CC BY
53
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616-006-022:578.825.13]:577.21.083
Сенюта Н.Б., Смирнова К.В., Дидук С.В., Гончарова Е.В., Щербак Л.Н., Гурцевич В.Э.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОНКОГЕНА LMP1 У БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ, АССОЦИИРОВАННЫМИ И НЕ АССОЦИИРОВАННЫМИ
С ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА—БАРР
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва
Герпесвирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) — этиологический агент ряда доброкачественных и злокачественных новообразований человека, включая инфекционный мононуклеоз, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина, неходжкинские лимфомы, рак носоглотки и другие. Латентный мембранный белок 1 (ЬМР1), кодируемый одноименным геном ЬМР1, является основным белком-онкогеном ВЭБ. Он представляет собой трансмембранный белок, способный активировать множество сигнальных путей и транскрипционных факторов клетки, что приводит к ее трансформации. Молекулярный анализ ЬМР1 различного клинического происхождения выявил варианты гена с разными типами мутаций, которые являются причинами изменения его биологической активности. Поскольку роль ЬМР1 в возникновении рака носоглотки (РНГ) до сих пор до конца не изучена, представлялось важным выяснить, чем образцы ЬМР1 от больных ВЭБ-ассоциированными формами РНГ отличаются от таковых у больных с другими опухолями, также расположенными в полости рта (ДОПР), но не ассоциированными с этим вирусом. В отличие от единичных подобного рода работ, выполненных в эндемичных регионах, настоящее исследование, направленное на сравнение генетической структуры и трансформирующей активности вариантов ЬМР1 от больных РНГ и ДОПР, проведено в неэндемичном регионе, России, где РНГ диагностируют достаточно редко. Полученные данные свидетельствуют о структурном и функциональном сходстве вариантов ЬМР1 у больных обеих групп и соответственно о генетическом родстве штаммов ВЭБ, персистирующих у этих больных. Проведенные исследования позволяют предположить, что в неэндемичных регионах отсутствует специальный вариант вируса, вызывающий РНГ: любой штамм ВЭБ с любой структурой ЬМР1, по-видимому, может стать этиологическим агентом РНГ. Однако, согласно современным представлениям, РНГ у инфицированных ВЭБ лиц может возникнуть лишь при наличии уникального паттерна НЪА, ассоциированного с высокой чувствительностью к развитию РНГ и дополнительном воздействии на них вредных факторов внешней и внутренней среды, способствующих накоплению в инфицированных клетках эпителия определенного числа мутаций, необходимых для инициации ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза. Ключевые слова: вирус Эпштейна—Барр, рак носоглотки, другие опухоли полости рта, латентный мембранный белок 1 (ЬМР1), полиморфизм, трансформирующая активность ЬМР1.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-71-75
Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) является убиквитарным лим-фотропным гамма герпесвирусом человека 4-го типа, который пожизненно инфицирует 95% населения всего земного шара. Примечательно, что легкость распространения этого вируса может быть частично обусловлена его способностью устанавливать различные программы экспрессии генов, которые позволяют вирусу адаптироваться к различным типам клеток хозяина. Вариабельностью экспрессии вирусных генов можно также объяснить широкий круг ассоциированных с этим вирусом заболеваний. Геномы ВЭБ и продукты его генов постоянно обнаруживаются при различных новообразованиях человека, включая эндемичную форму лимфо-мы Беркитта (ЛБ), рак носоглотки, посттрансплантационную лим-фому, СПИД-ассоциированные лимфомы, определенные варианты лимфомы Ходжкина, назальную ТЖК-клеточную лимфому, периферическую Т-клеточную лимфому, лимфоэпителиома-подобную аденокарциному желудка и другие [1].
Повсеместное распространение ВЭБ побудило многих ис-
следователей искать его причинную связь с другими злокачественными новообразованиями человека, такими как рак молочной железы [2], рак легкого [3], опухоли кроветворной системы [4—7], опухоли центральной нервной системы [8] и т.д. Несмотря на обнаружение признаков связи ВЭБ с некоторыми патологиями, этиологическая роль вируса в большинстве случаев не отвечала критериям, сформулированным в руководстве Филдса [9], заключающимся в облигатном обнаружении ВЭБ практически в каждой клетке, причем обязательно в виде моноклональ-ных плазмид, что указывало бы на происхождение опухоли из единственной инфицированной вирусом клетки. В случае новообразований эпителиального происхождения вирусная ДНК должна присутствовать уже в диспластических поражениях, подтверждая тем самым участие вируса на ранних этапах онко-генеза. Кроме того, по крайней мере, хотя бы один ген латентной инфекции должен быть экспрессирован, что свидетельствовало бы об активной роли вируса в поддержании опухолевого процесса. В любом случае доказательство этиологической роли ВЭБ является нелегкой задачей, поскольку для индуцирования каждой опухоли вирус модифицирует свою функциональную активность, в том числе в зависимости от участвующих в процессе канцерогенеза кофакторов, без которых у большинства вирусоносителей ВЭБ-ассоциированная опухоль никогда не возникнет.
