CC BY
34
© КОЛЛЕКТиВ АВТОРОВ, 2017 УДК 578.825.13:578.54.].083-2
Смирнова К.В., Дидук С.В., Гурцевич В.Э.
полиморфизм онкогена lmpi вируса эпштейна—барр у представителей коренного малочисленного народа дальнего востока россии
ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, 115478, г Москва, Россия, Каширское шоссе, д. 24
Механизм возникновения ассоциированных с ВЭБ злокачественных и доброкачественных патологий человека в неэндемичных регионах до сих пор остается не выясненным. Исследование этой проблемы в России, неэндемичной для ВЭБ-асоциированных заболеваний стране, является актуальной задачей в связи с разнообразием этносов, населяющих различные климатогеографические регионы страны. Особый интерес представляют поиски генетических особенностей штаммов ВЭБ, персистирующих у коренных народов России, в частности, её малочисленных представителей, заселяющих территорию страны с исторических времен.
Известно, что вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) ассоциирован с рядом новообразований человека различной этиологии. При этом уникальной особенностью ВЭБ является полиморфизм его основного онкогена — латентного мембранного белка 1 (LMP1), кодируемого одноименным геном LMP1. Важность изучения генетических перестроек в этом гене базируется на влиянии определённых мутаций, делеций и/или вставок на активность ключевых внутриклеточных молекул, таких как NF-kB, AP-1, iNOS и ряда других, приводящих к малигнизации клетки. Учитывая вышесказанное, наши исследования были сфокусированы на сравнительном анализе полиморфизма LMP1 ВЭБ у коренного населения Хабаровского края (нанайцев) и переселенцев из европейской части страны в данный регион, который не является эндемичным для ВЭБ-ассоциированных патологий, но находится на границе с эндемичными по ВЭБ-ассоциированной форме рака носоглотки южными провинциями Китая. Полученные результаты убедительно показали, что образцы LMP1 штаммов вируса, инфицирующих у нанайцев и переселенцев, по своим последовательностям близки к описанным ранее в литературе вариантам LMP1 из различных регионов мира, но обладают рядом уникальных мутационных особенностей. Ключевые слова: вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ); латентный мембранный белок 1 (LMP1); полиморфизм; мутация; филогенетический анализ.
Для цитирования: Смирнова К.В., Дидук С.В., Гурцевич В.Э. Полиморфизм онкогена LMP1 вируса Эпштейна—Барр у представителей коренного малочисленного народа Дальнего Востока России. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(5): 239-247. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-5-239-247
SmirnovaK.V., DidukS.V, Gurtsevitch V.E.
POLYMORPHISM OF EPSTEIN—BARR VIRuS LMP1 ONCOGENE IN NANAIANS, REPRESENTATIVES OF INDIGENOuS MINORITY Of THE RuSSIAN Far EAST
N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center, 24, Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia
The mechanism of EBV-associated malignant and benign human pathologies in non-endemic regions is still not elucidated. The investigation of this problem in Russia, the country, non-endemic for EBV-associated diseases, is of a special importance due to the variety of ethnic groups inhabiting different geographic and climatic regions. The search for genetic peculiaritis of EBV strains persisting in indigenous peoples of Russia, especially, in its minority representatives occupying the country since historical times is of the particular interest. Epstein—Barr virus (EBV) is known to be associated with a number of human tumors of lymphoid and epithelial cell origin. This unique feature of EBV is polymorphism of its main oncogene — latent membrane protein 1 (LMP1), encoded by a gene of the same name LMP1. The importance of the studying ofgenetic mutations (deletions, insertions and other) in this gene is based on the influence of his certain mutations on the activity of such key intracellular molecules as NF-kB, AP-1, iNOS, and several others, leading to cell malignancy. With bearing it in mind, our study has been focused on the comparative analysis of the LMP1 EBV polymorphism among the indigenous population of the Khabarovsk Territory (Nanai) and immigrants from the European part of the country to this region, which is not endemic for EBV-associated pathologies, but is located on the border with endemic EBV-associated form of nasopharyngeal carcinoma in southern provinces of China. The results obtained clearly showed sequences of LMP1 samples of the virus strains infecting Nanai and immigrants in the Khabarovsk Territory to be similar to LMP1 variants from different parts of the world previously described in the literature and have a number of unique mutation features.
Keywords: Epstain—Barr virus (EBV); latent membrane protein 1 (LMP1); polymorphism; mutation; phylogenetic analysis.
For citation: Smirnova K.V., Diduk S.V., gurtsevitch V.E. Polymorphism of Epstein-Barr Virus LMP1 oncogene in nanaians, representatives of indigenous minority of the Russian Far East. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Epidemiology and infectious diseases (Russian Journal). 2017; 22(5): 239-247. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.1882/1560-9529-2017-22-5-239-247
For correspondence: Ksenia V. Smirnova, MD, PhD, senior researcher of the laboratory of Viral Carcinogenesis of the Research Institute of Carcinogenesis of the N.N. Blokhin National Medical Cancer Research Center, 24, Kashirskoe shosse, 115478 Moscow, Russia
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgement. The study was carried out with the financial support of the Russian Foundation for Basic Research in the frameworks of research projects No. 14-04-01810a and No. 15-34-70031mil_a_mos.
