CC BY
13УДК 577.2:575:582.632.1
П. С. Кирьянов, О. Ю. Баранов
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ 18S И 28S РИБОСОМНОЙ
РНК КАРЕЛЬСКОЙ БЕРЕЗЫ
Тосударственное научное учреждение «Институт леса Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 246050, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: PKirjanov@yandex.ru
В статье представлены результаты секвенирования генов 18S и 28S рибосомной РНК карельской березы и их транскриптов. Показано, что их организация и первичная структура являются сходными с Betulaceae. Сравнительный анализ множественных прочтений позволил идентифицировать нуклеотидный полиморфизм среди копий генов в пределах индивидуального дерева карельской березы. В ходе сравнительного анализа первичных структур генов 18S и 28S рибосомной РНК Betulapendula var. carelica иArabidopsis thaliana охарактеризованы особенности нуклеотидных различий между таксонами.
Ключевые слова: гены рибосомной РНК, высокопроизводительное секвенирование, карельская береза, нуклеотидный полиморфизм.
Введение
Карельская береза (Betulapendula Roth. var. carelica Mercl.), согласно текущему систематическому статусу, представляет собой разновидность березы повислой (2n = 28), характерной особенностью которой является наличие узорчатой текстуры древесины. Происхождение «узорчатого» фенотипа обусловлено протеканием процессов аномального ксило-генеза, выражающихся в изменении пространственной ориентации проводящих сосудистых элементов и повышенной паренхиматизации тканей [1]. В то же время использование данной морфолого-анатомической аномалии в качестве единственного таксономического критерия сопряжено с рядом противоречий, поскольку аналогичный тип текстуры древесины может встречаться и у близкородственного ей тетраплоидного (4n = 56) вида — березы пушистой (B. pubescens Ehrh.), а также у три-плоидных растений (3n = 42), представляющих собой, как правило, межвидовые гибриды B. pendulaх pubescens [2]. Кроме того, следует отметить, что узорчатость древесины является количественным признаком, проявление которого имеет приуроченность к определенным габитуальным формам деревьев [3]. Наследственные основы предрасположенности к аномальному ксилогенезу до конца остаются невыясненными, однако, как отмечает
большинство исследователей, они имеют комплексную природу, включая эпигенетические механизмы и взаимодействие неаллельных генов [4, 5]. Остаются открытыми вопросы и о происхождении и систематическом положении карельской березы [6]. Среди представленных к обсуждению гипотез появления карельской березы, на наш взгляд, следует особо выделить гибридогенную, объясняющую генез B. pendula var. carelica путем ин-трогрессии предковых видов берез или за счет интерградации аллопаторических популяций B. pendula [5]. В пользу данной гипотезы могут свидетельствовать полученные нами ранее молекулярно-генетические данные, указывающие на наличие прямой зависимости степени проявления узорчатости древесины от уровня наблюдаемой гетерозиготности по ряду ло-кусов ядерного генома [7]. В то же время для подтверждения гибридогенной гипотезы необходим поиск дополнительных наследственных признаков и детерминант, характеризующихся высокой степенью информативности применительно к филогенетическим исследованиям.
Гены рибосомной ДНК являются одним из наиболее изученных участков генома у различных живых организмов [8]. С одной стороны, это обусловлено их высокой представленностью как в наследственном аппарате клетки, вследствие высокой степени их копий-
ности, формирования множественных рДНК-содержащих экстрахромосомных фрагментов, наибольшего удельного веса в транскрипто-ме (85-98%), так и рядом структурно-функциональных особенностей, определяющих их значимость в качестве молекулярно-гене-тических маркеров для проведения не только филогенетических и таксономических, но и физиологических исследований (включая анализ процессов деления и дифференциации клеток) [9].
Характерной чертой генов рДНК является их высокая степень консерватизма в пределах видовых таксонов, наличие устойчивых дискретных различий на надвидовом уровне, единообразие нуклеотидной структуры и согласованность филогенетических преобразований в пределах региона тандемно повторяющихся копий [8].
До последнего времени локусы рДНК являлись одними из распространенных маркеров для проведения видовой идентификации живых организмов, что послужило значительному накоплению данных о нуклеотидных последовательностях различных представителей прокариот и эукариот [10, 11]. В то же время, несмотря на высокую информативность данных генетических маркеров, накопление у них дискретных молекулярных отличий в ходе видообразования происходит значительно медленнее по сравнению с процессами формирования репродуктивного барьера или возникновением систематически значимых морфолого-анатомических, физиологических, кариотипических и других особенностей [12, 13]. На наш взгляд, несоответствие между молекулярно-генетическими и фено-типическими (структурными или функциональными) данными в случае анализа близкородственных таксонов, по всей видимости, отражает не противоречие данных критериев, а указывает на необходимость пересмотра существующей концепции вида и актуализации вопросов, связанных с видообразованием [14]. Так, например, согласно современной эволюционной концепции, заключительной стадией видообразования является формирование репродуктивного барьера, затрудняющего обмен генетической информацией между возникшими таксонами, что впоследствии способно усиливать процессы межвидовой диф-
ференциации [15]. В то же время в качестве основы репродуктивной изоляции зачастую выступает ограниченное число морфофизи-ологических или цитологических различий, действия которых может быть нивелировано при воздействии ряда сторонних факторов -мейотические нарушения при гаметогенезе способны обеспечивать скрещивание видов с различным уровнем плоидности или определять частичную фертильность их гибридов; колебания климатических факторов позволяют устранять фенологические различия; изменение гормонального статуса в генеративных органах делает возможным прорастание чужеродных пыльцевых зерен и протекание процессов сингамии и т. д. [16]. Кроме того, гибридные особи могут быть получены и искусственными способами — за счет направленного оплодотворения в условиях in vivo и in vitro или путем слияния протопластов соматических клеток на основании использования различных биотехнологических подходов [17]. В то же время, несмотря на возможность достижения стадии оплодотворения, несоответствие между видами по ряду признаков и свойств, относящихся к основным клеточным процессам (репликации, транскрипции, трансляции, первичному метаболизму и др.) делают невозможным получение жизнеспособных гибридных форм [18].
