Научная статья на тему 'Вирус Эпштейна-Барр у больных раком носоглотки: варианты гена lmp1, гуморальный ответ и клинические проявления болезни'

Вирус Эпштейна-Барр у больных раком носоглотки: варианты гена lmp1, гуморальный ответ и клинические проявления болезни Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

CC BY
330
52
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВИРУС ЭПШТЕЙНА-БАРР / РАК НОСОГЛОТКИ / ЛАТЕНТНЫЙ МЕМБРАННЫЙ БЕЛОК 1 (LMP1) / СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА / ПОЛИМОРФИЗМ LMP1 / LATENT MEMBRANE PROTEIN 1 (LMP1) / EPSTEIN-BARR VIRUS / NASOPHARYNGEAL CARCINOMA / GENE SEQUENCING / LMP1 POLYMORPHISM

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Яковлева Лариса Сергеевна, Сенюта Наталья Борисовна, Степина Вера Николаевна, Гончарова Елена Васильевна, Щербак Лиана Нодаровна

Целью работы стало изучение полиморфизма (дивергентности) онкогена LMP1 вируса ЭпштейнаБарр у больных раком носоглотки и лиц контрольных групп (пациенты с другими опухолями полости рта, больные инфекционным мононуклеозом и доноры крови). В частности, представлялось важным выяснить, влияют ли варианты онкогена LMP1, обладающие различной степенью полиморфизма (дивергентности), на клинические проявления болезни и гуморальный ответ к антигенам вируса Эпштейна-Барр. Объектом исследования служили опухолевая ткань, кровь или смывы из полости рта больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта, а также образцы крови больных инфекционным мононуклеозом и доноров крови. Полученные с помощью полимеразной цепной реакции образцы С-концевой области гена LMP1 (25 от больных раком носоглотки, 14 от пациентов с другими опухолями полости рта, 10 от больных инфекционным мононуклеозом и 15 от доноров крови), были подвергнуты сиквенсному анализу. Плазма крови всех изучаемых лиц была протестирована на наличие антител классов IgG и IgA к капсидному и раннему антигенам вируса. Исследования показали, что у больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта (патологиями, ассоциированными и не ассоциированными с вирусом ЭпштейнаБарр соответственно) одинаково часто встречались высоко дивергентные варианты онкогена LMP1. У больных инфекционным мононуклеозом и доноров крови высоко дивергентные варианты (за исключением у одного донора крови) отсутствовали. У больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта наличие вариантов LMP1 с Сао-делецией, характеризующихся наиболее высокой туморогенной активностью по сравнению с другими вариантами LMP1, не коррелировало ни с более тяжелым проявлением болезни, ни с повышенными титрами вирус-специфических антител. Эти данные указывают на то, что высоко туморогенные варианты LMP1 не влияют на течение опухолевого процесса. Впервые обнаружена повышенная заболеваемость раком носоглотки у представителей коренного населения Кавказа по сравнению с таковой у жителей центральной части России.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Яковлева Лариса Сергеевна, Сенюта Наталья Борисовна, Степина Вера Николаевна, Гончарова Елена Васильевна, Щербак Лиана Нодаровна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

EPSTEIN-BARR VIRUS IN PATIENTS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA: LMP1 VARIANTS, ANTIBODY RESPONSE AND CLINICAL MANIFESTATIONS

The purpose of this study was to analyze polymorphism (divergence) of Epstein-Barr virus LMP1 oncogene in patients with nasopharyngeal carcinoma and control patients with other oral tumors, infectious mononucleosis or blood donors. In particular it was important to clarify whether LMP1 variants with various degrees of polymorphism (divergence) may influence clinical manifestations of disease and antibody response to Epstein-Barr virus antigens. We analyzed tumor tissue, blood or oral swab samples in nasopharyngeal cancer patients and those with other oral tumors, infectious mononucleosis and healthy blood donors. Samples of the LMP1 C-terminal regions obtained by PCR (25 from nasopharyngeal cancer patients, 14 from patients with different oral tumors, 10 from patients with infectious mononucleosis and 15 from blood donors) were subjected to sequence analysis. Blood plasma from all individuals investigated was tested for IgG and IgA antibodies to capsid and early virus antigens. It was fond for the first time that LMP1 highly divergent variants were seen at an equal rate in patients with nasopharyngeal carcinoma and other oral tumors, i. e. tumors associated and not associated with Epstein-Barr virus, respectively. None of the patients with infectious mononucleosis or blood donors (except one) had highly divergent variants. In patients with nasopharyngeal carcinoma or other oral tumors the presence of LMP1 variants with Cao deletion (demonstrating higher tumorigenic activity as compared with other LMP1 variants) showed no correlation with either more advanced disease or elevated virus-specific antibody titers. These findings suggest that highly tumorigenic LMP1 variants have no effect on neoplastic disease course. We were also the first to demonstrate that nasopharyngeal carcinoma incidence was higher in natives of the Caucasus as compared with inhabitants of Central Russia.