Received 20.10.2017 Accepted 22.11.2017
Для корреспонденции: Смирнова Ксения Валерьевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. вирусного канцерогенеза Нии канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России, E-mail: [email protected]
оригинальная статья Введение
Доказано, что вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ), убиквитарно распространенный среди населения земного шара, также ассоциирован с целым спектром доброкачественных и злокачественных новообразований. К числу последних относят рак носоглотки (РНГ), лимфому Беркита, определенные гистологические варианты лимфомы Ходжкина, рака желудка и целый ряд других [1]. Важно отметить, что в различных географических регионах мира и этнических группах выявлены варианты ВЭБ, в ключевых генах которых обнаружены определенные наборы мутаций (замены, вставки и делеции), влияющие на их трансформирующие свойства и онкогенный потенциал. К числу функционально важных генов, с которыми связан трансформирующий и онкогенный потенциал ВЭБ, относится латентный мембранный белок 1 (LMP1), обладающий выраженным полиморфизмом [2]. Являясь мультифункциональным геном ВЭБ, его признанным онкогеном, LMP1 участвует в индукции целого ряда транскрипционных факторов (NF-kB, AP-1, STAT), оказывая влияние на изменение профиля внутриклеточной активности ряда сигнальных путей, что приводит к трансформации инфицированной клетки [3]. Показано, что уровень индукции различных сигнальных каскадов клетки часто зависит от определённых мутаций в последовательности этого онкогена [4].
Молекулярный анализ LMP1 различного клинического и географического происхождения позволил обнаружить генетические варианты гена, отражающие в ряде случаев их неодинаковую биологическую активность. Так, вариант LMP1, амплифицированный более 20 лет тому назад от больного раком носоглотки (РНГ) из Южных провинций Китая, региона эндемичного для этого новообразования, содержал делецию 30 пар нуклео-тидов (п.н.) в С-терминальной области и кодировал соответствующий делетированный вариант белка (LMP1) [5]. Этот вариант LMP1, названный «Cao», проявлял выраженные трансформирующие свойства in vitro и оказался более туморогенным для мышей с выраженным комбинированным иммунодефицитом (SCID) по сравнению с LMP1 стандартного варианта ВЭБ, штамма В95.8 [6]. Опыты по трансфекции на клетках линии BALB/3T3 также подтвердили более высокий туморогенный потенциал LMP1-Cao по сравнению с LMP1-895.8 [7]. Повышенную трансформирующую активность изолята LMP1-Cao связывают с наличием в его C-терминальной области делеции 30 п.н., которая ответственна за усиленную индукцию NF-kB. Позже было обнаружено, что штаммы ВЭБ, содержащие делетированные варианты LMP1, не только широко распространены в регионах, эндемичных для РНГ, но также встречаются и в других
не эндемичных регионах мира. Более того, делетированные варианты LMP1 были амплифициро-ваны из опухолевых клеток больных некоторыми ВЭБ-ассоциированными новообразованиями лим-фоидного происхождения и даже здоровых лиц [8-10].
Проведенное нами ранее исследование, свидетельствует о том, что среди населения центрально-европейской части России доминирует штамм ВЭБ с низкодивергентным вариантом LMP1-B95.8, обладающий низкой трансформирующей активностью [11—13]. Какие штаммы ВЭБ и варианты LMP1 персистируют среди населения восточного региона России с большим числом малочисленных этносов — вопрос, который до сих пор остается не изученным. В этом плане представляют интерес проведение исследования среди одного из представителей коренного малочисленного народа Дальнего Востока, нанайцев, проживающих в Хабаровском крае по берегам Амура и его притоков. Важно отметить, что до массового заселения Дальнего Востока из центральных регионов России, где, как уже было упомянуто, преобладают низкодивергентные варианты ВЭБ, эта этническая группа локально размещалась на юго-восточных территориях РФ и восточных провинциях Китая, где могла быть инфицирована локальными штаммами этого вируса. Еще одной особенностью этой этнической группы является их низкая продолжительность жизни, которая к концу семидесятых годов прошлого века составляла 44 года, хотя в 80-е годы произошло некоторое повышение этого показателя. Рак, как известно, заболевание людей пожилого возраста, и при низкой продолжительности жизни ВЭБ обычно не успевает проявить свои онкогенные потенции.
Исходя из вышесказанного, данное исследование впервые посвящено изучению полиморфизма LMP1 ВЭБ у коренного населения (нанайцев) и иммигрантов данного региона, который не является эндемичным для ВЭБ-ассоциированных патологий, но находится на границе с эндемичными по РНГ южными провинциями Китая. Полученные нами результаты убедительно показали, что российские образцы LMP1 по своим последовательностям близки к описанным ранее в литературе вариантам LMP1 из различных регионов мира, но обладают рядом уникальных мутационных особенностей.