Некоторые из ВЭБ-ассоциированных новообразований, в частности ЛБ и рак носоглотки (РНГ), характеризуются ограниченным географическим и расовым распространением [10, 11]. В частности, в большинстве стран мира РНГ встречается достаточно редко. К эндемичным регионам относят южные провинции Китая, страны Юго-Восточной Азии и Средиземноморья, в которых заболеваемость РНГ колеблется от 5 до 30 случаев на 100 тыс. населения. Высокая заболеваемость РНГ обнаружена также у эскимосов-идейцев и алеутов Аляски [12]. Этиологическая роль ВЭБ в патогенезе РНГ подтверждается присутствием клональных геномов вируса в предраковых и раковых поражениях носоглотки и экспрессией в опухолевых клетках целого спектра вирусных маркеров на РНК или даже ДНК уровнях [13, 14]. В пользу этиологической роли вируса свидетельствует и тот факт, что возникновение РНГ сопровождается высокими титрами гуморальных IgG и особенно IgA антител к белкам ВЭБ, обнаруживаемых уже на ранних и даже преклинических стадиях болезни [15]. Кроме того, также на начальных этапах возникновения этой опухоли в плазме большинства больных обнаружены существенно увеличенные уровни фрагментов ДНК ВЭБ [16]. Все перечисленные факты тесной ассоциации ВЭБ с РНГ получены при проведении исследований в географических зонах, эндемичных для этого заболевания.
Среди латентных белков, кодируемых геномом ВЭБ, в разной степени ответственных за трансформирующий потенциал вируса, принципиально важную роль в канцерогенезе РНГ играет латентный мембранный белок 1 (LMP1). В качестве основного онкогена, кодируемого ВЭБ, LMP1 функционирует как вирусный имитатор члена семьи TNFR, CD40, который извращает передачу клеточных сигналов, что ведет к морфологическим и фенотипическим изменениям в эпителиальных клетках [17]. LMP1 активирует также эпидермально-мезенхимальный переход (EMT) и способствует высокой метастатической активности РНГ [18]. Кроме того, EMT, обусловленный функционированием LMP1, сопровождается экспрессией маркеров раковых стволовых клеток (С$С)/раковых клеток-предшественников (CPC) (CD44high/CD24low) и приобретением ими свойств стволовых клеток/клеток-предшественников [19]. В клетках РНГ BART микроРНК, кодируемые областью BamHI-А вирусного генома, являются наиболее распространен-
Для корреспонденции: Гурцевич Владимир Эдуардович, gurv-lad532@yahoo.com
ными транскриптами [20]. Они модулируют апоптоз и врожденные иммунные механизмы защиты. LMP1, секретируемый с помощью экзосом, внедряется в не инфицированные ВЭБ клетки путем эндоцитоза и воздействует на ткани, окружающие опухоль. Кроме того, показано, что LMP1 подавляет межклеточную адгезию и активирует подвижность клеток посредством активации ETS-1 и с-Met и экспрессии eziin^ [21—23]. Было также показано, что LMP1 индуцирует экспрессию муцина 1 (MUC1), который играет важную роль в инвазии опухоли и ее метастазирова-нии [24]. LMP1 влияет не только на саму опухолевую клетку, но и на деградацию стромы, окружающую опухоль, через усиление активности различных ММР и подавление RECK1, ингибитора MT1-MMP [25—28]. Индукция MMP LMP1, как было показано, осуществляется через клеточные сигнальные системы, такие как NF-kB, AP-1, ETS-1 и ERKMAPK [25, 27, 28]. Недавно также сообщалось о роли LMP1, IL-6 и ламинина в усилении метастатической активности РНГ [29].
Несмотря на всестороннее изучение трансформирующих потенций ВЭБ и его основного онкогена LMP1, роль последнего в возникновении РНГ окончательно не выяснена. Особенно неясен механизм ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза РНГ в неэндемичных областях. Исходя из этого, целью данной работы стало сравнительное изучение в России, неэндемичном регионе, особенностей генетической структуры и трансформирующей активности LMP1 у больных с ВЭБ-ассоциированными (РНГ) и не ассоциированными с этим вирусом другими опухолями (ДОПР), также локализованными в полости рта.
Материал и методы
Группы больных и образцы ДНК. Объектом для изучения стали образцы опухолевой ткани, крови, а также смывов ротоглотки от 21 больного РНГ, 14 больных ДОПР и 19 доноров крови (все участники исследования — жители России). В состав больных ДОПР вошли больные раком слизистой оболочки полости рта, языка, подъязычной миндалины и некоторыми другими злокачественными поражениями полости рта. Проведенное исследование, в которое больные РНГ и ДОПР вошли с их согласия в результате случайной выборки, было одобрено Комитетом по этике при ФГБНУ РОНЦ имени Н.Н. Блохина.
Экстракция ДНК и сиквенс ПЦР-продуктов. Из собранного для исследования биологического материала выделяли ДНК методом фенол-хлороформной депротеинизации. Наличие и концентрацию препаратов ДНК анализировали методом ПЦР в реальном времени, описанным нами ранее [30]. Для секвенирова-ния ДНК использована панель реагентов ABI PRISM Big Dye™ Terminator, v.3.1 с по следующим анализом продуктов реакции на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant. Обработку данных проводили с помощью программ Chromas 230 и Vector NTI.