Несмотря на широкую изученность рДНК у различных растительных видов, установление первичной структуры транскрибируемых и нетранскрибируемых последовательностей применительно к Betula spp. (в т. ч. и B. pendula var. carelica) до настоящего времени было выполнено (за исключением B. platyphylla) только для внутренних спейсе-ров ITS1 и ITS2 и гена 5,8S РНК, составляющих менее 10% от размера всего оперона [19]. Также не были проведены оценка существующих генетических вариаций среди различных копий генов рДНК и анализ выявляемых так-соноспецифичных SNP (однонуклеотидных полиморфизмов) в пределах Betula. Отсутствие экспериментальных данных о нукле-отидной последовательности и структурной организации генов 18S и 28S рРНК B. pendula var. carelica ограничивают возможность их использования в качестве потенциальных маркеров для проведения филогенетических
исследований и выявление ассоциаций с процессами аномального ксилогенеза.
Исходя из всего вышесказанного, цель данной работы — охарактеризовать структурную организацию генов 18S и 28S рибосомной РНК карельской березы, провести сравнительный анализ исходных генов и их транскриптов на предмет поиска модификаций рРНК в ходе процессинга, изучить нуклеотидные вариаций копий тандемных повторов и оценить уровень генетической дифференциации по отношению к близкородственным таксонам.
Материалы и методы
Экспериментальный материал для проведения молекулярно-генетических исследований был собран на опытной плантации клонированных растений карельской березы (выд. 8 кв. 43 Зябровского лесничества Кореневской экспериментальной лесной базы Института леса НАН Беларуси, площадь — 0,32 га, год создания — 2008). Дополнительно для проведения сравнительного анализа был собран материал в расположенных рядом лесных культурах березы повислой. Общее число деревьев составило: 10 шт. — карельская береза, 10 шт. — береза повислая. Экспериментальный материал представлял собой фрагменты (70 см) ствола дерева или ветвей первого порядка, содержащих не менее одного узлового сегмента (основная зона протекания процессов аномального ксилогенеза) и двух междоузлий. В лабораторных условиях свежесобранные осевые органы каждого дерева
Рис. 1. Фрагменты препарированных и нативных образцов осевых побегов березы повислой (вверху) и карельской березы (внизу)
фрагментировали на участки, содержащие по отдельности узел и междоузлие, из которых затем удалялись ткани филлемы и флоэмы и приготавливались образцы соскобов, содержащих биологический материал камбия и наружного слоя ксилемы (рис. 1). Далее образцы (40 шт.) соскобов после соответствующей пробопод-готовки использовались для получения по отдельности препаратов суммарной ДНК и РНК (кДНК) согласно протоколам, представленным в работах [20-22].
Для всех образцов ДНК и кДНК (80 шт.), с использованием набора универсальных прай-меров PNS1 и ITS2, 5,8SR и revLR12R, были получены ампликоны, содержащие гены 18S и 28S рРНК [23]. Последующий анализ ампли-конов осуществлялся путем фрагментарного (600-800 н. о.) секвенирования (по методу Сэнгера) регионов генов c применением дополнительных праймеров SR7, SR2, SR10R, NS6 и LR3R, LR7, R LR10R [23] на платформе Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколам, рекомендуемым компанией-изготовителем. Четыре образца кДНК, полученные от двух деревьев ((береза повислая (узел), береза повислая (междоузлие), карельская береза (узел), карельская береза (междоузлие)), были использованы для создания транскрип-томных библиотек и их дальнейшего высокопроизводительного секвенирования базе Ion PGM Torrent System (Thermo Fisher Scientific, США). Первоначальную обработку данных, поступающих от Ion PGM Torrent System, осуществляли в автоматическом режиме при помощи программного обеспечения Torrent Suite v. 5.8 (Thermo Scientific, США). De novo сборку секвенированных последовательностей выполняли с помощью программного обеспечения Unipro UGENE v. 1.29.0. Выравнивание последовательностей и анализ нуклеотидного состава генов осуществляли с применением программы CLC Sequence Viewer v.6. Выявление и картирование структурных доменов выполняли с помощью онлайн сервиса MAFFT v.7. на основании сопоставления результатов сборки с различными последовательностями генов 18S и 28S рРНК эукариотических (установление вариабельных регионов (V)), 16S и 23S рРНК прокариотических (идентификация сегментов экспансии (ES)) организмов, представленных в
NCBI GenBank. Проведение генетико-таксоно-мического анализа и построение дендрограмм осуществляли с помощью онлайн сервиса NCBI nucleotide BLAST. Создание и анализ 2D моделей рРНК выполняли на основании онлайн платформы Mfold Web Server.