Материалы и методы
Изучаемые группы и образцы ДНК
В исследовании участвовало две группы населения Хабаровского края Дальнего Востока РФ. Одна группа состояла из 19 представителей коренного населения, нанайцев: 9 мужчин (47,4%) и 10
женщин (52,6%). Возраст вошедших в эту группу лиц колебался от 24 до 58 лет (медиана—45,7 лет). Другая группа, состоящая из 28 лиц (мужчин 13, 46%; женщин 15, 54%), представляла собой иммигрантов Дальнего Востока из европейского части РФ. В эту группу вошли жители г. Комсомольска-на-Амуре, представители славянских народов России. Возраст вошедших в эту группу лиц колебался от 28 до 63 лет (медиана — 46,1 лет). Материалом для исследования служили образцы крови и смывов ротоглотки. Из собранных образцов биологического материала была экстрагирована ДНК, используя набор Проба-НК (ДНК-диагностика). Наличие ДНК подтверждали методом ПЦР с соответствующей парой праймеров к области гена GAPDH.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
На следующем этапе каждый образец ДНК изучали на присутствие гена LMP1 с помощью «гнездной» ПЦР, используя соответствующие пары праймеров: внешние — Eco3': 5'-TCCAGGAGAATTCCCCATCTCGAGAGTG-3' и 8785: 5'-
CGACCCCAATCTGGATGTATTATTATGG-3'; и внутренние — Bam3': 5'-GTTTTCGTGGATCCTTATACAGTA-3' и 8702: 5'-GCTACCGATTCTGGCCATGAATCTGAC-3', как было описано ранее [11].
Секвенирование
Для секвенирования амплифицированных образцов LMP1 использовали метод, описанный Edwards и соавт., (1999) с небольшими модификациями [14]. Исследование проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом сиквенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Обработку данных секвенирования проводили с помощью программ Sequence Scanner v.1.0, Vector NTI и Mega v. 2.1.
Классификация LMP1
Полученные варианты LMP1 анализировали в соответствии с предложенными ранее классификациями [15—17].
Филогенетический анализ
Полученные последовательности гена LMP1 ВЭБ с использованием компьютерной программы Vector NTI транслировались в аминокислотные последовательности, после чего проводили филогенетический анализ. Для построения филогенетического древа использовался метод «ближайших соседей» (neighbor-joining, Кимура 2-параметр) с использованием программы MEGA v.2.1. В качестве контрольных последовательностей использовались последовательности прототипного низкодивергентного LMP1-B95-8 и высокотуморо-генного LMP1-Cao, полученные из открытых баз данных PubMed и GenBank.
Статистический анализ
Точный тест Фишера был использован для сравнения достоверности различий между процентным содержанием вариантов LMP1 в биологических образцах двух сравниваемых групп. Значения p менее 0,05 (p < 0,05) указывало на наличие существенных различий.
Результаты и обсуждение
Тестирование образцов крови и смывов ротоглотки на присутствие ДНК вируса Эпштейна-Барр, проведенное при предварительном исследовании, показало, что у представителей коренного населения (нанайцев), и у иммигрантов, инфици-рованность ВЭБ составила 100%.
Филогенетический анализ
Используя экстрагированную ДНК ВЭБ, нами проведена амплификация и секвенирование образцов C-терминальной области онкогена LMP1. Анализ нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей полученных ам-пликонов выявил их некоторую вариабельность. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей полученных образцов LMP1 позволил подтвердить их гетерогенность (рисунок 1). Ни для одной из сравниваемых групп населения не выявлено преобладание B95.8/A генотипа LMP1, доминирующего у жителей Европейской части РФ и характеризующегося низким уровнем дивергенции — 3—4-мя критическими заменами а.к. по сравнению с прототипным вариантом LMP1-B95-8. Следует также отметить, что доминирование низкодивергентной группы LMP1-B95.8A отмечено только на территории европейской части России [11], в остальных странах мира представители этой группы встречаются спорадически, а превалирующее число исследованных вариантов LMP1 относится к высокодивергентным вариантам Chinal, NC, Med+, Med- и ряду других [14]. В проведенном исследовании, все изучаемые варианты LMP1 ВЭБ были равномерно распределены между известными в литературе низко (B95.8/A) и высокодивергентными вариантами LMP1 Med+, Med-, China1 и NC, при этом такие варианты как China2, China3 и Alaskan отсутствовали.
Классификация вариантов LMP1 ВЭБ
Результаты классификации образцов LMP1 от представителей двух изучаемых групп представлены в табл. 1. из таблицы следует, что набор вариантов LMP1 и их процентное содержание у аборигенов и иммигрантов был практически одинаковым. При этом низкодивергентный вариант B95.8 в каждой группе составил примерно У часть от числа всех зарегистрированных вариантов. Процентное же содержание высокодивергентного варианта China1, соответствующего китайскому варианту Cao, для которого характерен большой спектр
оригинальная статья
■сЕ
FE12.3 FE10.3 FEn2.3 FE15.3
' FE11.3 ■ FE20.3 FE22.3 — FEn6.3 -FEn9.3
- FE2.3
FEn12.3
FEn10.3
"FEn16.3 -FE17.3 ■ FE23.3
-B95-8
-FE16.3
" FEn11.3 -FE1.3
- FEn8.3 ■ FE6.3
-FEn18.3
' FEn17.3
FEn15.3
FEn19.3
FE5.3 FE5.3
- FE25.3
- FE9.3
" FEn1.3
-FE8.3
[- FEn-24
— FE21.3 -FE18.3
" FEn14.3
Cao
L FE4.3
FE24.3 FE7.3
г FE19.3 ~-FE4.3
— FEn13.3
— FEn7.3
— FEn3.3
— FE12.3
— FE21.3 FE20.3 FE13.3
" FE14.3
0,01
Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное на основании сравнения аминокислотных последовательностей вариантов LMP1 ВЭБ российского происхождения, полученных от коренных жителей дальнего востока России (FEn) и иммигрантов для данного региона (FE), с прототипным LMP1-B95.8 и высокотуморогенным LMP1-Cao (метод «ближайших соседей» (Кимура 2-параметр) с использованием программы MEGA v.2.1).