Плазмиды. Векторные конструкции pSG5-LMP1-B95.8 и pSG5-LMP1-Cao были любезно предоставлены Ф. Грассером (Гамбург, Германия). Исследуемые варианты гена LMP1 с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции переклонированы нами из системы pGEM-T Easy («Promega», США) в эукариотический экспрессирующий вектор pSG5 и в ретрови-русный вектор pBabe-puro (pBabe).
Культуры клеток, приготовление ретровирусного стока и трансдукция. Все клеточные линии культивировали на среде DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), 2 мML-глутамина, 100 ед/мл гентамицина и 5% С02 при 37°C. Клетки линии Phi-NX-Am-phoPhoenix-A (дериват клеток HEK293) трансфецировали генетическими конструкциями, созданными на основе pBabe-puro с использованием LipofectAMINEPlus («Invitrogen», США) в соответствии с инструкциями производителя. Трансдукцию клеточной линии Rat-1 полученными вирусными частицами проводили по методике, описанной нами ранее [31].
Получение клеточных лизатов и вестерн-блот-анализ. Клеточные лизаты линии Rat-1, постоянно экспрессирующие различные варианты LMP1, получали описанным ранее методом [31]. Для проведения вестерн-блот-анализа использовали моно-клональные антитела к ß-катенину («Sigma», США) и к LMP1 — S12 (получены от Ф. Грассера, Гамбург, Германия). Метод также был описан нами ранее [31].
Анализ способности к образованию фокусов трансформации. По 400 клеток каждой культуры высевали на 35 мм чашку Петри (по 3 чашки на линию). В среду DMEM добавляли 10% FBS. Культивировали в течение 1—1,5 нед. После образования колоний среду сливали, клетки промывали PBS. Затем фиксировали 70% этиловым спиртом в течение 2 мин, после чего клетки окрашивали водным раствором красителя Crystalviolet в течение 2 мин. Краску затем сливали, клетки подсушивали на воздухе. Количество колоний подсчитывали с помощью лупы.
Статистический анализ. Точный тест Фишера использовали для оценки достоверности различий между процентным содержанием вариантов LMP1 в аналогичных биологических образцах двух групп больных, РНГ и ДОПР. Статистически значимыми считали значения p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Структурные особенности онкогена LMP1 у больных РНГ и ДОПР. Для выяснения вопроса, различаются ли варианты LMP1 у больных РНГ и ДОПР, исследовали С-терминальную область гена в образцах опухолевой ткани, крови и смывов ротоглотки (СР) этих больных. Анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных (а.к.) последовательностей из полученных ам-пликонов показали (табл. 1), что они варьируют, но в целом совпадают с вариантами, описанными в литературе: B95.8/A, Cao/ China1, Mediterranean + (Med +), Med - and North Carolina (NC) [32—34]. Аминокислотные последовательности, обнаруженные в 4 образцах LMP1, отличавшиеся между собой и от всех известных вариантов, были обозначены нами как образцы «вне варианта» (ВВ). Все они получены от больных РНГ: 2 из опухолевой ткани и по одному из крови и СР соответственно. Из табл.1 также следует, что низкодивергентный вариант LMP1B95 8/A, характеризующийся небольшим числом (3—4) а.к. замен (по сравнению с прототипным вариантом LMP1B95 8), доминировал в образцах крови доноров, достигая 78,9% (15/19). У больных РНГ и ДОПР частота обнаружения этого варианта не превышала 30%. В настоящем исследовании высокотуморогенный вариант LMP1Chim1, относящийся по структурной и функциональной характеристикам к китайскому варианту «Сао», чаще всего выявляли в образцах крови (58,3%, 7/13), опухолевой ткани (35,7%, 5/14) и СР (33,3%, 3/9) больных ДОПР. У больных РНГ, напротив, в образцах опухоли (33,3%, 7/21) и СР (30%, 6/20) чаще обнаруживали высоко туморогенный вариант LMP1Med+. Совокупное содержание вариантов China1 и Med + в опухолевой ткани обеих групп больных существенно не различалось (42,8%, 9/21 и 57,1%, 8/14 соответственно; p > 0,05). Менее туморогенные варианты, в частности Med-, в более высоком проценте случаев выявляли в образцах крови больных РНГ (43,8%, 7/16), а вариант NC был относительно равномерно распределен во всех тестируемых образцах и колебался от 4,8% в опухолевой ткани больных РНГ до 15% в образцах СР тех же больных. Проведенное исследование показало, что в целом для больных c опухолями, ассоциированными и не ассоциированными с ВЭБ (РНГ и ДОПР соответственно) характерны варианты LMP1, описанные в литературе, при этом их спектр в сравниваемых группах принципиально не отличался. Выявлено также, что у этих больных отсутствуют такие варианты LMP1, как China 2, часто обнаруживаемые у больных РНГ и здоровых лиц из южных провинций Китая и стран Юго-Восточной Азии, и вариант Alaskan, обнаруживаемый на Аляске [32, 35, 36]. Как и в эндемичных регионах, в России варианты LMP1, специфические для РНГ, выявлены не были.