Результаты и обсуждение
В ходе de novo сборки последовательностей, полученных в результате секвенирова-ния ампликонов, для всех исследованных образцов были получены первичные структуры генов 18S (1809 н. о.) и 28S (3397 н. о.) рРНК. Проведенный сравнительный анализ каждого из генов выявил идентичность их структур между всеми изученными деревьями B. pendula var. carelica и B. pendula. Выравнивание последовательностей, полученных для препаратов ДНК и кДНК, также показало их идентичность, что указывает на отсутствие выраженных процессов модификации первичных структур транскриптов генов 18S и 28S рРНК в ходе процессинга. Исходя из полученных результатов, в дальнейших исследованиях были использована только B. pendula var. carelica. Нуклеотидные последовательности генов были задепонирова-ны в международной базе данных GeneBank NCBI (номера записей MT122805 (18S рРНК) и MT122799 (28S рРНК)) [19].
Нуклеотидный состав гена 18S рРНК был следующим (плюсовая цепь): А — 24,8%, Ц — 22,2%, Г — 27,6%, Т — 25,5%, ГЦ — 49,8%. Распределение участков с повышенным содержанием АТ/ГЦ оснований носило дисперсно-кластерный характер (рис. 2). Доменная структура гена включала восемь вариабельных регионов (V(18)) и 12 сегментов
экспансии (ESS(1-12)), что является аналогичным другим растительными и грибным организмам [24, 25].
Долевое участие нуклеотидных оснований в гене 28S рРНК (плюсовая цепь) составило: А — 23,2%, Ц — 25,1%, Г — 31,9%, Т — 19,8%, ГЦ — 56,9%. Распределение регионов с повышенным содержанием АТ/ГЦ оснований, как и в случае гена 18S РНК, также носило дисперсно-кластерный характер (рис. 2). В структуре гена 28S РНК было выявлено наличие 41 сегмента экспансии (ESL(1-41)), расположение и общее число которых было также в целом сходным c другими эукариотическими организмами грибного и растительного происхождения [26].
В результате de novo сборки прочтений для каждой из четырех кДНК библиотек берез было получено от 28 до 32 тысяч последовательностей разной длины и уровня прочтения, в которых были идентифицированы транскрипты генов18S и 28S рРНК. Анализ структурных различий, выявляемых между прочтениями (отражают первичную структуру отдельных копий генов) показал, что они представлены в основном мононуклеотидны-ми заменами и делециями (рис. 3). При этом встречаемость замен среди копий генов 18S и 28S РНК B. pendula var. carelica была сходной и составляла в среднем каждые 3,64 и 3,68 позиций на 100 нуклеотидов соответственно с представленностью 1,66% и 1,72% от общего числа прочтений. Аналогичные результаты были получены и для B. pendula. В то же время, исходя из того факта, что у древесных растений области рДНК расположены в нескольких группах сцепления (хромосомах), данные об изменчивости, выявляемой при
Рис. 2. Графическое изображение распределения ГЦ-насыщенных регионов для генов 18S (слева) и 28S (справа)
рРНК карельской березы
сопоставлении последовательностей прочтений, могут относиться как к одному кластеру, так и к различным [27]. В ряде случаев представленность последовательностей прочтений, содержащих альтернативные варианты, составляла порядка 30%, что также может быть связано с гетерогенностью копий внутри кластера или различиями, выявляемыми между регионами гомологичных или негомологичных хромосом.
Анализ последовательностей генов 18S и 28S рРНК карельской березы в международной базе данных NCBI GeneBank показал, что наибольшим уровнем сходства с ними, помимо ВеШа spp., характеризовались виды близкородственного рода А1пш Ь. (Ольха) [19]. При этом различия по гену 18S рРНК в пределах ВеШа отсутствовали, а уровень генетической дифференциации (р) для обоих генов в случае сравнения с разными видами ольх не превысил 0,6% (рис. 4). Детальный анализ диагностируемых различий между таксонами ВеШа и Alnus показал, что они носят в основном родоспецифический характер и представляют собой нуклеотидные замены (10 SNPs для гена 188 РНК, 16 — для гена 28S РНК), не приводящие к изменению размера генов.
Кроме рассмотрения общего уровня дифференциации, используемого, как правило, в качестве основного критерия для оценки гене-тико-таксомических взаимоотношений, в ходе исследований был дополнительно изучен и непосредственно характер выявляемых нукле-отидных различий. Согласно литературным данным, одним из предполагаемых механизмов формирования молекулярных видоспе-цифических признаков, является оптимизация (путем отбора) термодинамической или функциональной структуры ДНК применительно к текущей биологической системе или ее отдельным элементам [28]. Также особенности строения ферментов (или их комплексов) системы репликации у того или иного вида могут определять предпочтительность возникновения наследственных изменений определенного характера [28].