мутаций и выраженный трансформирующий потенциал, хотя и был несколько выше в группе иммигрантов, чем в группе нанайцев (21.4%; 6/28 против 15.8%; 3/19), различие между этими показателями оказалось статистически недостоверным
(p < 0.001). Содержание других вариантов онко-белка (Med+, Med-, NC) в сравниваемых группах также разнилось незначительно и статистически недостоверно.
Анализ полученных данных показал, что ни один из исследованных образцов LMP1 не содержал высоко трансформирующую Cap-подобную делецию 30 п.н., характерную для вариантов LMP1 у больных нРНГ из южных провинций Китая и стран Юго-Восточной Азии, часто встречающуюся среди здорового населения этих регионов [5].
Спектр генотипических вариантов LMP1, выявляемых у аборигенов и иммигрантов Хабаровского края, а также населения европейской части России, в сопоставлении с таковым у населения различных регионов мира, представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что для населения стран Азии и Северной Америки характерно широкое распространение штамма ВЭБ, кодирующего высокоту-морогенный вариант онкобелка Cao/China1 (82.5% и 66.0% соответственно). Эти показатели контрастируют с отсутствием указанного штамма вируса у европейцев, невысокой его встречаемостью у россиян европейской части России (9.5%), а также у аборигенов и иммигрантов Хабаровского края (15.8% и 21.4% соответственно). Широкое распространение ВЭБ с высоко туморогенным вариантом LMP-China1 среди населения южных провинций Китая и стран Юго-восточной Азии является, по-видимому, важной [18], но не единственной причиной высокого уровня заболеваемости РНГ в этих странах. играя роль пускового фактора в возникновении этого новообразования, ВЭБ для реализации онкогенных потенций нуждается в содействии ряда дополнительных факторов, одним из которых является генетическая предрасположенность лиц к РНГ, их определённый HLA гаплотип [19, 20]. Доказанными факторами риска возникновения РНГ также являются: употребление в пищу консервированных продуктов в раннем возрасте, содержащих нитраты и нитрозамины [21], курение сигарет и профессиональное воздействие формальдегида и древесной пыли [22]. Содержание низкодивергентного и низкотуморогенного варианта LMP1 B95.8 среди населения указанных регионов (табл. 2) также существенно разнилось.
Наиболее высокий процент этого варианта он-кобелка зарегистрирован среди населения Европейской части России (78.9%), что коррелирует с низкой заболеваемостью РНГ в стране — 0.14% у мужчин и 0.06% у женщин от числа всех зарегистрированных солидных новообразований в 2012 г. [23]. Среди населения Европы и Северной Америки частота обнаружения низкодивергентного варианта LMP1 B95.8 была практически вдвое ниже (42% и 33% соответственно), чем у жителей Европейской части России и, примерно, до чет-
ORIGINAL ARTIcLE Таблица 1
Варианты онкобелка LMP1, выявленные у представителей коренного (нанайцев) населения и иммигрантов Хабаровского
Изучаемые группы населения Хабаровского края Варианты LMP1
B95.8/A (%) China1 (%) Med+ (%) Med- (%) NC (%)
Нанайцы 5 3 4 4 3
n = 19 26,2% 15,8% 21,1% 21,1% 15,8%
Мигранты 7 6 4 5 6
n = 28 25,0% 21,4% 17,9% 14,3% 21,4%
Всего 12 9 8 9 9
верти ниже среди аборигенов и иммигрантов Хабаровского края (26.2% и 25.0% соответственно). Учитывая высокую этническую и национальную гетерогенность населения Европы и США, связать уровни распространенности LMP1 B95.8 в этих странах с показателями заболеваемости РНГ не представляется возможным. Интересно отметить, что варианты LMP1 China 2, China 3 и Alaskan у лиц сравниваемых групп, как и среди россиян, полностью отсутствовали. Объединённый генотип LMP1 Med, состоявший из генотипов Med+ и Med- (содержавших и не содержавших делецию 10 а.к. соответственно), встречался среди изучаемых групп населения примерно с одинаковой частотой, за исключением низкого его содержания среди населения Европейской части России. Генотип LMP1 NC, отсутствующий у населения Азиатских стран и Северной Америки, у населения Европы и обеих групп Хабаровского края был невысоким и колебался от 18% до 21.4%, и составил 10.5% у населения Европейской части России [13].