Делетированные варианты LMP1 и характерные а.к. замены в опухолях больных РНГ и ДОПР. Показано, что туморо-генные и трансформирующие свойства LMP1 ассоциированы с делецией из 10 аминокислот [37], часто находящейся в составе перекрывающей ее 23-членной делеции (аминокислотные остатки 346—355 и 334—355 соответственно). Проведенные исследования показали (табл. 2), что в биоптатах опухолей больных РНГ образцы LMP1 с 10-членной делецией встречались в 14,3% (3/21) случаев, а с 23-членной — в 28,6% (6/21) случаев, в то время как у больных ДОПР эти показатели соответствовали 50% (7/14) и 7,1% (1/14) соответственно. Однако суммарные показатели содержания обоих делетированных вариантов LMP1 в опухолях сравниваемых групп были близки: 42,9% (9/21) для больных РНГ и 57,1% (8/14) для больных ДОПР, и различия
Таблица
^ектр вариантов LMP1 в образцах опухоли, крови и смывов ротоглотки больных РНГ и ДОПР, а также лимфоцитов периферической крови доноров
Тести- Группы больных Варианты LMP11
руемые образцы B95,8/A (%) China1 (%) Med + (%) Med- (%) NC (%) ВВ2 (%)
Опухоль РНГ, n = 21 6 (28,6%) 2 (9,5%) 7 (33,3%) 3 (14,3%) 1 (4,8%) 2 (9,5%)
ДОПР, n = 14 2 (14,3%) 5 (35,7%) 3 (21,4%) 2 (14,3%) 2 (14,3%) 0 (0%)
Кровь РНГ, n = 16 4 (25,0%) 0 (0,0%) 2 (12,5%) 7 (43,8%) 2 (12,5%) 1 (6,3%)
ДОПР, n = 13 2 (16,7%) 7 (58,3%) 1 (8,3%) 1 (8,3%) 1 (8,3%) 0 (0%)
Доноры крови, n = 19 15 (78,9%) 1 (5,3%) 0 (0,0%) 1 (5,3%) 2 (10,5%) 0 (0%)
Смывы из ротоглотки РНГ, n = 20 ДОПР, n = 9 6 (30,0%) 2 (22,2%) 0 (0,0%) 3 (33,3%) 6 (30,0%) 1 (11,1%) 4 (20,0%) 2 (22,2%) 3 (15,0%) 1 (11,1%) 1 (5,0%) 0 (0%)
Всего... 111 37 18 20 20 12 4
Примечание. Образцы ЬМРР, амплифицированные из биологического материала больных РНГ и ДОПР, а также доноров крови, были распределены по вариантам, согласно классификации [32, 34], основанной на географическом происхождении изолятов ВЭБ; ВВ2 — образцы ЬМР1, по набору специфических мутаций не соответствующие ни одному из описанных в литературе вариантов, внесены в группу «вне вариантов».
статистически недостоверны (p > 0,05). Хотя повышенное содержание делетированных вариантов LMP1 в образцах крови у больных ДОПР по сравнению с больными РНГ (61,5% (8/13) и 12,5% (2/16) соответственно) приближалось к статистически значимым значениям (p = 0,074), различие в содержание указанных вариантов LMP1 в смывах ротоглотки у этих больных (44,4% (4/9) и 30% (6/20) соответственно) оказалось статистически недостоверным (p > 0,05). Исходя из полученных данных, можно констатировать, что в исследуемом материале больных РНГ и ДОПР содержание делетированных вариантов LMP1 было приблизительно одинаковым, что позволяет предположить наличие генетического родства штаммов ВЭБ, персистирующих у этих больных.
Важно отметить, что в опухолевых образцах LMP1 обеих групп больных выявлены общие а.к. замены, локализующиеся между кодонами 309 и 366 LMP1: S309N, Q322E/N/D, E328Q/A, Q334/R, L338S/P, H352R/N и S366T/A, а также а.к. замены в функционально важных кодонах (не показано). Так, замена а.к. S ^ T в кодоне 366, характерная для больных РНГ в эндемичных регионах, также встречалась в 100% случаев, но только у больных ДОПР. У больных РНГ из России довольно часто наблюдали замену а.к. S ^ А: в образцах опухоли 40,9%, крови 26,7% и смывов ротоглотки 47,4%. Еще одна особенность российских образцов LMP1 состояла в полном отсутствие замены а.к. G ^ S в 212-м кодоне, столь характерной для различных ВЭБ-ассоциированных патологий, описанных в различных странах мира.
Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что возникновение РНГ в России не связано с распространением определенного штамма ВЭБ, несущего в своем геноме высокоонкогенные варианты LMP1 с делецией 30 п.н./10 а.к., (China 1 или Med +). Вирусные штаммы с указанными вариантами гена обнаружены в биологическом материале больных ДОПР и даже в образцах доноров крови. Это предположение согласуется с выводами других исследователей, которые показали, что высокая заболеваемость РНГ в южных провинциях Китая не связана с персистированием среди населения этих регионов штаммов ВЭБ, несущих высо
1 бранных вариантов ЬЫР1. Исследуемые варианты гена клонировали в эукариотический экспрессирующий - вектор pSG5 и затем выделяли препаративные количества плазмидных ДНК, которые использовали в дальнейших экспериментах. Таким образом, нами были получены варианты ЬМР1 из опухолевой ткани больных РНГ (М6, М28, М33, М37, М42), а также ДОПР (М19, М25, М32 и М36).
