., Wu Qing-Li, LI Xiao-Yu, Wei-Min Z., Zou Jian-Ping. Low dose of resveratrol enhanced immune response of mice // Acta Pharmacol. Sin. — 2002. — N 10. — P. 893-897.
поступила в редакцию 25.05.2007 отправлена на доработку 10.06.2007 принята к печати 04.02.2008
