CC BY
17
6. Halliwell B., Rafter J., Jenner A. Health promotion by flavonoids, tocopherols, tocotrienols, and other phenols: direct or indirect effects? Antioxidants or not?//Am. J. Clin. Nutr. - 2005. - V. 81(suppl.) - P. 268S-276S.
7. Parkar S.G. Stevenson D.E., Skinner M.A. The potential influence of fruit polyphenols on colonic microflora //Int. J. Food Microbiol. - 2008. - V. 124 - P. 295-298.
8. Assessment of antioxidant activity of plant extracts using microbial test systems/ O. Oktyabrsky, G. Vyso-china, N. Muzyka, Z. Samoilova, T. Kukushkina, G. Smirnova//J. Appl. Microbiol. - 2009. - V. 106. - P. 1175-1183.
9. Evaluation of antioxidant properties of medicinal plants using microbial test systems/ G.V. Smirnova, G.I. Vysochina, N.G. Muzyka, Z.Y. Samoylova, T.A. Kukushkina, O.N. Oktyabrsky// World J. Microbiol. Bio-technol. - 2010. - V. 26 - P. 2269-2276.
10. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress / G.V. Smirnova, Z.Y. Samoylova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky//Free Radic. Biol. Med. - 2009. - V. 46 - P. 759-768.
11. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics/ M.A. Kohanski, D.J. Dwyer, B. Hayete, C.A. Lawrence, J.J. Collins//Cell.- 2007.- V. 130 - P. 797-810.
12. Wang X., Zhao X. Contribution of oxidative damage to antimicrobial lethality//Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - V. 53 - P. 1395-1402.
13. Smirnova G., Samoilova Z., Muzyka N., Oktyabrsky O. Influence of plant polyphenols and medicinal plant extracts on antibiotic susceptibility of Escherichia coli// J. Appl. Microbiol. - 2012. - V.113 - P.192-199.
14. Kaplan J. B. Antibiotic-induced biofilm formation//Int. J. Artif. Organs - 2011. - V. 34 - P. 737-751.
СТРУКТУРНАЯ ЦЕЛОСТНОСТЬ ГЕНОМА НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ОБРАЗОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ СЕТЕЙ
Артюхов Валерий Григорьевич
Профессор, доктор биологических наук, кафедра биофизики и биотехнологии ВГУ,г.Воронеж
Колтаков Игорь Александрович Доцент, кандидат биологических наук, кафедра биофизики и биотехнологии ВГУ,г.Воронеж
Шилова Елена Васильевна Аспирант, кафедра биофизики и биотехнологии ВГУ,г.Воронеж
Шилов Сергей Владимирович Аспирант, кафедра биофизики и биотехнологии ВГУ,г.Воронеж
Одним из важнейших механизмов иммунной защиты является образование нейтрофильными гранулоци-тами внеклеточных ловушек. Этот процесс представляет собой деконденсацию хроматина с последующим выходом из клетки при стимулировании различными факторами (в частности, ^в, ФМА, латекс, микроорганизмы) [1]. Этот процесс получил название «нетоз»[6]. В состав нейтрофильных внеклеточных ловушек входит ДНК нейтрофилов, гистоны, содержимое специфических гранул нейтрофилов. Данная система позволяет эффективно адсорбировать на своей поверхности микроорганизмы и уничтожать их [1]. В то же время многочисленные иссле-дования[2-5, 7-9] показывают, что нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) участвуют в развитии большого числа заболеваний иммунной и аутоиммунной этиологии. Знания о механизмах нетоза могут быть использованы при лечении патологических состояний различного характера.
Нами были проведены исследования, направленные на изучение изменений в структуре генома нейтрофи-лов в процессе образования внеклеточных ловушек. (ВЛ) В ходе исследований выделение нейтрофилов из гепаринизированной донорской крови осуществляли методом седиментации на двойном градиенте плотности фи-колл-урографина (р1=1,119г/см3, р2=1,077г/см3). Жизнеспособность нейтрофилов определяли в тесте с трипановым синим. В работе использовались суспензии клеток с жизнеспособностью не менее 95%. Облучение нейтрофилов проводили в термостатируемой (20±1 С) кювете полусферической формы (площадь облучаемой поверхности составила 10-3м2 ) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки типа ММ-3М
светом ртутно-кварцевой лампы ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания в области 240-390 нм. В работе использовали дозы облучения 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2.Инициацию образования нейтрофильных внеклеточных ловушек полиморфно-ядерными лейкоцитами запускали, инкубируя суспензию клеток с латексом в течение 30 мин. при 1=37 °С.Нами была использована концентрация активатора 5 • 109 частиц/мл, что соответствовало соотношению латекс:клетки - 20:1. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью комплекта для выделения ДНК из клинического материала «ДНК ПРОБА-ГС».
Электрофоретическое разделение её макромалекул осуществляли в 1% агарозном геле.