В качестве молекулярных маркеров для проведения исследований в данной области, на наш взгляд, в наибольшей степени подходят гены рибосомной ДНК, информативность которых обусловлена сочетанием в себе преимуществ как белок-кодирующих генов (относительная консервативность, сопряженность с базовыми процессами в клетке), так и не-
б О А А Т т б А С б б А А б б б С А с с А С с А 6 б А б т б б А б С с т б с 6 б с т т А А Т б А с с с А А С А С б б б 6 А А А с т т А сс
б 6 А А т т б А С б б А А б б б С А С с А С с А б б А б т б б А б С с т 6 с б ест т А А Т б А с т с А А с А С с б б б А А А с т т А с с
б б А А т т б А С б б А А б б 6 С б с с А С с А б б А б т б б А б с С т б с б б с т Т А А т б А с с с А А С А с с б б б А А А с т р А с с
б б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б б с т Т А А т б А с с с А А с А с с б б б А А А С " А с е
с с А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б б с т Т А А т б А с с с А А с А с б б б б А А А с т т А с С
б с А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с с с А б б А б т б б А б с С Т б с б б А с с с А А с А с с б с 6 А А А С т т А с с
б с А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т 6 с б ест 1- А т б А с с с А А с А с с б б б А А А гс т т А с е
с 6 А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А 6 б А б т б б А б с С т 6 с б б А с с с А А с А с б с 6 А А А С - т А с с
с в А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б А б т б б А б с С Т О с б б С т Т А А т б А А А А с А с с б б б А А А с т т А с С
б 6 А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б А 6 т б б А б с с т б с 6 6 с т Т А А т б А А А с А с с б б б А А А с т т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т "с с б б С т Т А А т б А с с А А С А с с б б б А А А с т т А с с
б б А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с б б с т Т А А т б А с с с А А С А с 0 б б б А А А с т т А с с
с с А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с С - б с б б с т Т А А т б А с с с А А С А с с б б б А А А с т т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 'б с А с с А с с А б б А б т б б А б с С Т б с б б С т Т А А т б А с с с А А с А с е б б 6 А А А с т т А се
с- б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б 6 С т Т А А т б А с с с А А с А с А б б 6 А А А с т т А с с
б 6 А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б б т б б т б с с т 6 с б б с т Т А А т б А с с с А А С А с с б б б А А А С - т А с е
с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с б С С т Т А А т б А с с с А А с А с с б б 6 А А А С - т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т 6 с б б с т Т А А т б А с с с А А С А с б б б б А А А С - т А с с
с 6 А А т * б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т 6 с б ест Т А А т б А с т с А А С А с с б б 6 А А А с т т А с с
с б А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с С А с с А б б А б т б б А б с С Т б с б ест Т А А т б А с с с А А с А с с б б б А А А С т т А с с
с 6 А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с С А с с А 6 б А б т б б А б с с т б с б ест Т А А т б А с с с А А с А с с б б б А А А с т т А с с
6 б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А 9 с С т В с б ест Т А А т б А с с с А А с А с с б б 6 А А А С - т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 0 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б ест Т А А т б А с с с А А с А с б б б б А А А с т т А с с
б с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б е е т Т А А б А с с с А А с А с б б б 6 А А А С т т А с с
6 А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с 6 ест Т А А т б А с с с А А с А с с б б б А А А С ~ т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с б ест Т А А т б А с с с А А с А с б б б б А А А С - т А с с
б б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б ест Т А А т б А с с с А А С А с б б б б А А А С - т А с с
Б б А А т т б А с б 6 А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с 6 ест Т А А т б А с с с А А с А с б б б б А А А с т т А с с
с- б А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с б ест Т А А т б А С А А с А с е б б б А А А С т т А с с
б 6 А А т т б А с б 6 А А б б б с А с с А с с А 6 б А б т б б А б с с т 6 с 6 ест Т А А т б А с А А с А с с б б б А А А С - т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А 6 б А б т б б А б с С т 6 с б ест Т А А т б А с т с А А с А с б б А А А С - т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б т б б А б с с т б с б б А с с с А А с А с б б б с т т А с с
с б А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А 6 б А б т б б А б с с т с с 6 ест Т А А т б А с г с А А с А с с б б б А А А гс т т А С с
с 6 А А т т б А с б б А А б б б с А с с А с с А б б А б т б б А б с С т б с 6 ест Т А А т б А с т с А А с А с б б б 6 А А А с и тл и
б б А А т т б А с б б А А б б 6 с А с с А с с А б б А б - б б А б с С т 6 с б ест Т А А т б А с А с А А с А с = б б б А А А с т т А сс
Рис. 3. Выравнивание последовательностей прочтений транскрипта гена 188 РНК дерева карельской березы (ткани междоузлия), содержащих полиморфные нуклеотидные варианты (стрелкой отмечены позиции с высокой степенью представленностью 8КРб между прочтениями)
, Alnus maximowiczii(MF 136534.1) 'Alnus marítima subsp. otdahomensis(MF 136533.1) ^ Alnus marítima subsp. maritima(MF 136532.1) I Alnus marítima subsp. maritima(MF136531.1) | Alnus jorullensis subsp. jorullensis(MF136530.1) Alnus japonica(MF 136529.1) . Alnus ¡ncana(MF 136528.1) ! Alnus incana(MF 136527.1) ' Alnus glutinosa subsp. glutinosa(MF 136526.1 ) ^Betula péndula var. carelica(MTl 22805.1)
Betula platyphylla(MK3 88236.1)
18S РНК
( 100
100
I 0,001 |
Betula péndula var. carelica (MT122799.1) 97 p Alnus jorullensis subsp. jorullensis(MF 136530.1) Alnus¡ncana(MF136528.1) ' Alnus mcana(MF 136527.1) 1 Alnus glutinosa subsp. glutinosa(MFI36526.1) ' Alnus glutinosa subsp. glutinosa(MFI36525.l) Alnus glutinosa subsp. glutinosafMF 136524.1)
-1 Alnus glutinosa subsp. betuloides(MF136523.1)
Alnus glutinosa subsp. barbata(MF136522.!)