Текст научной работы на тему «Вирус Эпштейна-Барр у больных раком носоглотки: варианты гена lmp1, гуморальный ответ и клинические проявления болезни»

Лариса Сергеевна Яковлева1, Наталья Борисовна Сенюта2,

Вера Николаевна Степина3, Елена Васильевна Гончарова4,

Лиана Нодаровна Щербак5, Самир Махаббат-оглы Джаббаров6, Владимир Эдуардович Гурцевич7

ВИРУС ЭПШТЕЙНА—БАРР У БОЛЬНЫХ РАКОМ НОСОГЛОТКИ: ВАРИАНТЫ ГЕНА LMP1, ГУМОРАЛЬНЫЙ ОТВЕТ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ БОЛЕЗНИ

1 Д. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

2 К. м. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

3 Д. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза

ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

4 К. м. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

5 К. б. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

6 Аспирант, отделение опухолей дыхательно-пищеварительных путей, НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

7 Д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза, ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, Гурцевич Владимир Эдуардович;

e-mail: vladgurtsevitch@yahoo.com

Целью работы стало изучение полиморфизма (дивергентности) онкогена LMP1 вируса Эпштейна— Барр у больных раком носоглотки и лиц контрольных групп (пациенты с другими опухолями полости рта, больные инфекционным мононуклеозом и доноры крови). В частности, представлялось важным выяснить, влияют ли варианты онкогена LMP1, обладающие различной степенью полиморфизма (дивергентности), на клинические проявления болезни и гуморальный ответ к антигенам вируса Эпштейна—Барр. Объектом исследования служили опухолевая ткань, кровь или смывы из полости рта больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта, а также образцы крови больных инфекционным мононуклеозом и доноров крови. Полученные с помощью полимеразной цепной реакции образцы С-концевой области гена LMP1 (25 — от больных раком носоглотки, 14 — от пациентов с другими опухолями полости рта, 10 — от больных инфекционным мононуклеозом и 15 — от доноров крови), были подвергнуты сиквенсному анализу. Плазма крови всех изучаемых лиц была протестирована на наличие антител классов IgG и 1дА к капсидному и раннему антигенам вируса. Исследования показали, что у больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта (патологиями, ассоциированными и не ассоциированными с вирусом Эпштейна— Барр соответственно) одинаково часто встречались высоко дивергентные варианты онкогена LMP1. У больных инфекционным мононуклеозом и доноров крови высоко дивергентные варианты (за исключением у одного донора крови) отсутствовали. У больных раком носоглотки и пациентов с другими опухолями полости рта наличие вариантов LMP1 с Сао-делецией, характеризующихся наиболее высокой туморогенной активностью по сравнению с другими вариантами LMP1, не коррелировало ни с более тяжелым проявлением болезни, ни с повышенными титрами вирус-специфических антител. Эти данные указывают на то, что высоко туморогенные варианты LMP1 не влияют на течение опухолевого процесса. Впервые обнаружена повышенная заболеваемость раком носоглотки у представителей коренного населения Кавказа по сравнению с таковой у жителей центральной части России.

Ключевые слова: Вирус Эпштейна—Барр, рак носоглотки, латентный мембранный белок 1 (ЬМР1), секвенирование гена, полиморфизм LMP1.

Как известно, вирусом Эпштейна—Барр (ВЭБ), или лимфотропным вирусом герпеса человека 4-го типа, инфицировано более 90% населения земного шара. Являясь убиквитарным, этот вирус в то же время признан этиологическим фактором широкого спектра доброкачественных и злокачественных заболеваний. К их числу относят инфекционный мононуклеоз (ИМ), лимфому Беркитта (ЛБ), рак носоглотки (РНГ), лимфо-му Ходжкина (ЛХ), неходжкинские лимфомы (НХЛ) и ряд других [1]. Онкогенные потенции ВЭБ связаны с его способностью трансформировать клетки, что обусловлено функционированием 9 генов латентной инфекции вируса, кодирующих соответствующие белки [2]. Один из таких белков — латентный мембранный белок 1-го типа (LMP1), кодируемый одноименным геном (LMP1), играет чрезвычайно важную роль в патогенезе ассоциированных ВЭБ заболеваний, поскольку обладает свойствами онкобелка. LMP1 способен трансформировать В-лимфоциты и фибробласты грызунов (Rat-1) in vitro [3; 2], а его введение бестимусным мышам приводит к возникновению у них опухолей [4; 5]. Присутствие LMP1 необходимо и достаточно для осуществления трансформации В-клеток человека [6]. Он активирует многие сигнальные пути, включая фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K)-Akt, NF-kB и др. [7; 8]. Показано, что отдельные мутации гена LMP1 влияют на его биологические свойства, что, вероятно, играет важную роль в этиопатоге-незе вызываемых им заболеваний. Наиболее критичны мутации C-терминального цитоплазматического домена, которые влияют на иммуногенность и время полужизни LMP1 и усиливают его трансформирующий потенциал.