На первом этапе проводились исследования, направленные на выявление изменений морфологии нейтрофильных гранулоцитов в процессе нетоза. Было установлено, что в контрольных образцах клеточных суспензий ДНК не выделялась во внеклеточную среду. При стимулировании клеток к образованию внеклеточных ловушек латексом происходило выделение в инкубационную среду нуклеиновых кислот, которые двигались в геле одним фронтом, смещаясь от точки нанесения на 2 мм, что соответствует высокомолекулярной ДНК (рис.1). Не наблюдалось ни характерной для апоптоза «апоптотиче-ской лестницы», ни наблюдаемой при некрозе размытой дорожки. Таким образом, мы показали, что при стимуляции нейтрофилов частицами латекса происходит образование именно нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Рис.1. Электрофореграмма ДНК, выделяемой во внеклеточную среду нейтрофилами при стимуляции к образованию ВЛ. Обозначения: 1 - краситель бромтимоловый синий, 2 - ДНК НВЛ, 3 - маркеры длины ДНК, 4 - лунки; а) дорожка с маркерами длины ДНК,
б)дорожка с ДНК НВЛ
В связи с наличием данных литературы о разностороннем действии УФ-света на биологические системы, и,
в частности, на компоненты иммунной защиты организма
%
человека, особый интерес представляет изучение влияния УФ-света на процессы образования и функционирования
нейтрофильных внеклеточных ловушек.
90 80 70 60 50 40 30 20 10 О
151 453 906 1359
Доза облучения, Дж/м"
Рис.2. Динамика изменения числа клеток, образующих НВЛ в нативном состоянии и при облучении
УФ-светом в дозах 151 - 1359 Дж/м2
Исследования были проведены на изолированных нейтрофилах. После УФ-модификации суспензии клеток инкубировали с частицами латекса в концентрации 5 • 109 частиц/мл в течение 30 мин. для стимулирования образования НВЛ.
Было установлено, что при стимулировании ин-тактных нейтрофилов латексом 80% клеток образовывали внеклеточные ловушки.(Рис.2) УФ-излучение в дозах 151, 453 и 906 Дж/м2 оказывает иммунодепрессивное действие на способность нейтрофилов образовывать НВЛ. При подсчёте 100 клеток нами не было обнаружено образования внеклеточных сетей. При увеличении дозы облучения до
1359 Дж/м2 нейтрофилы образовывали единую ловушку, существенно превосходящую по размерам ловушки, образованные одной клеткой, при чём данный эффект сохранялся у всех проанализированных нами образцов.
Таким образом, определённый интерес представляет изучение воздействия УФ-света на структурную целостность нуклеиновых кислот, выделенных во внеклеточную среду после стимуляции к образованию внеклеточных ловушек.
Было установлено, что молекулярная масса нуклеиновых кислот, входящих в состав внеклеточных ловушек, составляет около 10 000 п.н. и более. (Рис.3).
Рис.3. Электрофореграмма нуклеиновых кислот, выделенных нейтрофилами периферической крови человека после стимуляции к образованию внеклеточных ловушек. Обозначения: 1 - контроль, 2 - облучение в дозе 151 Дж/м2, 3 - облучение в дозе 453 Дж/м2, 4 - облучение в дозе 906Дж/м2, 5 - облучение в дозе 1359Дж/м2,
6 - маркер молекулярной массы ДНК
Проведённый анализ интенсивности свечения полос на электрофореграмме показал, что при облучении в дозах 151 Дж/м2- 453 Дж/м2, 906 Дж/м2 и 1359 Дж/м2
интенсивность его снижается на 26, 14, 41 и 7 % соответственно (рис. 4),
что говорит о снижении концентрации НВЛ при отсутствии фрагментации ДНК
151
453
906
Доза облучения, Дж/м2
1359
0,00 -0,05 -0,10 -0,15 -0,20 -0,25 -0,30 -0,35 -0,40 -0,45 -0,50
Рис.4. Количество ДНК, выделенной во внеклеточную среду нейтрофилами, стимулированными к образованию внеклеточных ловушек после УФ-облучения
Таким образом, нами было установлено, что при образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек происходит частичное разрушение нуклеиновых кислот на высокомолекулярные фрагменты с молекулярной массой от 10 000 до 12 000 п.н. Фотомодификация исследуемых клеток УФ-светом во всем используемом диапазоне доз не приводила к статистически достоверным изменениям массы ДНК, однако, зарегистрированное нами снижение интенсивности флюоресценции электрофоретических фракций свидетельствует об ингибировании процессов образования внеклеточных ловушек нейтрофилами при их стимуляции.
Следовательно, можно предположить, что имму-нодепрессивное действие УФ-облучения в отношении образования внеклеточных ловушек, по всей видимости, связано с фотоиндуцированным образованием «сшивок»
молекул нуклеиновых кислот с белками, что препятствует их свободному выходу из нейтрофильных клеток.
Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», (кратко -ФЦП ИР14-20) соглашение № 14.593.21.0001, SPIN 90306599, 4087-9022, 2489-1234, с использованием оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета.
Список литературы:
1. Brinkmann V., U. Reichard, C. Goosmann, B. Fauler, Y. Uhlemann, D. S. Weiss, Y. Weinrauch, and A. Zych-linsky. 2004. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science 303: 1532-1535.