98 |- Alnus cordata(MFl 36521.1)
^— Alnus subcordata(MF 136538,1)
28S PHK
Рис. 4. Дендрограмма, иллюстрирующая степень генетической дифференциации ф), между БгШ1а spp. и А1пт spp. (в узлах ветвей приведены значения бутстрэпа, п = 100)
транслируемых последовательностей (отбору непосредственно подвержена первичная или вторичная структура дезоксирибонуклеино-вой кислоты или химически сходного с ней транскрипта, что в свою очередь определяется характером взаимодействия рРНК с ри-босомными белками, а также свойствами их комплексов) [8]. Для белок-кодирующих генов значительная часть отбора ориентирована на изменения в полипептидной цепи, которые в основном и являются фактором, определяющим вариации в структуре ДНК по принципу обратной связи, что определяет несоответствие между истинными мутационными событиями и вариациями, закрепляющимися в потомстве [29]. Изменчивость некодирующих участков ДНК отражает большую часть спектра мутационных изменений, однако анализ данных локусов ограничен только возможностью изучения близкородственных групп организмов вследствие низкой вероятности выявления ортологичных последовательностей среди дальнеродственных таксонов [30].
В качестве рабочей гипотезы было выдвинуто предположение, что изменения нуклео-тидных последовательностей генов 18S и 28S рРНК, характеризующихся сходным перечнем структурно-функциональных характеристик, должны протекать по аналогичному принципу. В поддержку данного предположения может выступать теория мутационного давления Суеоки, постулирующая предпочтительную направленность нуклеотидных изменений у той или иной таксономической группы [31]. В большинстве случаев у живых организмов выявлены два основных направления: GC- и АТ-давление, при этом
транзиции (A^G; Т^С) происходят чаще, чем трансверсии (А^С; G^T) [28]. С одной стороны, направленность изменений нукле-отидной цепи может определятся текущей последовательностью ДНК, характеризующейся определенными термодинамическими параметрами, и, как следствие, способностью образовывать специфические конформацион-ные структуры в одноцепочечной и спаренной форме, оказывающих влияние на взаимодействие с ферментативным комплексом репликационной вилки. С другой стороны, как было показано большим количеством исследований, таксоноспецифические особенности полипептидной структуры факторов репликации ДНК оказывают существенное влияние на формирования ошибок определенного характера [32-34]. При этом дополнительным моментом, усиливающим различия между таксонами, является наивысший уровень внутривидового консерватизма для генов, детерминирующих процессы репликации и транскрипции по сравнению с другими структурными и регуляторными генами [34]. Таким образом, установление закономерностей формирования структуры нуклеотидных последовательностей, включая выявление зависимости характера точечных мутаций от окружающего их нуклеотидного контекста, на наш взгляд, может явиться основой для разработки новых молекулярно-генетических подходов и критериев в таксономии и оценки процессов видообразования.
Исходя из филогенетически недавнего происхождения и соответственно низкого уровня генетических различий между БвШ1а и А1пт [35], использование их в качестве
модельных объектов для изучения закономерностей формирования нуклеотидных изменений генов рДНК является низкоинформативным (D < 0,6%). Вследствие этого нами для проведения сравнительного анализа было выбрано сочетание дальнеродственных таксонов Betula pendula var. carelica - Arabidopsis thaliana, степень генетической дифференциации между которыми была более значимой и составила 3% (55 замен) для гена 18S РНК, и 5% (170 замен) для гена 28S РНК. Кроме нуклеотидных замен, по результатам выравнивания последовательностей, было выявлено наличие 5 разрывов (gap) для гена 18S РНК, 18 разрывов — для гена 28S РНК. При этом разрывы выявлялись как у карельской березы, так и резуховидки Таля, что и обусловило относительно одинаковую длину сравниваемых ортологичных генов. Суммарная статистика мононуклеотидного полиморфизма, не связанного с делециями, инсерциями и комплексной перестройкой локальных регионов, приведена в таблице.
Как следует из таблицы, характер различий как в пределах каждого из генов, так и между ними не являлся произвольным, а имел определенную направленность. Так, наименьшая способность к замещению была выявлена для позиций карельской березы, содержащих
А-нуклеотид: 1 на 301,5 оснований (18S) и 1 на 147,7 оснований (28S). В то же время для других типов позиций данная величина была ниже и составила для Г-нуклеотида — 226,1 и 89,4, T — 120,6 и 94,4, Ц — 100,5 и 70,8 соответственно. Наименьший уровень различий, связанный с транзициями, также отмечен для А-нуклеотида — 33,3% (18S) и 47,8% (28S). Несколько большее число тран-зиций установлено для Т — 66,7% и 55,6%. Г^А замены были более выражены в гене 18S РНК (87,5%), чем в 28S РНК (52,6%). Наивысшая доля транзиций была установлена для Ц-нуклеотида — 88,8% и 77,0%.