Аминокислотные замены в последовательности LMP1 ВЭБ
Сравнительный анализ транслированных аминокислотных последовательностей LMP1, характерных для штаммов ВЭБ, персистирующих у представителей коренного населения (нанайцев) и иммигрантов Хабаровского края, представлен в
табл. 3. Результаты анализа позволяют сделать вывод о достаточно высокой степени генетического родства анализируемых образцов LMP1, хотя обнаружены и некоторые отличия. В частности, неожиданным стало выявление образца FEn14.3, полученного от представителя коренного населения, содержащего вариант LMP1 со специфической мутацией в 212-м положении (глицин на серин, G212S), сопровождающей «Cao» делецию. Эта мутация приходится на первый сайт распознавания HOS-белков (одного из компонентов Е3-лигазы, участвующего в процессинге молекулы IkB — су-прессора NF-kB). В то же время абсолютно все варианты LMP1 ВЭБ из тестируемых нами образцов биологического материала имели характерную для Сао-вариантов LMP1 замену в 366-м (серин на треонин) положении. Кроме того, в ряде вариантов LMP1 из обеих анализируемых групп удалось выявить дополнительные Cao-специфические мутации, например, замену глутамина на аргинин в 334-й позиции (Q334R). Вместо типичной для Сао-варианта LMP1 ВЭБ замены в 328-м положении глутаминовой кислоты на аланин (E328A) в изученных нами образцах LMP1 мы выявили модифицированную замену в том же положении глутаминовой кислоты на глутамин (E328Q). При этом данная замена не является типичной для европейских образцов, но распространена среди
Таблица 2
Распространение вариантов LMP1 у неонкологических больных/доноров крови в различных географических регионах мира.
Генотип LMP1 Азия* Северная Америка* Европа* Европейская часть России** Аборигены Хабаровского края (нанайцы) Мигранты Хабаровского края (славяне)
China 1 70.0% 33.0% 27.0% 5.3% 15.8% 21.4%
China 2 0.0% 0.0% 0.0% 0/0% 0.0% 0.0%
China 3 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
Med 13.3% 33.0% 12.0% 5.3% 42.2% 32.2%
Alaskan 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
NC 0.0% 0.0% 18.0% 10.5% 15.8% 21.4%
B95-8 10.0% 33.0% 42.0% 78.9% 26.2% 25.0%
Другие 9.7% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
оригинальная статья
Таблица 3
Повторяющиеся элементы а.к. в ^терминальном домене образцов LMP1, полученных от коренного населения (нанайцев) и иммигрантов Хабаровского края
253 ak ▼ 306 ak ▼
B95.8 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
Code Нанайцы (Хабаровский край)
FEn6 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn9 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn10 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn12 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn16 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE1n PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn4 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn14 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FEn2 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn11 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn7 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn18 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn5 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn13 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn8 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FEn3 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FEn15 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn19 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FEn17 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
Мигранты Дальнего Востока (Комсомольск на Амуре)
FE1 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE2 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE4 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE6 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE16 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE17 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE23 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE7 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE19 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE24 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE3 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE8 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE18 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL *
FE26 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE10 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE11 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE22 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE27 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE14 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE21 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE25 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL
FE5 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE9 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE15 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE28 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE12 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE20 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
FE13 PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL
Примечание. Повторяющиеся элементы 11 а.к. (PQDPDNTDDNG) и 5 а.к.: (PHDPL) между а.к. 253 и 306 в C-терминальном домене LMP1 прото-типного штамма B95.8 показаны на первой линии. В левой колонке представлены кодовые обозначения изучаемых вариантов LMP1. PQDPDNTDDNG — повторяющийся элемент, состоящий из 11 а.к.; PQGPDNTDDNG — повторяющийся элемент, состоящий из 11 а.к. с точечной мутацией D на G; PHDPL — последовательность, состоящая из пяти аминокислот; *Последовательности LMP1, идентичные варианту LMP1 прототипного штамма ВЭБ B95-8.
анализируемых образцов LMP1 ВЭБ у населения Дальнего Востока России. Вероятно, выявление данной мутации обусловлено географической близостью эндемичного для ВЭБ региона — КНР, а также активной взаимной миграцией населения пограничных районов РФ и КНР.
В образце LMP1 FEn10.3, амплифицированном из смыва ротоглотки коренного населения Хабаровского края, нами обнаружена важная замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую в 210-м положении (D210E). Известно, что данная аминокислота необходима для связывания HOS белков, что может опосредованно привести к активации транскрипционного фактора NF-kB. Кроме того, в большинстве анализируемых последовательностей LMP1 у обеих групп выявлена замена гистидина на пролин в 358-й позиции (H358P). Указанная замена может приводить к нарушению способности этого белка связывать HOS белки. Таким образом, анализ аминокислотных последовательностей образцов LMP1 ВЭБ, полученных от коренных жителей Дальнего Востока России и иммигрантов данного региона, позволил выявить в этих образцах ряд специфических мутаций, которые, при воздействии вредных факторов окружающей среды, могут оказаться критическими для инициации канцерогенеза ВЭБ-ассоциированных новообразований.