Молекулярный анализ образцов гена LMP1, выделенных в различных географических регионах, позволил выявить его полиморфизм, часто отражающий неодинаковую биологическую активность гена. Например, вариант гена LMP1, «Сао», содержащий делецию 30 пар нуклеотидов (п. н.) в С-концевой области и кодирующий соответствующий делецированный вариант белка 1МР1Сао, обладает существенно более выраженным трансформирующим потенциалом in vitro [9]. Он оказался и более туморогенным для мышей с выраженным комбинированным иммунодефицитом (SCID) [10].

На основе сиквенсного анализа upstream и downstream участков С-концевой области гена LMP1 D. M. Walling и соавт. выделили 22 сиквенсных варианта/генотипа гена, которые затем были разделены на 4 группы: 1МР1В95.8/А, LMP^95.8/B, LMPm95.8/C и LMP^95.8/D [11]. R. H. Edwards и соавт. из лаборатории N. Raab-Traub описали 6 вариантов гена, обозначение которых: China 1, China 2, Mediterranean + (Med + ), Mediterranean — (Med—), North Carolina (NC) и

Alaskan — отражает их географическое происхождение [12]. Каждый из этих вариантов характеризуется свойственным ему сочетанием аминокислотных (а. к.) замен, делеций, вставок и т. д., т. е. определенным полиморфизмом, по сравнению с LMP^95.8, который используется в качестве стандартного (прототипного) варианта.

© Яковлева Л. С., Сенюта Н. Б., Степина В. Н., Гончарова Е. В., Щербак Л. Н., Джаббаров С. М., Гурцевич В. Э., 2012 УДК 616.327.2-006.6:578.825.13:578.264

При этом варианты с незначительным полиморфизмом (3—4 а. к. замены) по отношению к LMP1В95.8 (например, LMP1В95.8/А) относят к низко дивергентным, а высоко полиморфные, т. е. варианты с большим числом а. к. замен, делеций, вставок — к высоко дивергентным. К числу последних следует причислить указанные выше 6 вариантов гена LMP1 по классификации R. H. Edwards и соавт. [12]. Важно отметить, что выявляемые структурные изменения в гене LMP1 часто располагаются в местах, влияющих на его транскрипцию, трансляцию или даже функцию.

Молекулярный механизм ассоциированного с ВЭБ канцерогенеза стал также предметом углубленного изучения. Было показано, что LMP1, являясь основным онкогеном ВЭБ, вносит весомый вклад в высокий метастатический потенциал РНГ [13; 14]. В частности, было показано, что LMP1 в опухолевых клетках РНГ стимулирует экспрессию Snail и эпителиально-мезенхимальный переход в метастатических вариантах рака. Более того, обнаружено, что экспрессия Snail позитивно коррелирует с процессом метастазирования, но демонстрирует независимую обратную корреляцию с экспрессией E-кадхерина [15]. Полученные в последние годы данные позволили предположить у больных РНГ существование раковых эмбриональных клеток (CSC) и предшественников раковых клеток (CPC), хотя четкие параметры обоих типов клеток пока отсутствуют. Поиски S. Kondo и соавт. [16] внесли некоторую ясность в этот вопрос. В своих экспериментах они показали, что ген LMP1 в эпителиальных клетках может индуцировать скорее CPC-, чем CSC-подобный фенотип, и предположили, что индуцированные LMP1 фенотипические изменения вносят вклад в развитие РНГ.

С учетом тесной связи ряда новообразований человека с ВЭБ, предполагающей этиологическую роль вируса в их развитии, было проведено немало исследований, изучающих возможность использования вирусных маркеров в качестве диагностических и прогностических при этих заболеваниях. Иммунологические исследования РНГ в эндемичных для этого заболевания регионах показали, что высокие титры антител к антигенам ВЭБ часто могли быть обнаружены задолго до обнаружения опухоли, т. е. имеют высокую диагностическую ценность. Они также отражают клинические проявления болезни, такие, как ремиссия и рецидив, и, таким образом, могут быть использованы в качестве дополнительного метода наблюдения за больными [17—19]. Данные об ассоциации РНГ с ВЭБ в неэндемичных регионах, представленные лишь в единичных публикациях [20; 21], также подтверждают высокую значимость вирусных маркеров для диагностики и оценки клинического статуса больных РНГ [22].

Данная работа продолжает изучение особенностей ассоциированного с ВЭБ канцерогенеза у больных РНГ в неэндемичном регионе России и направлена на поиски корреляции между степенью дивергентности LMP-1 у этих больных, с одной стороны, гуморальным ответом к ВЭБ и клиническими проявлениями болезни, с другой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили образцы опухолевой ткани, крови или смывов из ротоглотки больных (РНГ)