2. Cools-Lartigue J., Spicer J., McDonald B., Gowing S., Chow S., Giannias B., Bourdeau F., Kubes P., Ferri L. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. 2013;123(8):3446-3458. doi:10.1172/JCI67484.
3. Delbosc, S., J.M. Alsac, C. Journe, L. Louedec, Y. Castier, M. Bonnaure Mallet, R. Ruimy, P. Rossignol, P. Bouchard, J.B. Michel, and O. Meilhac. 2011. Por-phyromonas gingivalis participates in pathogenesis of human abdominal aortic aneurysm by neutrophil activation. Proof of concept in rats. PLoS ONE. 6:e18679.
4. Demers M., Krause D. S., Schatzberg D., Martinod K., Voorhees J. R., Fuchs T. A., et al. (2012).Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 13076-13081 10.1073/pnas.1200419109
5. Dwivedi, N., J. Upadhyay, I. Neeli, S. Khan, D. Pat-tanaik, L. Myers, K. A. Kirou, B. Hellmich, B. Knuck-ley, P. R. Thompson, et al. 2011. Felty's syndrome auto- antibodies bind to deiminated histones and neu-trophil extracellular traps. Arthritis Rheum. 64: 982992.
6. Fuchs, T.A., U. Abed, C. Goosmann, R. Hurwitz, I. Schulze, V. Wahn, Y. Weinrauch, V. Brinkmann, and A. Zychlinsky. 2007. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176:231241.
7. Fuchs, T.A., A. Brill, D. Duerschmied, D. Schatzberg, M. Monestier, D.D. Myers Jr., S.K. Wrobleski, T.W. Wakefield, J.H. Hartwig, and D.D. Wagner. 2010. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107:15880-15885.
8. Gupta, A.K., M.B. Joshi, M. Philippova, P. Erne, P. Hasler, S. Hahn, and T.J. Resink. 2010. Activated en-dothelial cells induce neutrophil extracellullar traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584:3193-3197.
9. Hakkim, A., B. G. Fürnrohr, K. Amann, B. Laube, U. A. Abed, V. Brinkmann, M. Herrmann, R. E. Voll, and A. Zychlinsky. 2010. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 9813-9818.
ВЛИЯНИЕ АВТОТРАНСПОРТА НА СОСТОЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНОСТИ СОПРЕДЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ
Маврин Геннадий Витальевич
Канд. хим. наук, доцент, зав. кафедрой химии и экологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Набережные Челны Сиппель Ирина Яковлевна
Канд. хим. наук, доцент кафедры химии и экологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Набережные Челны Мансурова Айгуль Индусовна
Младший научный сотрудник ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Набережные Челны
Автомобильный транспорт является одним из основных источников загрязнения окружающей природной среды. В городе Набережные Челны выбросы загрязняющих веществ от автотранспорта составили в 2013 году 65,1 % от суммарных выбросов в атмосферу; в 2012 году этот показатель был равен 69,5 % [1]. Отработавшие газы автомобильных двигателей, содержащие десятки токсичных веществ, оказывают негативное воздействие на растительность придорожной полосы. В долгосрочной перспективе оно сказывается в уменьшении сроков жизни древостоя. В период вегетации проявляется на морфологических признаках листьев деревьев вблизи городских транспортных магистралей. В биохимическом плане отражается на содержании витамина В2 - рибофлавина в зелёной массе деревьев.
На сегодняшний день одним из эффективных и недорогих методов биомониторинга является фитоиндика-ция, так как растения считаются надежными индикаторами загрязнения природной среды различными токсическими веществами. Они вынуждены адаптироваться к стрессовому воздействию среды с помощью фи-зиолого-биохимических и анатомо-морфологических перестроек организма. Фиксация и оценка этих изменений, которые могут регистрироваться уже на самых ранних стадиях деградации, дают достоверную картину условий места произрастания растений и отражают состояние городской среды.
Одним из методов биоиндикации антропогенной нагрузки является определение интегрального показателя флуктуирующей асимметрии ассимиляционного аппарата многолетних древесных растений в качестве критерия стабильности их развития [2]. Под флуктуирующей асимметрией (ФА) понимается незначительные и случайные отклонения от строгой билатеральной симметрии биообъектов. Выбор многолетних древесных растений в качестве объекта исследования связан с рядом причин. Во-первых, у древесных форм растений ежегодно формируются листья, во-вторых, многие виды имеют повсеместное распространение и четко выраженные признаки, что позволяет проводить постоянный мониторинг. Принцип исследования стабильности развития по показателю флуктуирующей асимметрии основан на нарушении симметрии листовой пластины у древесных форм растений под воздействием антропогенных факторов. [3]
Загрязняющие почву и воздух вредные вещества ухудшают рост и оказывают токсическое действие на развитие растений. Ответная реакция растений проявляется также в изменении содержания в них группы веществ, которые относят к витаминам, например рибофлавина (водорастворимый витамин В2). Данные по количественному содержанию рибофлавина могут быть использованы при мониторинге окружающей среды для полного понимания физиолого-экологического состояния растительных организмов, особенно при действии экологических стрессов. [4]