Однако в целом анализ полученных данных о типах и представленности нуклеотидных отличий указывает на определенную ком-пенсаторность замен в модельной системе B. pendula var. carelica - A. thaliana, что и определило относительное постоянство соотношения вариантов азотистых оснований в рДНК между таксонами. Так, первичная структура генов рДНК A. thaliana только незначительно (в среднем не более 2% в относительных единицах) отличалась от B. pendula var. carelica и составила: для 18S РНК - А (25,1%), Ц (21,8%), Г (27,4%), Т (25,7%), ГЦ (49,3%); гена 28S РНК - А (23,6%), Ц (24,5%), Г (31,4%), Т (20,5%), ГЦ (55,9%) [19].
Таблица
Распределение альтернативных нуклеотидных вариантов A. thaliana по отношению к аналогичным позициям B. pendula var. carelica (в абсолютном исчислении)
Нуклеотидные основания B. pendula var. carelica Нуклеотидные основания A. thaliana
А Т Г Ц
А - 1 (1/0) 2 (1/1) 3 (3/0)
Т 3 (2/1) - 2 (2/0) 10 (6/4)
Г 7 (3/4) 0 (0/0) - 1 (1/0)
Ц 1 (1/0) 16 (11/5) 1 (0/1) -
А - 5 (4/1) 11 (5/6) 7 (6/1)
Т 10 (8/2) - 6 (4/2) 20 (16/4)
Г 20 (14/6) 15 (14/1) - 3 (2/1)
Ц 8 (8/0) 37 (31/6) 3 (3/0) -
Примечание. В скобках приведены данные соотношения локализации замен в составе олигонуклеотидных последовательностей (формирующих/не формирующих) вторичную структуру
Проведенный сравнительный анализ оли-гонуклеотидных последовательностей, содержащих альтернативные типы оснований у B. pendula var. carelica и A. thaliana показал, что прямая взаимосвязь между выявляемыми нуклеотидными вариантами и особенностями структуры фланкирующего контекста отсутствует. Также не была выявлена зависимость от химических особенностей оснований (пу-риновые, пиримидиновые), числа водородных связей и характера их расположения в последовательности контекста.
Среди факторов, относящихся к особенностям структуры ДНК, оказывающих влияние на точность процессов репликации, способность к образованию вторичной структуры играет значимую роль [32]. Построение 2D пространственных моделей с помощью специализированного программного обеспечения показало, что 65,9% (18S) и 79,3% (28S) из проанализированных олигонуклеотидных последовательностей, содержащих видоспеци-фические SNP, способны формировать спарен-
ные структуры в одноцепочечном состоянии (табл., рис. 5). В то же время, теоретически рассчитанное число нуклеотидных комбинаций с образованием устойчивых конфор-маций (с тремя и более связями) для изученных олигомерных последовательностей было меньшим и составляло порядка -25% от всех возможных типов сочетаний, что указывает на наличие более высокого уровеня межвидовых изменений в регионах, способных к формированию вторичной структуры.
Как видно из рисунка 5, вариабельные нукле-отидные позиции были расположены в шпиле-видных конформациях как в спаренном, так и неспаренном состоянии. Проведенный анализ более длинных последовательностей показал, что, несмотря на формируемые таксономические отличия, в целом центр симметрии самокомплиментарных последовательностей сохранялся, что может свидетельствовать об определенном влиянии вторичной структуры макромолекулы на характер и локализацию типов нуклеотидных изменений (рис. 6) [36].
Рис. 5. Схематическое изображение вариантов вторичной структуры олигонуклеотидных последовательностей гена 18S РНК B. pendula var. carelica (нуклеотидные позиции, характеризующуюся наличием альтернативных
типов оснований у A. thaliana, обведены окружностью)
Карельская береза
CGTaTATTTAAGTTGTTGCAGTTAaAAAGCTCGTAi3TTGGA|CTTGGG|TGGGCAG^CGGTCCGCCfllGGTGTGCACCGGTCCGCTCGTCCCTTC§ACCGGCGATACGCTCCTGGTCT
......( ( ( ( (..........> ) ) ))...................(((-(((((.(<(((((.((((...))))...))))))).))))).)))----(<(((((...)))...))))..
......( ( ( ( (..........)))))...................((((((((((<(((----((((...))>)......))))))))))))))........(((...))).........
CGTaTATTTSaGTTGTTGCAGTTASaSAGCTCGTAGTTGaACCTTGGGaTGGG|cGGCCGGTCCGCC^TGGTGTGCS^GGTCGGCT(GTCCCTTCGG|cGGCGATACGCTCCTGGTCT Резуховидка Таля
Карельская береза
ccgttaacgaacgagacctcagcctg|taactagcta§gcggagg-atcccctccgcggccagcttcttagagggactätggccgcttaggccacggaagtttgffl.ggcaatäacaggtct
. ((( (----))>!...(<<<.......(((-.((((.(((((((С----I)))))))--.)))).-))))))).....( ((( (.....> ))) )..........................
. ({( (----) > ) >.........(((-((((-.((((.(<((((((----) I I)))))--.))))--)))).)) )----( ({( (.....)))))..........................
CCGTTAACGAACGAGACCTCAGCCTG|TAACTAGCTA§G§GGAGG§ATCCC|TCA-CGGCCGGCTTCTTAGiAGGGAC;TATGGCCG§TTAGGCCAAGGAAGTTTGffi.GGCAATAACAGGTCT Резуховидка Таля
Карельская береза
TIGGCGACcjGCAGTAGGGGCCTCGGCCCCCAGAGGCACGTGTCGTTGG§GaAGCCC^GCGGCGGACGAGCCGCGCGGGCGGCCTTGAAGTACAATT(cCACCGAGCGGCGGGTAGAAT
----((((-(((----( ( ( ((----)) ) ) ).....)))-..)))).-((((..(((<-((((((......О))))-)))))))).................( ( (.....>)).......