С целью получения клеточных линий, стабильно экспрессирующих изучаемые варианты ЬЫР1, нами проведено клонирование вариантов генов в ретровирусный вектор рВаЬе-риго по соответствующим сайтам. После наработки переклонированных в рВаЬе-риго изучаемых вариантов гена ЬМР1, а также его контрольных вариантов ЬМР1В958 (низкотуморогенного) и ЬЫР1Сао (высокотуморогенного), проводили трансфекцию ими клеточной линии РЫ-ЫХ-АтрЬз (РЬзетх-А, деривата клеток НЕК293). Полученными ретровирусными стоками далее мы трансдуцировали индикаторные клетки эмбриональных крысиных фибробластов ЯаЫ. Выбор этой клеточной линии в первую очередь был обусловлен чувствительностью этих клеток к трансформирующим свойствам ЬМР1 и их реактивностью к трансформирующему действию карбоксильного домена белка, а также результатами предыдущих исследований, выявивших их меньшую чувствительность к цитотоксическому действию молекулы ЬМР1.
Трансформирующую активность вариантов ЬМР1 ВЭБ, полученных от больных РНГ и ДОПР, изучали с помощью метода фазового контраста по способности клеточных линий, постоянно экспрессирующих исследуемые варианты гена, образовывать колонии. Как видно из табл. 3, клетки, содержащие контрольный пустой вектор рВаЬе, при длительном культивировании не образовывали колонии, в то время как в остальных линиях при экспрессии вариантов ЬМР1 В95.8, М6, М28, М33, М37, М42, М19, М25, М32 и М36 формировались колонии разного размера и морфологии. Клетки, экспрессирующие вариант ЬМР1Сао, образовывали достоверно большее число колоний по сравнению с остальными линиями. При этом обращает на себя внимание тот факт, что число вариантов гена, определяемое по совокупности ключевых а.к. замен, а также отсутствию или наличию делеции 10 а.к. в образцах ЬМР1 у больных обеих групп было практически одинаковым и не влияло на величину формируемых фокусов трансформации.
Трансформирующую способность тестируемых клеточных линий, постоянно экспрессирующих изучаемые варианты ЬМР1, дополнительно оценивали по характеристике их роста без подложки в жидком агаре. Исследования показали, что все анализируемые варианты ЬМР1 при культивировании в жидком агаре образовывали колонии различного размера и морфологии. При этом, так же как и в случае описанных выше экспериментов, клеточная линия, экспрессирующая высокотуморогенный
кодивергентный штамм LMP Cao с делецией 30 п.н./10 а.к. и обладающий наиболее выраженной трансформирующей активностью.
Трансформирующая активность вариантов LMP1 от больных РНГ и ДОПР. Для оценки различных характеристик вариантов LMP1, полученных от больных РНГ и ДОПР, на первом этапе исследований были получены ПЦР-продукты ото-
Таблица 2
Делеции аминокислот (10 а.к. и 23 а.к.) в изолятах LMP1 из образцов опухоли, крови и смывов ротоглотки больных РНГ и ДОПР
Опухоль Больные ДОПР (n = 14) Кровь Кровь Смыв из Смыв из
1МР1-изоляты больных РНГ (П = 21) больных РНГ (n = 16) больных ДОПР (n = 13) ротоглотки больных РНГ (n = 20) ротоглотки больных ДОПР (n = 9)
Делеция 10 а.к. Делеция 23 а.к.
3 (14,3%) 6 (28,6%)
7 (50,0%) 1 (7,1%)
1 (6,3%) 1 (6,3%)
8 (61,5%) 0 (0,0%)
I (5,0%) 5 (25,0%)
4 (44,4%) 0 (0,0%)
Сумма делеций 9 (42,9%) 8 (57,1%) 2 (12,5%) 8 (61,5%) 6 (30,0%) 4 (44,4%)
Таблица 3
Число фокусов трансформации, образуемое клеточными линиями, экспрессирующими варианты LMP1 от больных РНГ и ДОПР, а также контрольные варианты LMP1
Клеточные линии Число фокусов трансформации
Контрольные варианты
Rat-1-pBabe-puro 0
Rat-1-pBabe-B95-8 > 100
Rat-1-pBabe-Cao > 260
LMP1 из опухолевой ткани больных РНГ
Rat-1-pBabe-M6 (B95.8) > 90
Rat-1-pBabe-M28 (Med +) > 80
Rat-1-pBabe-M33 (Med +) > 120
Rat-1-pBabe-M37 (Med-) > 120
Rat-1-pBabe-M42 (Med +) > 110
LMP1 из опухолевой ткани больных ДОПР
Rat-1-pBabe-M19(B95.8) > 100
Rat-1-pBabe-M25(B95.8) > 100
Rat-1-pBabe-M32 (Med +) > 90
Rat-1-pBabe-M36 (Med-) > 100
вариант РМР1С!Ш образовывала намного большее число колоний, чем клеточные линии, экспрессирующие тестируемые варианты гена и РМР1В958 (табл. 4). Причем клеточные линии, экспрессирующие варианты 1МР1 от больных обеих групп, по способности формировать колонии в жидком агаре практически не отличались.