Повторяющиеся элементы в онкобелке LMP1 ВЭБ
Предыдущими исследованиями показано, что C-концевой домен LMP1 различных изоля-тов ВЭБ содержит варьирующее число повторов 11 аа (PQDPDNTDDNG), расположенных между а.к. 253 и 306 [24—26]. Вариант LMP1 про-тотипного штамма ВЭБ B95.8 содержит четыре таких повтора и две вставки последовательностей 5 а.к. (PHDPL: 275—279): одна расположена между 11 а.к. повторами 2 и 3, а другая после последнего повтора (а.к.: 302—306). Вставка 5 а.к. представляет собой так называемый JAK3-сайт домена CTAR3 LMP1 (а.к.: 275—330), который предположительно связан с активацией JAK3/STAT сигнального пути [24, 25]. Для выяснения структурных особенностей образцов LMP1, полученных от аборигенов (нанайцев) и иммигрантов Хабаровского края, C-концевые домены онкобелка сравнивали по сочетаниям а.к. повторов и вставок (табл. 3). Результаты свидетельствуют о том, что процентное содержание В95-8-подобных последовательностей со вставками 5 а.к. в положении 275—300 среди образцов LMP1, происходящих от нанайцев и иммигрантов, существенно не отличается [26.3% (5/19) и 25.0% (7/28) соответственно, p > 0,05]. Различия в содержании 4 и 5-ти 11-а.к. повторов (PQDPDNTDDNG) в образцах LMP1 независи-
мо от их происхождения были также статистически недостоверны [47.4% (9/19) у нанайцев по сравнению с 60.7%. (17/28) у иммигрантов и 21.1% (4/19) у нанайцев по сравнению с 14.3% (4/28) у иммигрантов, соответственно]. Тем не менее, в отличие от образцов онкобелка от нанайцев, в LMP1 образцах иммигрантов точечная мутация D на G встречается чаще и это различие статистически достоверно [10.5% (2/19) и 42.9% (12/28) соответственно,p < 0,05].
Анализируя полученные данные, можно предположить, что образование 11 а.к. повторов и 5 а.к. вставок может происходить в результате рекомби-национных событий, происходящих во время репликации вируса. Нельзя также исключить, что расположение указанных повторов и вставок является географической особенностью структуры LMP1 у локально персистирующих штаммов ВЭБ, и, вероятно, их наличие не играет решающей роли в биологических функциях онкобелка [27, 28].
Заключение
До сих пор роль ВЭБ в возникновении патологий, ассоциированных с этим вирусом, в неэндемичных регионах остается малоизученной. В данной работе впервые показано разнообразие вариантов ВЭБ, персистирующих у коренного (нанайцы) населения и иммигрантов Хабаровского края. Выявленные генетические особенности последовательностей в вариантах LMP1 ВЭБ у нанайцев, при сравнении с таковыми у жителей европейской части РФ, позволяют предположить наличие у онкогена LMP1 штаммов вируса, пер-систирующих среди аборигенов, уникальных свойств. В частности, обнаруженные аминокислотные замены в 212, 328 и 366 положениях молекулы LMP1, характерные для его высокоту-морогенных вариантов, могут придавать этому онкобелку агрессивные характеристики. Дальнейшие исследования свойств вариантов LMP1, уникальных для жителей Дальнего Востока РФ, вероятно, позволят нам приблизиться к пониманию механизмов канцерогенеза для неэндемичных регионов.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФи в рамках научно-исследовательских проектов № 14-04-01810а и № 15-34-70031мол_а_мос.
ЛИТЕРАТУРА
1. Young L.S., Rickinson A.B. Epstein—Barr virus: 40 years on. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4(10): 757—68.
2. Kaye K., Izumi K., Kieff E. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B-lymphocyte growth transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; (90): 9150—4.
3. Mainou B.A., Raab-Traub N. LMP1 strain variants: biological and molecular properties. J. Virol. 2006; (80): 6458—68.
4. Fielding C.A., Sandvej K., Mehl A. et al. Epstein—Barr virus LMP-1 natural sequence variants differ in their potential to activate
оригинальная статья
cellular signaling pathways. J. Virol. 2001; 75(19): 9129—41.
5. Johnson R.J., Stack M., Hazlewood S.A. et al. The 30-base-pair deletion in chinese variants of the Epstein-Barr virus LMP1 gene is not the major effector of functional differences between variant LMP1 genes in human lymphocytes. J. Virol. 1998; 72(5): 4038—48.
6. Blake S.M., Eliopoulos A.G., Dawson C.W., Young L.S. The transmembrane domains of the EBV-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) variant Cao regulate enhanced signalling activity. Virology. 2001; (282): 278—87.
7. Baichwal V.R., Sudgen B. Transformation of Balb3T3 by the BNLF-1 gene of Epstein—Barr virus. Oncogene. 1988; 2(5): 461—7.
8. Knecht H., Bachmann E., Brousset P. et al. Deletions within the LMPl oncogene of Epstein—Barr virus are clustered in Hodgkin's disease and identical to those observed in nasopharyngeal carcinoma. Blood. 1993; 82(10): 2937—42.
9. Cheung S.-T., Lo K.-W., Leung S. et al. Prevalence of LMP1 deletion variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma and gastric tumors in Hong Kong. Int. J. Cancer. 1996; (66): 711—20.
10. Dolcetti R., Zancai P., de Re V. et al. Epstein—Barr virus strains with latent membrane protein-1 deletions: prevalence in the Italian population and high association with human immunodeficiency virus-related Hodgkin's disease. Blood. 1997; (89): 1723—31.