----(<(<<(<.....( ( ( (<----)))))--.))).....))))■-(((--■(((<(-■(((((----))>))--))>)).))).-■(<(----)))----( ( (.....))).......
ttgccgaccc§cagtaggagc|haggc§cccaaaggcacgtgtcgttggc§aagJccgHcggcggaagcg|cgHgggaccgccttgaa§ta§aattaccaccgagcggcgggtagaat Резухоьидка Таля
Рис. 6. Выравнивание и схематическое отображение вторичной структуры (формат Vienna) фрагментов последовательностей генов рДНК карельской березы и резуховидки Таля (нуклеотидные основания в местах
межвидовых различий дифференцированы по цвету)
Заключение
Изучение структурной организации генов 18S и 28S РНК B. pendula var. carelica показало, что она является сходной по строению с аналогичными генами грибных и растительных организмов. В ходе оценки генетической гетерогенности генов в пределах индивидуальных растений установлено, что, несмотря на общий высокий уровень консерватизма (pSNP<0.08%), нуклеотидные различия наблюдаются среди их копий. Нуклеотид-ные различия с генами рРНК B. pendula и B. platyphylla не выявлены, уровень генетической дифференциации применительно к Alnus spp. не превысил 0,6%. На сновании изучения модельной генетической системы B. pendula var. carelica — A. thaliana охарактеризованы особенности нуклеотидных различий генов 18S и 28S РНК между таксонами.
Исследование выполнено при поддержке гранта БРФФИ Б20М-060.
Список использованных источников
1. Ветчинникова, Л. В. Карельская береза и другие редкие представители рода Betula L. / Л. В. Ветчинникова. - М.: Наука, 2005. -269 с.
2. Буторина, А. К. О природе узорчатости древесины у карельской березы / А. К. Буторина // Генетические и экологические основы повышения продуктивности лесов: сборник научных трудов. Воронеж: НИИЛ-ГиС. - 1993. - С. 40-47.
3. Барсукова, Т. Л. Береза карельская в Белоруссии / Т. Л. Барсукова // Сельское хозяйство Белоруссии. - 1986. - № 8. - С. 38-45.
4. Коровин, В. В., Структурные аномалии стебля древесных растений - 2-е изд / В. В. Коровин, Л. Л. Новицкая, Г. А. Курносов. - М.: МГУЛ, 2003. - 280 с.
5. Ветчинникова, Л. В., Титов А. Ф., Кузнецова Т. Ю. Карельская береза: биологические особенности, динамика ресурсов и воспроизводство: монография / Институт леса КарНЦ РАН, Институт биологии КарНЦ РАН. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2013. - 312 с.
6. Ветчинникова, Л. В. Карельская береза: разновидность или самостоятельный вид? / Л. В. Ветчинникова, А. Ф. Титов // Изв. ву-
зов. Лесн. журн., 2020. - № 1. - С. 26-48. doi: 10.37482/0536-1036-2020-1-26-48.
7. Кирьянов, П. С. Молекулярно-генетиче-ские подходы к идентификации межвидовых и внутривидовых гибридов берез Восточно-Европейского региона / П. С. Кирьянов [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика, 2019. -Т. 26. - С. 45-55.
8. Hamby, R. K. Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics / R. K. Hamby, E. A. Zimmer // Molecular systematics of plants. Springer. - Boston, 1992. - P. 50-91.
9. Rogers, S. O. Ribosomal RNA genes in plants: variability in copy number and in the intergenic spacer / S.O. Rogers, A. J. Bendich // Plant Molecular Biology, 1987. - Vol. 9, № 5. -P. 509-520.
10. Schaal, B. A. Ribosomal DNA variation within and among plant populations / B. A. Schaal, G. H. Learn Jr. // Annals of the Missouri Botanical Garden, 1988. - Vol. 75, № 4. - P. 1207-1216.
11. Liao, D. Gene conversion drives within genic sequences: concerted evolution of ribosomal RNA genes in bacteria and archaea / D. Liao // Journal of Molecular Evolution, 2000. - Vol. 51, № 4. - P. 305-317.
12. Hillis, D. M. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference / D. M. Hillis, M. T. Dixon //The Quarterly review of biology, 1991. - Vol. 66, № 4. - P. 411-453.
13. Wendel, J. F. Phylogenetic incongruence: window into genome history and molecular evolution / J. F. Wendel, J. J. Doyle // Molecular systematics of plants, 1998. - Vol. 2. - P. 265-296.
14. Старобогатов, Я. И. Проблема видообразования / Я. И. Старобогатов. - Итоги науки и техники. Серия «Общая геология». - М.: ВИНИТИ, 1985. - 94 с.
15. Пугачев, О. П. Вид и видообразование. Анализ новых взглядов и тенденций / О. П. Пугачев. - Санкт-Петербург: Зоол. Инст. РАН, 2009. - 304 с.
16. Ellstrand, N. C. Distribution of spontaneous plant hybrids / N. C. Ellstrand, R. Whitkus, L. H. Rieseberg // Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996. - Vol. 93, № 10. -P. 5090-5093.
17. Davey, M. R. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives / M.R. Davey [et al.] //Biotechnology advances. - 2005. - Vol. 23, № 2. - P. 131-171.