и пациентов с другими опухолями полости рта (ДОПР), а также лимфоциты периферической крови больных ИМ и доноров крови (ДК). Больные РНГ и пациенты с ДОПР вошли в исследование в результате случайной выборки. Средний возраст больных в обеих группах составил 50,1 и 54,1 года соответственно. В группе больных РНГ и пациентов с ДОПР большинство составляли мужчины — 62,5 и 85,7% соответственно. Больные обеих групп по этнической принадлежности были подразделены на жителей Кавказа и жителей Центральной России. Из собранного биологического материала экстрагировали ДНК, которую использовали для амплификации (с помощью прямой полимеразной цепной реакции) С-концевой области гена LMP1 ВЭБ. На следующем этапе полученные образцы гена больных и здоровых лиц были подвергнуты сиквенсному анализу: 24 образца — от больных РНГ, а в качестве контроля 14 образцов — от пациентов с ДОПР, 10 — от больных ИМ и 15 — от ДК. Секвенирование LMP1 проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Обработку данных секвенирования проводили с помощью программ Chromas (DNA for Windows) и Vector NTI. Классификацию полученных образцов LMP1 осуществляли согласно критериям, предложенным R. H. Edwards и соавт. [12], К. Sandvej и соавт. и D. M. Walling и соавт. [11]. Кроме того, в каждом образце плазмы крови больных и здоровых лиц определяли антитела классов IgG и IgA к капсидному (ВКА) и раннему (РА) антигенам ВЭБ. Титры вирус-специфических антител определяли с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (ИФ), условия постановки которой и учет получаемых результатов подробно описаны ранее [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты сравнения последовательностей С-кон-цевой области вариантов LMP1 у больных РНГ, ИМ, пациентов с ДОПР и ДК представлены в табл. 1. Видно, что образцы LMP1, соответствующие прототипному варианту ЬМР1В95.8 либо низко дивергентному варианту ЬМР1В95.8А (оба с невысоким трансформирующим потенциалом), значительно чаще встречаются в группах ДК (у 12 из 15; 80%) и у больных ИМ (у 5 из 10; 50%) — при доброкачественных заболеваниях, завершающихся, как

правило, самовыздоровлением. У больных РНГ и пациентов с ДОПР низко дивергентные варианты обнаружены в 16,7% (у 4 из 24) и 14,2% (у 2 из 14) случаев соответственно. Для них более характерными оказались высоко дивергентные варианты LMP1, т. е. China1, Med + , Med— и NC. Эти варианты в совокупности составили для больных РНГ 83,3% (у 20 из 24) и для пациентов с ДОПР — 85,7% (у 12 из 14). Наличие высоко дивергентных вариантов LMP1 у больных РНГ и пациентов с ДОПР по сравнению с вариантами LMP1 у больных с доброкачественным лимфопролиферативным заболеванием (ИМ) и ДК нами отмечено впервые.

Среди высоко дивергентных вариантов LMP1 особый интерес представляют варианты с так называемой Сао-делецией (10 а. к.), т. е. варианты China1 и Med + , характеризующиеся особенно высокой туморогенной активностью. У 10 больных ИМ ни один из этих вариантов обнаружен не был, и лишь один (China1) из 15 (6,7%) выявлен у ДК. У больных РНГ и пациентов с ДОПР Cao-варианты выявлены в 54,2% (у 13 из 24) и 50% (у 7 из 14) случаев соответственно. Эти данные еще раз подтвердили, что у онкологических больных, т. е. больных РНГ и пациентов с ДОПР, доминируют варианты LMP1 с высокой туморогенной активностью, которые практически отсутствуют у больных с доброкачественными новообразованиями (ИМ) и у здоровых лиц (ДК).

Примерно одинаковая частота обнаружения высоко дивергентных вариантов LMP1 у больных РНГ, этиологическая роль ВЭБ для которого доказана, и пациентов с ДОПР, этиологически не связанных с ВЭБ, позволяет задать целый ряд вопросов, на которые пока нет ответов. Можно, однако, предположить, что в активно размножающихся клетках любой злокачественной опухоли геном вируса подвергается существенным изменениям: происходят накопление мутаций и формирование высоко туморогенных генотипов LMP1. При этом одни и те же варианты вируса в одних случаях (генетическая предрасположенность, действие канцерогенов и иных факторов) становятся этиологическими факторами РНГ, а в других (у пациентов с ДОПР) в отсутствие предрасполагающих факторов остаются вирусами-«пассажирами».

Чтобы выяснить, существует ли корреляция между типом мутаций в LMP1 и клиническими проявлениями болезни, а также гуморальным ответом к антигенам ВЭБ,

Таблица 1

Генотипы ЬМР1 ВЭБ у больных РНГ и лиц контрольных групп

Группы больных и здоровыхлиц Число изученных образцов LMP1 Варианты LMP1, абс. число (%)

В95.8+В95.8/А Chinai China2 Med + Med- NC

РНГ 24 4 (16,7) 3 (12,5) - 10 (41,7) 5(20,8) 2 (8,3)

ДОПР 14 2 (14,2) 6 (42,9) - 1 (7,3) 2 (14,2) 3(21,4)

ИМ 10 5 (5) - - - 2 (2) 1 (1)

ДК 15 12 (80) 1 (6,7) - - - 2 (13,3)

Таблица 2

Варианты ЬМР1, этническая принадлежность и титры антител к ВЭБ у больных РНГ

№ п/п Код больного Пол Возраст, годы Этническая принадлежность6 Варианты ЬМР1 Титры антител к ВЭБв