11. Смирнова К.В., Дидук С.В., Гурцевич В.Э. Функциональный анализ вариантов латентного мембранного белка 1 (LMP1) вируса Эпштейна—Барр у больных лимфопролифератив-ными заболеваниями. Биомедицинская химия. 2011; 57(1): 114—26.
12. Senuyuta N., Yakovleva L., Goncharova E. et al. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 (LMP-1) polymorphism in na-sopharyngeal carcinoma and other oral cavity tumors in Russia. J. Medical Virology. 2014; 86(2): 290—300.
13. Гончарова Е.В., Сенюта Н.Б., Смирнова К.В. и др. Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) в России: инфицированность населения и генотипический анализ вариантов гена LMP1 у больных ВЭБ-ассоциированными патологиями и здоровых лиц. Вопросы вирусологии. 2015; 60(2): 11—7.
14. Edwards R., Seillier Moisewitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acids changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein—Barr virus strains. Virology. 1999; (261): 79—95.
15. Mainou B.A., Raab-Traub N. LMP1 strain variants: biological and molecular properties. J. Virol. 2006; 80(13): 6458—68.
16. Sandvej K., Gratama J.W., Munch M. et al. Sequence analysis of the Epstein—Barr virus (EBV) latent membrane protein-1 gene and promoter region: identification of 4 variants among wildtype EBV isolates. Blood. 1997; (90): 323—30.
17. Walling D., Shebib N., Weaver S. et al. The molecular epidemiology and evolution of Epstein-Barr virus: sequence variation and genetic recombination in the latent membrane protein-1 gene. J. Infect. Dis. 1997; (179): 763—74.
18. Sung N.S., Edwards R.H., Seillier-Moiseiwitsch F. et al. Epstein-Barr virus strain variation in nasopharyngeal carcinoma from the endemic and non-endemic regions of China. Int. J. Cancer. 1998; 76(2): 207—15.
19. Burt R.D., Vaughan T.L., Mcknight B. et al. Associations between human leukocyte antigen type and nasopharyngeal carcinoma in Caucasians in the united States. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996; 5(11): 879—87.
20. Hildesheim A., Apple R.J., Chen C.J. et al. Association of HLA class I and II alleles and extended haplotypes with nasopharyn-geal carcinoma in Taiwan. J. Natl. Cancer Inst. 2002; 94(23): 1780—9.
21. Ward M.H., Pan W.H., Cheng Y.J. et al. Dietary exposure to nitrite and nitrosamines and risk of nasopharyngeal carcinoma in Taiwan. Int. J. Cancer. 2000; 86(5): 603—9.
22. Vaughan T.L., Stewart P.A., Teschke K. et al. Occupational exposure to formaldehyde and wood dust and nasopharyngeal carcinoma. Occup. Environ. Med. 2000; 57(6): 376—84.
23. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. М.; Издательская группа РОНЦ; 2014.
24. Miller W.E., Edwards R.H., Walling D.M., Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein—Barr virus latent membrane protein. J. Gen. Virol. 1994; (75): 2729—40.
25. Li S.N., Chang Y.S., Liu S.T. Effect of a 10 Aamino acid deletion on the oncogenic activity of latent membrane protein 1 of Epstein—Barr virus. Oncogene. 1996; (12): 2129—35.
26. Nagamine M., Takahara M., Kishibe K. et al. Sequence variations of Epstein-Barr virus LMP1 gene in nasal NK/T cell lymphoma. Virus Genes. 2007; (34): 47—54.
27. Walling D.M., Raab-Traub N. Epstein—Barr virus intrastrain recombination in oral hairy leukoplakia. J. Virol. 1994; 68(12): 7909—17.
28. Burrows J.M., Burrows S.R., Poulsen L.M. et al. Unusually high frequency of Epstein—Barr virus genetic variants in Papua New Guinea that can escape cytotoxic T-cell recognition: implications for virus evolution. J. Virol. 1996; 70(4): 2490—6.
REFERENCES
1. Young L.S., Rickinson A.B. Epstein—Barr virus: 40 years on. Nat. Rev. Cancer. 2004; 4(10): 757—68.
2. Kaye K., Izumi K., Kieff E. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B-lymphocyte growth transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; (90): 9150—4.
3. Mainou B.A., Raab-Traub N. LMP1 strain variants: biological and molecular properties. J. Virol. 2006; (80): 6458—68.
4. Fielding C.A., Sandvej K., Mehl A. et al. Epstein—Barr virus LMP-1 natural sequence variants differ in their potential to activate cellular signaling pathways. J. Virol. 2001; 75(19): 9129—41.
5. Johnson R.J., Stack M., Hazlewood S.A. et al. The 30-base-pair deletion in chinese variants of the Epstein—Barr virus LMP1 gene is not the major effector of functional differences between variant LMP1 genes in human lymphocytes. J. Virol. 1998; 72(5): 4038—48.
6. Blake S.M., Eliopoulos A.G., Dawson C.W., Young L.S. The transmembrane domains of the EBV-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) variant Cao regulate enhanced signalling activity. Virology. 2001; 282: 278—87.
7. Baichwal V.R., Sudgen B. Transformation of Balb3T3 by the BNLF-1 gene of Epstein—Barr virus. Oncogene. 1988; 2(5): 461—7.