18. Grosser, J. W. Observations and suggestions for improving somatic hybridization by plant protoplast isolation, fusion, and culture / J. W. Grosser // HortScience, 1994. - Vol. 29, № 11. - P. 1241-1242.
19. National center for biotechnology information [Electronic resource]. - Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov. - Date of access: 17.03.2020.
20. Баранов, О. Ю. Генетические механизмы коэволюции в системе «хозяин-паразит» (на примере древесных растений и фитопатоген-ных грибов лесных ценозов Беларуси): диссертация доктора биологических наук: 03.02.07 -генетика: защищена 21.12.2017, утверждена: 16.06.2018 - Гомель, 2017 - 332 c.
21. Searching for active mobile genetic elements in dsRNA fraction of Pinus sylves-tris having witches broom abnormalities // A. A. Pochtovyy [et al.] // Genomics Data, 2017 -Vol. 12. - P. 102-108.
22. Можаровская, Л. В. Структурно-функциональный анализ локусов, кодирующих антимикробные пептиды сосны обыкновенной / Л. В. Можаровская // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск: Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 2018. - Т. 25. - С. 83-91.
23. White, T. J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phy-logenetics / T. J. White [et al.] // PCR Protocols: A guide to methods and applications / ed.: M. A. In-nis [et al.]. - New York, 1990. - P. 315-322.
24. Ki, J.-S. Hypervariable regions (V1-V9) of the dinoflagellate 18S rRNA using a large dataset for marker considerations / J.-S. Ki // Journal of Applied Phycology, 2011. -Vol. 24, № 5. -P. 1035-1043.
25. Mankin, A. S. Identification of ten additional nucleotides in the primary structure of yeast 18S rRNA / A. S. Mankin, K. G. Skryabin, P. M. Rubtsov // Gene, 1986. - Vol. 44, № 1. -P. 143-145.
26. Kuzoff, R. K. The phylogenetic potential of entire 26S rDNA sequences in plants / R. K. Ku-
zoff ^t al.] //Molecular Biology and Evolution. -1998. - Vol. 15, № 3. - P. 251-263.
27. Muir, G. Three divergent rDNA clusters predate the species divergence in Quercus pe-traea (Matt.) Liebl. and Quercus robur L / G. Muir,
C. C. Fleming, C. Schlotterer // Molecular Biology and Evolution, 2001. - Vol. 18, № 2. -P. 112-119.
28. Хрусталев, В. В. Биохимические механизмы мутационного давления в методологии вычислительной биологии / В. В. Хру-сталев. - Мн.: М-во здравоохранения Респ. Беларусь, Белорус. гос. мед. ун-т, каф. общ. химии, 2010. - 211 c.
29. Taylor, J. H. Patterns and Mechanisms of Genetic recombination / J. H. Taylor // Molecular genetics / J. H. Taylor. - New York, 1967. -P. 95-136.
30. Which DNA marker for which purpose : final compendium of the research project / DGXII Biotechnology FW IV Research Programme ; ed. E. M. Gillet. - Frankfurt, 1999. - 253 p.
31. Sueoka, N. Directional mutation pressure and neutral molecular evolution / N. Sueoka // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol. 85, № 8. - P. 2653-2657.
32. Moore, G. P. The frequency of matching sequences in DNA / G. P. Moore, A. R. Moore, L. I. Grossman // J. Theor. Biol. - 1984. -Vol. 108, № 1. - P. 111-122.
33. Sinden, R. R. DNA structure, mutations, and human genetic disease / R. R. Sinden, R. D. Wells // Curr. Opin. Biotechnol. - 1992. -Vol. 3, № 6. - P. 612-622.
34. Futuyma, D. J. Evolutionary Biology /
D. J. Futuyma. - 3rd ed. - Sunderland : Sinauer Associates, 1998. - 751 p.
35. Chen, Z. D. Phylogeny and evolution of the Betulaceae as inferred from DNA sequences, morphology, and paleobotany / Z. D. Chen, S. R. Manchester, H. Y. Sun // American Journal of Botany, 1999. - Vol. 86, № 8. - P. 1168-1181.
36. Гупал, А. М., Гупал Н. А. Причины симметрии в ДНК / А. М. Гупал, Н. А. Гупал // Компьютерная математика, 2017. - № 2. -C. 85-91.
P. S. Kiryanov, O. Yu. Baranov
STRUCTURAL ORGANIZATION OF THE 18S AND 28S RIBOSOMAL
RNA GENES OF CURLY BIRCH
State Scientific Institution "Institute of Forest of the National Academy of Sciences of Belarus" 71, Proletarskaya St., 246050 Gomel, the Republic of Belarus e-mail: PKirjanov@yandex.ru
The article demonstrates the results of sequencing of the 18S and 28S ribosomal RNA genes of curly birch and their transcripts. It is shown that their organization and primary structure are similar to Betulaceae. A comparative analysis of multiple reads made it possible to identify nucleotide polymorphism among gene copies within the individual curly birch tree. In a comparative analysis of the primary structures of Betulapendula var. carelica andArabidopsis thaliana 18S and 28S ribosomal RNA genes, the features of nucleotide differences between taxa were characterized.
Keywords: ribosomal RNA genes, next-generation sequencing, curly birch, single-nucleotide polymorphism.
Дата поступления статьи: 11 мая 2020 г.