1дО 1дА

ВКА РА ВКА РА

Больные РНГ, имеющие Сао-делецию в образцах LMP1

1 1_д 116.1 Ж 40 Житель Центра России СЫпа1 640 320 80 -

2 1_д 117.1 М 46 Житель Кавказа Мес1 + 640 160 80 -

3 5.3 М 54 Житель Центра России Мес1+ 640 80 160 -

4 7.1 М 68 Житель Кавказа МеС + 1280 320 160 80

5 8.1 М 34 Житель Кавказа СЫпа1 640 160 20 20

6 16.1 М 52 Житель Кавказа СЫпа1 1280 320 160 160

7 27.1 Ж 68 Житель Кавказа Мес1 + 640 80 40 40

8 29.1 М 47 Житель Кавказа Мес1 + 1280 80 160 80

9 33.1 М 59 Житель Кавказа Мес1 + 1280 640 320 320

10 42.1 М 58 Житель Кавказа Мес1 + 2560 1280 640 320

11 49.2 Ж 50 Житель Центра России Мес1 + 1280 320 320 160

12 28.1 М 67 Житель Кавказа Мес1 + 1280 320 160 80

13 39.2 Ж 30 Житель Центра России Мес1 + 80 10-г 10- 10-

Средние геометрические значения титров антител 835,5 157,3 92,3 63,5

Больные РНГ, не имеющие в образцах LMP1 Сао-делецию

14 1_д115.1 Ж 49 Житель Центра России В95.8/А 1280 320 320 -

15 1_д127.2 Ж 54 Житель Центра России В95.8/А 320 40 80 -

16 11.2 М 68 Житель Центра России МесІ- 1280 320 160 160

17 16.3 М 52 Житель Кавказа В95.8/А 1280 320 160 160

18 37.1 Ж 51 Житель Центра России МесІ- 1280 640 40 160

19 12.2 Ж 46 Житель Кавказа МесІ- 1280 320 320 160

20 47.2 М 50 Житель Центра России В95.8/А 1280 320 320 320

21 42.2 М 35 Житель Кавказа МесІ- 2560 1280 640 320

22 39.1 Ж 30 Житель Центра России МесІ- 80 10- 10- 10-

23 51.2 М 52 Житель Центра России ЫС 80 10 10 10-

24 20.2 М 42 Житель Центра России ЫС 640 320 160 160

Средние геометрические значения титров антител 681,6 138,2 88,9 60,4

а В графе «Код больного» после указанного кода цифрами 1, 2 и 3 обозначены источники исследуемого материала: 1 — опухоль; 2 — кровь; 3 — клетки смыва из полости рта.

б Этническую принадлежность узнавали со слов больного.

в Титры антител к ВЭБ — последние разведения сыворотки/плазмы, в которых методом непрямой иммунофлюоресценции обнаружены антитела к соответствующему антигену вируса.

г В 10-кратном разведении сыворотки/плазмы вирус-специфические антитела не обнаружены.

Таблица 3

Варианты ЬМР1, этническая принадлежность и титры антител к ВЭБ у больных ДОПРа

№ п/п Код больного Пол Возраст, годы Этническая принадлежность6 Варианты І.МР1 Титры антител к ВЭБв

1дО |дА

ВКА РА ВКА РА

Больные ДОПР, имеющие в образцах LMP1 Сао-делецию

1 1.1 М 53 Житель Центра России МесІ + 80 10-г 10- -

2 18.2 М 57 Житель Центра России СЫпа1 160 10- 10- 10-

3 53.2 М 54 Житель Центра России СЫпа1 40 10- 10- 10-

4 55.1 М 48 Житель Центра России СЫпа1 20 10- 10- 10-

5 56.1 Ж 63 Житель Центра России СЫпа1 80 10- 10- 10-

6 57.2 М 53 Житель Центра России СЫпа1 80 10- 10- 10-

7 58.2 М 52 Житель Центра России СЫпа1 10- 10- 10- 10-

Средние геометрические значения титров антител 35,1 - - -

Больные ДОПР, не имеющие в образцах LMP1 Сао-делецию

8 25.1 М 52 Житель Центра России В95.8/А 10- 10- 10- 10-

9 35.2 М 61 Житель Кавказа МесІ- 80 40 10- 10-

10 58.1 М 60 Житель Центра России ЫС 10- 10- 10- 10-

11 36.2 М 47 Житель Центра России МесІ- 40 10- 10- 10-

12 52.1 М 50 Житель Кавказа ЫС 80 20 10- 10-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

13 10.1 Ж 55 Житель Центра России ЫС 160 10- 10- 10-

14 19.2 М 53 Житель Центра России В95.8/А 80 10- 10- 10-

Средние геометрические значения титров антител 22,9 2,6 - -

а В графе «Код больного» после указанного кода цифрами 1, 2 и 3 обозначены источники исследуемого материала: 1 — опухоль; 2 — кровь; 3 — клетки смыва из полости рта.

б Этническую принадлежность узнавали со слов больного.

в Титры антител к ВЭБ — последние разведения сыворотки/плазмы, в которых методом непрямой иммунофлюоресценции обнаружены антитела к соответствующим антигенам вируса.

г В 10-кратном разведении сыворотки/плазмы вирус-специфические антитела не обнаружены.