Известно, что при экспрессии 1МР1 в клетках-мишенях наблюдается индукция образования стрессактивированных фибрилл и формирование филлоподий. Для определения влияния на этот процесс минимального набора мутаций в 1МР1 мы проводили анализ движения клеток в «ране». На клеточный монослой наносили «рану» и движение клеток фиксировали через 24 и 48 ч. В случае экспрессии высокотуморогенного варианта Сао через 48 ч наблюдали практически полное зарастание раны, что объяс-
Таблица 4
Число колоний, образуемое клеточными линиями, экспрессирующими варианты LMP1 от больных РНГ и ДОПР, а также контрольные варианты LMP1
Клеточные линии Число колоний
Контрольные варианты
Rat-1-pBabe-puro 0
Rat-1-pBabe-B95-8 > 25
Rat-1-pBabe-Cao > 55
LMP1 из опухолевой ткани больных РНГ
Rat-1-pBabe-M6 (B95.8) > 45
Rat-1-pBabe-M28 (Med +) > 30
Rat-1-pBabe-M33 (Med +) > 40
Rat-1-pBabe-M37 (Med-) > 35
Rat-1-pBabe-M42 (Med +) > 30
LMP1 из опухолевой ткани больных ДОПР
Rat-1-pBabe-M19(B95.8) > 25
Rat-1-pBabe-M25(B95.8) > 30
Rat-1-pBabe-M32 (Med +) > 35
Rat-1-pBabe-M36 (Med-) > 30
няется отсутствием контактного торможения, характерного для нормальных клеток. Что касается изучаемых вариантов LMP1, то хотя между ними и наблюдалось незначительное отличие в скорости зарастания раны, все они, включая прототипный вариант В95.8, вызывали движение клеток с большей скоростью, нежели контрольные клетки, несущие пустой вектор рВаве-puro.
В настоящее время механизм ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза, ведущего к развитию РНГ, остается до конца не выясненным. Повсеместное распространение вируса и отличающаяся заболеваемость ВЭБ-ассоциированными новообразованиями в различных географических регионах заставляют искать причину возможности существования специфических штаммов ВЭБ, вносящих свой вклад в развитие определенных типов ВЭБ-ассоциированных злокачественных опухолей. В настоящем исследовании, проведенном в неэндемичном для РНГ географическом регионе (России), штамм ВЭБ с характерным для РНГ вариантом LMP1 обнаружен не был. Однако, согласно некоторым публикациям, несколько специфических вариантов ВЭБ (f-вариант, имеющий дополнительный сайт BamHI в Bam HIF фрагменте, F /V29A/SPM или V-val подтип EBNA1) были обнаружены для РНГ из эндемичных регионов, которые отсутствовали в других ВЭБ-ассоциированных патологиях [38]. Получение такого результата для неэндемичных регионов указывало бы на универсальность связи РНГ с указанными вариантами вируса вне зависимости от географического региона и позволило бы выяснить структурные и функциональные особенности онкогена LMP1 у этих штаммов вируса по сравнению с LMP1 онкогенами у штаммов ВЭБ, циркулирующих в здоровой популяции.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научно-исследовательских проектов № 13-04-00063а, 14-04-01810а, и № 15-34-70031мол_а_мос.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах:
Сенюта Наталья Борисовна — канд. мед. наук, вед. научн. сотр.,
Смирнова Ксения Валерьевна — канд. биол. наук, научн. сотр.
Дидук Сергей Васильевич — канд. биол. наук, научн. сотр.
Гончарова Елена Васильевна — канд. биол. наук, научн. сотр.
Щербак Лиана Нодаровна — канд. биол. наук, научн. сотр.
Гурцевич Владимир Эдуардович — док.мед.наук, проф,, зав. лаб. вирусного канцерогенеза
ЛИТЕРАТУРА
1. Young L.S., Rickinson A.B. Epstein-Barr virus: 40 years on. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4: 757—68.
2. Richardson A.K., Currie M.J., Robinson B.A., Morrin H., Phung Y., Pearson J.F. et al. Cytomegalovirus and epstein-barr virus in breast cancer. PLoS. One. 2015; 10: e0118989.
3. Koshiol J., GulleyM.L., Zhao Y., RubagottiM., MarincolaF.M., Ro-tunno M. et al. Epstein-Barr virus microRNAs and lung cancer. Br. J. Cancer. 2011; 105: 320—6.
4. Vockerodt M., Yap L.F., Shannon-Lowe C., Curley H., Wei W., Vrza-likova K. et al. The Epstein-Barr virus and the pathogenesis of lymphoma. J. Pathol. 2015; 235: 312—22.