8. Knecht H., Bachmann E., Brousset P. et al. Deletions within the LMPl oncogene of Epstein—Barr virus are clustered in Hodg-kin's disease and identical to those observed in nasopharyngeal carcinoma. Blood. 1993; 82(10): 2937—42.
9. Cheung S.-T., Lo K.-W., Leung S. et al. Prevalence of LMP1 deletion variant of Epstein—Barr virus in nasopharyngeal carcinoma and gastric tumors in Hong Kong. Int. J. Cancer. 1996; 66: 711—20.
10. Dolcetti R., Zancai P., de Re V. et al. Epstein—Barr virus strains with latent membrane protein-1 deletions: prevalence in the Italian population and high association with human immunodeficiency virus-related Hodgkin's disease. Blood. 1997; 89: 1723—31.
11. Smirnova K.V., Diduk S.V., Gurtsevich V.E. Functional analysis
of Epstein-Barr virus latent membrane proteins (LMP1) in patients with limphoproliferative disorders. Biomed. Khim. 2011; 57(1): 114—26. (in Russian)
12. Senuyuta N., Yakovleva L., Goncharova E. et al. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 (LMP-1) polymorphism in nasopharyngeal carcinoma and other oral cavity tumors in Russia. J. Medical Virology. 2014; 86(2): 290—300.
13. Goncharova E.V., Senuyuta N.B., Smirnova K.V. et al. Epstein— Barr virus in Russia: infection of the population and analysis of the LMP1 gene variants in patients with EBV-associated pathologies and healthy individuals. Vopr. Virusology. 2015; 60(2); 11—7. (in Russian)
14. Edwards R., Seillier Moisewitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acids changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein—Barr virus strains. Virology. 1999; (261): 79—95.
15. Mainou B.A., Raab-Traub N. LMP1 strain variants: biological and molecular properties. J. Virol. 2006; 80(13): 6458—68.
16. Sandvej K., Gratama J.W., Munch M. et al. Sequence analysis of the Epstein—Barr virus (EBV) latent membrane protein-1 gene and promoter region: identification of 4 variants among wildtype EBV isolates. Blood. 1997; (90): 323—30.
17. Walling D., Shebib N., Weaver S. et al. The molecular epidemiology and evolution of Epstein—Barr virus: sequence variation and genetic recombination in the latent membrane protein-1 gene. J. Infect. Dis. 1997; (179): 763—74.
18. Sung N.S., Edwards R.H., Seillier-Moiseiwitsch F. et al. Ep-stein—Barr virus strain variation in nasopharyngeal carcinoma from the endemic and non-endemic regions of China. Int. J. Cancer. 1998; 76(2): 207—15.
19. Burt R.D., Vaughan T.L., Mcknight B. et al. Associations between human leukocyte antigen type and nasopharyngeal carcinoma in Caucasians in the United States. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996; 5(11): 879—87.
20. Hildesheim A., Apple R.J., Chen C.J. et al. Association of HLA class I and II alleles and extended haplotypes with nasopharyngeal carcinoma in Taiwan. J. Natl. Cancer Inst. 2002; 94(23): 1780—9.
21. Ward M.H., Pan W.H., Cheng Y.J. et al. Dietary exposure to ni-
ORIGINAL ARTIcLE
trite and nitrosamines and risk of nasopharyngeal carcinoma in Taiwan. Int. J. Cancer. 2000; 86(5): 603—9.
22. Vaughan T.L., Stewart P. A., Teschke K. et al. Occupational exposure to formaldehyde and wood dust and nasopharyngeal carcinoma. Occup. Environ. Med. 2000; 57(6): 376—84.
23. Davydov M.I., Aksel E.M. Statistics of malignancies in Russia and CIS countries in 2012. Moscow: RCRC publishing group; 2014. (in Russian)
24. Miller W.E., Edwards R.H., Walling D.M., Raab-Traub N. Sequence variation in the Epstein—Barr virus latent membrane protein. J. Gen. Virol. 1994; (75): 2729—40.
25. Li S.N., Chang Y.S., Liu S.T. Effect of a 10Aamino acid deletion on the oncogenic activity of latent membrane protein 1 of Epstein—Barr virus. Oncogene. 1996; (12): 2129—35.
26. Nagamine M., Takahara M., Kishibe K. et al. Sequence variations of Epstein—Barr virus LMP1 gene in nasal NK/T cell lymphoma. Virus Genes. 2007; (34): 47—54.
27. Walling D.M., Raab-Traub N. Epstein—Barr virus intrastrain recombination in oral hairy leukoplakia. J. Virol. 1994; 68(12): 7909—17.
28. Burrows J.M., Burrows S.R., Poulsen L.M. et al. Unusually high frequency of Epstein—Barr virus genetic variants in Papua New Guinea that can escape cytotoxic T-cell recognition: implications for virus evolution. J. Virol. 1996; 70(4): 2490—6.
Поступила 20.10.2017 Принята в печать 22.11.2017
Сведения об авторах:
Смирнова Ксения Валерьевна, и. о. зав. лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохин» Минздрава России; Дидук Сергей Васильевич, науч. сотр. лаб. вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло-хина Минздрава России; Гурцевич Владимир Эдуардович, вед. науч. сотр. лаб. вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.