каждую из групп больных РНГ и ДОПР мы разбили на 2 подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия в тестируемом материале вариантов LMP1 с Сао-мутацией (табл. 2, 3). Последняя, как известно, обеспечивает вирусу выраженный онкогенный потенциал.

Результаты исследования показали, что у больных РНГ с вариантами ЬМР1Сао+ (СЫпа1 или Med + ) клинические проявления болезни не были более тяжелыми,

чем в группе больных, у которых Сао-делеция в LMP1 отсутствовала: в обеих группах доминировали больные с 3—4-й стадиями болезни и со сходными показателями TNM (данные не представлены). Эти наблюдения, скорее всего, свидетельствуют о том, что развитие данной ВЭБ-ассоциированной опухоли (РНГ) не зависит от типа и степени дивергентности вариантов LMP1, персистиру-ющих в организме больного. По-видимому, клиническая

характеристика болезни определяется комплексом других, не связанных с вирусом факторов.

Иммунофлуоресцентное изучение сывороток крови для выявления вирус-специфических антител показало, что средние геометрические значения (СГЗ) титров антител классов IgG к ВКА и РА у больных РНГ были в десятки раз выше, чем у пациентов с ДОПР (р < 0,001); это подтверждает вирусную природу РНГ. Антитела класса IgA к ВКА и РА, наличие которых особенно характерно для больных РНГ, у пациентов с ДОПР полностью отсутствовали. В группе больных РНГ с LMP1Cao+ СГЗ титров антител, хотя и были незначительно выше, чем у больных РНГ с LMPlCao — , различия эти были статистически незначимыми (см. табл. 2).

У пациентов с ДОПР наличие или отсутствие Сао-делеции в амплифицированных образцах LMP1 также не отражалось ни на клинических проявлениях болезни, ни на титрах антител к антигенам вируса (см. табл. 3). Значения последних в обеих группах пациентов с ДОПР были чрезвычайно низкими, что характерно для заболеваний, не ассоциированных с ВЭБ.

Как уже было упомянуто ранее, для вариантов LMP1 характерен высокий уровень полиморфизма (дивер-гентности). При этом, по данным большинства авторов, определенный генетический вариант LMP1 не связан с конкретным типом ВЭБ-ассоциированной патологии, но достаточно прочно сцеплен с географическим регионом и/или этнической принадлежностью популяции [24]. В наших исследованиях мы впервые обнаружили, что РНГ с высоко туморогенными вариантами LMP1Cao + (Chinal и Med + ) чаще встречаются у представителей народов Кавказа — 69,2% (у 9 из 13; см. табл. 2). Те же высоко туморогенные варианты LMP1Cao+ у представителей центральной части России выявляются исключительно в группе пациентов с ДОПР — 100% (у 7 из 7; см. табл. 3).

Следует отметить, что в группах больных РНГ и пациентов с ДОПР варианты LMP1, не обладающие Сао-мутацией (В95.5, В95.8/А, Med—, NC), доминировали среди россиян из центральной части страны (72,7 и 71,4% соответственно). Полученные данные, по-видимому, свидетельствуют о генетической предрасположенности народов Кавказа к заболеванию РНГ, особенно ассоциированных с Сао-делецированными вариантами LMP1 ВЭБ. Нельзя исключить, однако, что повышенная заболеваемость РНГ у этих народов может быть также обусловлена воздействием определенных факторов окружающей среды, местными вредными привычками и т. д. Высказанные предположения следует подтвердить данными эпидемиологического наблюдения и более высокой репрезентативностью клинического материала в вирусологических и молекулярно-биологических исследованиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В наших исследованиях, проведенных в одном из неэндемичных по РНГ регионов мира — России, впервые показано, что в биологическом материале, полученном у больных со злокачественными новообразованиями полости рта (РНГ или ДОПР), выявлены высоко дивергентные варианты LMP1 ВЭБ. Чем обусловлено наличие этих вариантов LMP1 у больных ДОПР — патологий, в отличие

от РНГ, не ассоциированных с ВЭБ, остается неясным и является предметом дальнейшего изучения.

Кроме того, впервые показано, что наличие у больных РНГ и пациентов с ДОПР вариантов LMP1Сао + , обладающих повышенной туморогенностью, не коррелирует с более тяжелыми клиническими проявлениями болезни по сравнению с таковыми в группе больных, у которых Сао-делеция в LMP1 не обнаружена. Наличие у больных LMP1Сао+ не сопровождалось и повышенными титрами вирус-специфических антител, что в целом свидетельствует об отсутствии влияния LMP1 на опухолевый процесс.

Заслуживает внимания повышенная заболеваемость РНГ у представителей народов Кавказа, несмотря на одинаковую степень распространенности среди них и жителей центральной части России высоко дивергентных вариантов LMP1, в том числе с Сао-делецией.

Работа поддержана грантом. РФФИ (проект № 10-04-00060а).