5. KimuraH., Kawada J., Ito Y. Epstein-Barr virus-associated lymphoid malignancies: the expanding spectrum of hematopoietic neoplasms. Nagoya J. Med. Sci. 2013; 75: 169—79.
6. Ahn J.S., Rew S.Y., Shin M.G., Kim H.R., Yang D.H., Cho D. et al. Clinical significance of clonality and Epstein-Barr virus infection in adult patients with hemophagocytic lymphohistiocytosis. Am. J. He-matol. 2010; 85: 719—22.
7. TagliaviniE., Rossi G., ValliR., ZanelliM., Cadioli A., MengoliM.C. et al. Lymphomatoid granulomatosis: a practical review for pathologists dealing with this rare pulmonary lymphoproliferative process. Pathologica. 2013; 105: 111—6.
8. Amano M., Marutsuka K., Sugimoto T., Todaka T., Setoyama M. Ep-stein-Barr virus-associated primary central nervous system lympho-
ma in a patient with adult T-cell leukemia / Lymphoma. J. Dermatol. 2011; 38: 575—80.
9. Fields Virology / Eds. D.M. Knipe, P.M. Howley. Wolters Kluwer/ Lippincott Williams & Wilkins. 2013.
10. BredaE., Catarino R.J., Azevedo I., LobaoM., Monteiro E., Medeiros R. Epstein-Barr virus detection in nasopharyngeal carcinoma: implications in a low-risk area. Braz. J. Otorhinolaryngol. 2010; 76: 310—5.
11. Bornkamm G.W. Epstein-Barr virus and the pathogenesis of Burkitt's lymphoma: more questions than answers 38. Int. J. Cancer. 2009; 124: 1745—55.
12. Yu M.C., Yuan J.M. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Semin. Cancer Biol. 2002; 12: 421—9.
13. Lo K.W., To K.F., HuangD.P. Focus on nasopharyngeal carcinoma. Cancer Cell. 2004; 5: 423—8.
14. Chen S.J., Chen G.H., Chen Y.H., Liu C.Y., Chang K.P., Chang Y.S. et al. Characterization of Epstein-Barr virus miRNAome in nasopharyngeal carcinoma by deep sequencing. PLoS. One. 2010; 5 (9): pii: e12745.
15. Henle G., Henle W. Epstein-Barr virus-specific IgA serum antibodies as an outstanding feature of nasopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 1976; 17: 1—7.
16. Hou X., Zhao C., Guo Y., Han F., Lu L.X., Wu S.X. et al. Different clinical significance of pre- and post-treatment plasma epstein-barr virus DNA load in nasopharyngeal carcinoma treated with radiotherapy. Clin. Oncol. (R. Coll. Radiol.). 2010; 23 (2): 128—33.
17. Li H.P., Chang Y.S. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1: structure and functions. J. Biomed Sci. 2003; 10: 490—504.
18. Horikawa T., Yoshizaki T., Kondo S., Furukawa M., Kaizaki Y., Pagano J.S. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces snail and epithelial-mesenchymal transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma. Br. J. Cancer. 2011; 104: 1160—7.
19. Kondo S., Wakisaka N., Muramatsu M., Zen Y., Endo K., Murono S. et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces cancer stem/progenitor-like cells in nasopharyngeal epithelial cell lines. J. Virol. 2011; 85: 11255—64.
20. Zhu J.Y., Pfuhl T., Motsch N., Barth S., Nicholls J., Grasser F. et al. Identification of novel Epstein-Barr virus microRNA genes from nasopharyngeal carcinomas. J. Virol. 2009; 83: 3333—41.
21. Horikawa T., Sheen T.S., Takeshita H., Sato H., Furukawa M., Yoshizaki T. Induction of c-Met proto-oncogene by Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 and the correlation with cervical lymph node metastasis of nasopharyngeal carcinoma. Am. J. Pathol. 2001; 159: 27—33.
22. Kim K.R., Yoshizaki T., Miyamori H., Hasegawa K., Horikawa T., Furukawa M. et al. Transformation of Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 (LMP1) induces expression of Ets1 and invasive growth. Oncogene. 2000; 19: 1764—71.
23. Shair K.H., Schnegg C.I., Raab-Traub N. Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 effects on junctional plakoglobin and induction of a cadherin switch. Cancer Res. 2009; 69: 5734—42.
24. Kondo S., Yoshizaki T., Wakisaka N., Horikawa T., Murono S., Jang K.L. et al. MUC1 induced by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 causes dissociation of the cell-matrix interaction and cellular invasiveness via STAT signaling. J. Virol. 2007; 81: 1554—62.
25. Kondo S., Wakisaka N., Schell M.J., Horikawa T., Sheen T.S., Sato H. et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces the matrix metalloproteinase-1 promoter via an Ets binding site formed by a single nucleotide polymorphism: enhanced susceptibility to na-sopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 2005; 115: 368—76.
26. Liu L.T., Peng J.P., Chang H.C., Hung W.C. RECK is a target of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. Oncogene. 2003; 22: 8263—70.
27. Murono S., Yoshizaki T., SatoH., TakeshitaH., FurukawaM., Pagano J.S. Aspirin inhibits tumor cell invasiveness induced by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 through suppression of matrix met-alloproteinase-9 expression. Cancer Res. 2000; 60: 2555—61.
28. Yoshizaki T., Sato H., Furukawa M., Pagano J.S. The expression of matrix metalloproteinase 9 is enhanced by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95: 3621—6.
29. Chew M.M., Gan S.Y., Khoo A.S., Tan E.L. Interleukins, laminin and Epstein — Barr virus latent membrane protein 1 (EBV LMP1) promote metastatic phenotype in nasopharyngeal carcinoma. BMC Cancer. 2010; 10: 574—@.
30. Gurtsevitch V.E., YakovlevaL.S., ShcherbakL.N., GoncharovaE.V., Smirnova K.V., Diduk S.V. et al. The LMP1 oncogene sequence variations in patients with oral tumours associated or not associated with the Epstein Barr. Mol. biologiya. 2013; 47: 987—95. (in Rissian)
31. Diduk S.V., Smirnova K.V., Gurtsevich V.E. The influence of point mutations in the Epstein-Barr virus LMP1 oncogene on the cell cy-toskeleton and activation of inducible form of NO synthase. Vestn. RAMN. 2012; 62—7. (in Russian)
32. Edwards R.H., Seillier-Moiseiwitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acid changes in latent membrane protein 1 distinguish Ep-stein-Barr virus strains. Virology. 1999; 261: 79—95.
33. Sandvej K., Gratama J.W., Munch M., Zhou X.G., Bolhuis R.L., An-dresen B.S. et al. Sequence analysis of the Epstein-Barr virus (EBV) latent membrane protein-1 gene and promoter region: identification of four variants among wild-type EBV isolates. Blood. 1997; 90: 323—30.
34. Walling D.M., Shebib N., Weaver S.C., Nichols C.M., Flaitz C.M., Webster-Cyriaque J. The molecular epidemiology and evolution of Epstein-Barr virus: sequence variation and genetic recombination in the latent membrane protein-1 gene. J. Infect. Dis. 1999; 179: 763— 74.
35. Miller W.E., Edwards R.H., Walling D.M., Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. J. Gen. Virol. 1994; 75 (Pt. 10): 2729—40.
36. Chang C.M., YuK.J., MbulaiteyeS.M., HildesheimA., BhatiaK. The extent of genetic diversity of Epstein-Barr virus and its geographic and disease patterns: a need for reappraisal. Virus Res. 2009; 143: 209—21.
37. Li S.N., Chang Y.S., Liu S.T. Effect of a 10-amino acid deletion on the oncogenic activity of latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus. Oncogene. 1996; 12: 2129—35.
38. Liu Q., Han A., You S., Yang Q., Liang Y., Dong Y. The association of genomic variation of Epstein-Barr virus BamHI F fragment with the proliferation of nasopharyngeal carcinoma. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 2010; 118: 657—64.
Поступила 13.03.15
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF THE LMP1 ONCOGENE IN PATIENTS WITH TUMORS АSSOCIATED AND NOT ASSOCIATED WITH THE EPSTEIN-BARR VIRUS
N. B. Senyuta, K. V. Smirnova, S. V. Diduk, E. V. Goncharova, L. N. Shcherbak, V. E. Gurtsevitch
Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, Russia
Epstein-Barr virus (EBV) - the etiological agent of a number of human benign and malignant tumors including infectious mononucleosis (IM), Burkitt lymphoma (BL), Hodgkin (HL) and non-Hodgkin (NLH) lymphomas, nasopharyngeal carcinoma (NPC), and many other tumors. Latent membrane protein 1 (LMP1) encoded by the gene of the same name (LMP1) is the main oncoprotein of EBV. LMP1 is a transmembrane protein capable of activating many signaling pathways and transcription factors of the cells, which leads to its transformation. Molecular analysis of LMP1 of various clinical origins identified many variants with different types of amino acid mutations that influence its biological activity. Since the role of LMP1 in the development of NPC is still not fully understood, it is important to find out how LMP1 samples from patients with EBV-associated form of NPC differ from those of patients with other tumors also located in the oral cavity (OTOC), but not associated with this virus. Unlike most investigations conducted in endemic regions, the present work is intended to compare the genetic structure and the transforming activity of LMP1 variants from NPC and OTOC patients has been carried out in a non-endemic region of Russia, where NPC is rarely diagnosed. The obtained data show structural and functional similarities of LMP1 variants in the two groups of patients and, accordingly, a genetic relationship of EBV strains persisting in these patients. Our work suggests that in non-endemic regions any EBV strain with any structure of LMP1 may become the etiologic agent of NPC. However, based on modern concepts, the cancer can occur only if EBV-infected persons have a unique pattern of HLA associated with a high sensitivity to the development of NPC combined with exposure to harmful environmental factors (chemical or physical carcinogens) and lifestyle.
Keywords: Epstein-Barr virus (EBV), nasopharyngeal carcinoma (NPC), other tumors of the oral cavity (OTOC), latent membrane protein 1 (LMP1), polymorphism, transforming activity of LMP1
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-71-75
Funding. This work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (№ 13-04-00063а, 14-04-01810а, № 15-34-70031мол_а_мос).
Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