Авторы выражают, благодарность А. В. Лихтенштейну за критическое обсуждение и полезные советы при написании рукописи и Н. А. Пироговой за консультацию при статистической обработке данных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Young L. S., Rickinson A. B. Epstein—Barr virus: 40 years on // Nat. Rev. Cancer. — 2004. — Vol. 4. — P. 757—768.

2. Young L. S., Dawson C. W., Eliopoulos A. G. The expression and function of Epstein—Barr virus encoded latent genes // Mol. Pathol. — 2000. — Vol. 53. — P. 238—247.

3. Moorthy R. K., Thorley-Lawson D. A. All three domains of the Epstein—Barr virus-encoded latent membrane protein LMP-1 are required for transformation of rat-1 fibroblasts // J. Virol. — 1993. — Vol. 67. — P. 1638—1646.

4. Expression of the Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 induces B cell lymphoma in transgenic mice / Kulwichit W., Edwards R. H., Davenport E. M., Baskar J. F., Godfrey V., Raab-Traub N. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1998. — Vol. 95. — P. 11 963—11 968.

5. Sandvej K., Munch M., Hamilton-Dutoit S. Mutations in the Epstein—Barr virus latent membrane protein-1 (BNLF-1) gene in spontaneous lymphoblastoid cell lines: effect on in vitro transformation associated parameters and tumorigenicity in SCID and nude mice // Clin. Mol. Pathol. — 1996. — Vol. 49. — P. M290—M297.

6. Latent membrane protein 1 is critical for efficient growth transformation of human B cells by Epstein—Barr virus / Dirmeier U., Neuhi-erl B., Kilger E., Reisbach G., Sandberg M. L., Hammerschmidt W. // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63. — P. 2982—2989.

7. Mainou B. A., Raab-Traub N. LMP1 strain variants: biological and molecular properties / Mainou B. A., Raab-Traub N. // J. Virol. — 2006. — Vol. 80. — P. 6458—6468.

8. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 (LMP1) activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway to promote cell survival and induce actin filament remodeling / Dawson C. W., Tramountanis G., Eliopoulos A. G., Young L. S. // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 3694—3704.

9. Isolation and sequencing of the Epstein—Barr virus BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma / Hu L. F., Zabarovsky E. R., Chen F., Cao S. L., Ernberg I., Klein G., Winberg G. // J. Gen. Virol. — 1991. — Vol. 72 (Pt 10). — P. 2399—2409.

10. Sandvej K., Munch M., Hamilton-Dutoit S. Mutations in the Epstein—Barr virus latent membrane protein-1 (BNLF-1) gene in spontaneous lymphoblastoid cell lines: effect on in vitro transformation associated parameters and tumorigenicity in SCID and nude mice // Clin. Mol. Pathol. — 1996. — Vol. 49. — P. M290—M297.

11. The molecular epidemiology and evolution of Epstein—Barr virus: sequence variation and genetic recombination in the latent membrane protein-1 gene / Walling D. M., Shebib N., Weaver S. C., Nichols C. M.,

Flaitz C. M., Webster-Cyriaque J. // J. Infect. Dis. — 1999. — Vol. 179. — P. 763—774.

12. Edwards R. H., Seillier-Moiseiwitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acid changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein— Barr virus strains // Virology. — 1999. — Vol. 261. — P. 79—95.

13. LMP1 expression is positively associated with metastasis of nasopharyngeal carcinoma: evidence from a meta-analysis / Zhao Y., Wang Y., Zeng S., Hu X. // J. Clin. Pathol. — 2012. — Vol. 65. — P. 41—45.

14. Current understanding and management of nasopharyngeal carcinoma / Yoshizaki T., Ito M., Murono S., Wakisaka N., Kondo S., Endo K. // Auris Nasus Larynx. — 2011. — Vol. 14. — P. 171—175.

15. Epstein—Barr Virus latent membrane protein 1 induces Snail and epithelial-mesenchymal transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma / Horikawa T., Yoshizaki T., Kondo S., Furukawa M., Kaizaki Y., Pagano J. S. // Br. J. Cancer. — 2011. — Vol. 104. — P. 1160—1167.

16. Epstein—Barr Virus Latent Memrane Protein 1 Induces Cancer Stem/Progenitor-Like Cells inNasopfaringeal Epithelial cell lines / Kondo S., Wakisawa N., Muramatsu M., Zen Y., Endo K., Murono S., Sugi-moto H., Yamaoka S., Pagano J. S., Yoshizaki T. // J. Virol. — 2011. — Vol. 85, N 21. — P. 11 255—11 264.

17. Detection of Stage I nasopharyngeal carcinoma by serologic screening and clinical examination / Ji M. F., Yu Y. L., Cheng W. M., Zong Y. S., Ng P. S., Chua D. T., Ng M. H. // Chin. J. Cancer. — 2011. — Vol. 30. — P. 120—123.

18. Diagnostic value of Epstein—Barr virus capsid antigen-IgA in nasopharyngeal carcinoma: a meta-analysis / Li S., Deng Y., Li X., Chen Q. P., Liao X. C., Qin X. // Chin. Med. J. (Engl.). — 2010. — Vol. 123. — P. 1201—1205.

19. Combined determination of Epstein—Barr virus-related antibodies and antigens for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma / Luo Y. L.,

Ou G. P., Chi P. D., Liang Y. N., Liu Y. H., Huang M. Y. // Ai. Zheng. — 2009. — Vol. 28. — P. 76—78.

20. Epstein—Barr virus detection in nasopharyngeal carcinoma: implications in a low-risk area / Breda E., Catarino R. J., Azevedo I., Lo-bao M., Monteiro E., Medeiros R. // Braz. J. Otorhinolaryngol. — 2010. — Vol. 76. — P. 310—315.

21. Epstein—Barr viral serology in nasopharyngeal carcinoma patients in the USSR and Cuba, and its value for differential diagnosis of the disease / Gurtsevitch V., Ruiz R., Stepina V., Plachov I., Le Riverend E., Glazkova T., Lavoue M. F., Paches A., Aliev B., Mazurenko N. // Int. J. Cancer. — 1986. — Vol. 37. — P. 375—381.

22. Гуморальный иммунный ответ к вирусу Эпштейна—Барр в диагностике рака носоглотки (Обзор литературы и 30-летний опыт собственных исследований) / Гурцевич В. Э., Степина В. Н., Сенюта Н. Б., Гончарова Е. В., Щербак Л. Н., Душенькина Т. Е., Репкина И. А., Белоусова Н. В., Кондратьева Т. Т., Алиева С. Б., Ахундов А. А., Матякин Е. Г., Поддубный Б. К., Пробатова Н. А., Па-чес А. И. // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2011.— Т. 22., № 2. — С. 20—29.

23. Sequence analysis of the Epstein—Barr virus (EBV) latent membrane protein-1 gene and promoter region: identification of four variants among wild-type EBV isolates / Sandvej K., Gratama J. W., Munch M., Zhou X. G., Bolhuis R. L., Andresen B. S., Gregersen N., Hamilton-Du-toit S. // Blood. — 1997. — Vol. 90. — P. 323—330.

24. Epstein—Barr virus strains defined by the latent membrane protein 1 sequence characterize Thai ethnic groups / Saechan V., Settheetham-Ishida W., Kimura R., Tiwawech D., Mitarnun W., Ishi-da Y. // J. Gen. Virol. — 2010. — Vol. 91. — P. 2054—2061.

Поступила 03.02.2012

Larisa Sergeyevna Yakovleva1, Natalya Borisovna Senyuta2,

Vera Nikolayevna Stepina3, Elena Vasilievna Goncharova4,

Liana Nodarovna Scherbak5, Samir Makhabbatogly Jabbarov6,

Vladimir Eduardovich Gurtsevich7

EPSTEIN—BARR VIRUS IN PATIENTS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA: LMP1 VARIANTS, ANTIBODY RESPONSE AND CLINICAL MANIFESTATIONS

1 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

2 MD, PhD, Leading Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

3 MD, PhD, DSc, Senior Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

4 MD, PhD, Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

5 MSc, PhD, Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

6 MD, Postgraduate Student, Respiratory and Digestive Tract Tumor Department, Clinical Oncology Research Institute,

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

7 MD, PhD, DSc, Professor, RF Honored Scientist, Head, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)

Address for correspondence: Gurtsevich Vladimir Eduardovich, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478; e-mail: vladgurtsevich@yahoo.com

The purpose of this study was to analyze polymorphism (divergence) of Epstein—Barr virus LMP1 oncogene in patients with nasopharyngeal carcinoma and control patients with other oral tumors, infectious mononucleosis or blood donors. In particular it was important to clarify whether LMP1 variants with various degrees of polymorphism (divergence) may influence clinical manifestations of disease and antibody response to Epstein—Barr virus antigens. We analyzed tumor tissue, blood or oral swab samples in nasopharyngeal cancer patients and those with other oral tumors, infectious mononucleosis and healthy blood donors. Samples of the LMP1 C-terminal regions obtained by PCR (25 from nasopharyngeal cancer patients, 14 from patients with different oral tumors, 10 from patients with infectious mononucleosis and 15 from blood donors) were subjected to sequence analysis. Blood plasma from all individuals investigated was tested for IgG and IgA antibodies to capsid and early virus antigens. It was fond for the first time that LMP1 highly divergent variants were seen at an equal rate in patients with nasopharyngeal carcinoma and other oral tumors, i. e. tumors associated and not associated with Epstein—Barr virus, respectively. None of the patients with infectious mononucleosis or blood donors (except one) had highly divergent variants. In patients with nasopharyngeal carcinoma or other oral tumors the presence of LMP1 variants with Cao deletion (demonstrating higher tumorigenic activity as compared with other LMP1 variants) showed no correlation with either more advanced disease or elevated virus-specific antibody titers. These findings suggest that highly tumorigenic LMP1 variants have no effect on neoplastic disease course. We were also the first to demonstrate that nasopharyngeal carcinoma incidence was higher in natives of the Caucasus as compared with inhabitants of Central Russia.

Key words: Epstein—Barr virus, nasopharyngeal carcinoma, latent membrane protein 1 (LMP1), gene sequencing, LMP1 polymorphism.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.